一種白金針菇菌包工廠標準化生產配套新品種選育方法
【專利摘要】一種白金針菇菌包工廠標準化生產配套新品種選育方法。發明屬于食用菌栽培學【技術領域】，涉及怎樣在人工條件下培育白金針菇新品種的方法，通過收集國內栽培白金針菇菌株，通過菌株純化、拮抗試驗和分子生物學實驗對其進行親緣關系比較，并在此基礎上進行菌包工廠化生產發菌試驗，構建小型核心種質庫，對篩選出各方面優良的菌株進行原生質體融合雜交等實驗，篩選并最終選育出生產能力旺盛、生物轉化率高的新品種，并進行各級菌種培養和出菇實驗，優化新菌種的培養條件并對其進行生物學特征分析，為白金針菇的進一步推廣開發研究提供新的優質高產菌種。
【專利說明】一種白金針菇菌包工廠標準化生產配套新品種選育方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于食用菌栽培學【技術領域】，涉及怎樣在人工條件下培育白金針菇新品種 的方法。
【背景技術】
[0002] 金針燕學名毛柄金錢菌，又稱毛柄小火燕、構菌、樸燕、冬燕、樸菰、凍菌、金燕、智 力燕等，英文為：〃ENIKI MUSHROOM〃，學名為/?遞因其菌柄細長，似金 針菜，故稱金針菇，屬傘菌目白蘑科金針菇屬。
[0003] 金針菇在自然界廣為分布，中國、日本、俄羅斯、歐洲、北美洲、澳大利亞等地均有 分布。在中國北起黑龍江，南至云南，東起江蘇，西至新疆均適合金針菇的生長。金針菇不 含葉綠素，不具有光合作用，不能制造碳水化合物，完全可在黑暗環境中生長，必須從培養 基中吸收現成的有機物質，如碳水化合物、蛋白質和脂肪的降解物，為腐生營養型，是一種 異養生物，屬擔子菌類。金針菇是一種木材腐生菌，易生長在柳、榆、白楊樹等闊葉樹的枯樹 干及樹樁上。金針菇是秋冬與早春栽培的食用菌，以其菌蓋滑嫩、柄脆、營養豐富、味美適口 而著稱于世。據測定，金針菇氨基酸的含量非常豐富，高于一般菇類，尤其是賴氨酸的含量 特別高，賴氨酸具有促進兒童智力發育的功能。金針菇干品中含蛋白質8. 87%，碳水化合物 60. 2%，粗纖維達7. 4%，經常食用可防治潰瘍病。最近研究又表明，金針菇內所含的一種物質 具有很好的抗癌作用。金針菇既是一種美味食品，又是較好的保健食品，金針菇的國內外市 場日益廣闊。金針菇人工栽培技術并不復雜，只要能控制好環境條件，就容易獲得穩定可靠 的產量。在作為食材時，金針菇特別是涼拌菜和火鍋的上好食材，其營養豐富，清香撲鼻而 且味道鮮美，深受大眾的喜愛。
[0004] 雖然金針菇營養保健價值高，但國內對金針菇的研究起步較晚，尤其白金針菇菌 包工廠標準化生產優良品種選育和高產優質生產工藝的研究，更是近幾年才剛剛開始。有 關金針菇的研究上世紀末本世紀初才逐漸開始，且主要停留在對金針菇的野生馴化、生物 學特性及人工栽培技術等方面。近年來，我國和日本已對金針菇的人工馴化新品種進行了 研究，但由于對金針菇的生物學特性了解不夠完善，人工栽培子實體，生產周期長，產量 低，因而未得到全面開發，目前金針菇在日本和我國非常暢銷，而且價格較高。隨著人們對 金針菇食（藥）用價值認識的逐步深入，許多食品及藥品行業對其需求也越來越大，但受 現在金針菇新品種的影響，金針菇的種植利潤價值一直很高，因此有著廣闊的發展前景。
【發明內容】
[0005] -、試驗菌株資源收集與整理 菌種資源是新品種選育的基石，是資源創新利用的基礎。我們已經收集了國內外的人 工生產白金針菇菌株20種。已分別進行了菌株的來源、種類、生物學特征、分類地位、分子 標記（ITS序列信息）的材料檔案，并已建立了從白金針菇子實體分離和保存菌種的操作規 程和方法體系，保證了我們可以源源不斷地收集和提純復壯白金針菇。
[0006] 考慮國內金針菇菌株品種混亂，同種異名，異種同名現象普遍，我們采用常規的拮 抗實驗、分子生物學實驗進行排除。
[0007] 1.菌株菌絲形態觀察 選取菌株生長旺盛的菌株進行試驗。
[0008] 2.菌株保守性ERIC分子鑒定技術（圖1) 2. 1 PDA液體培養基。
[0009] 2. 2基因組總DNA提取采用2 X CTAB。
[0010] 取〇. 2g液氮研磨的真菌粉末，放入1. 5mL以滅菌的EP管，加入600uL已65°C預熱 的2 X CTAB提取液，再加入1. 2uL的巰基乙醇，充分混勻。65°C水浴45min，期間定期晃動混 勻。將EP管從水浴中拿出，室溫冷卻后，再在該EP管中加入600uL的氯仿：異戊醇（24:1)， 振蕩混勻5-10min。8000r/min離心lOmin，取上清。重復抽提兩次。加0. 8倍體積的冷的 異丙醇，混勻，-20°C放置15-30min。10000r/min離心8min去沉淀，70%乙醇清洗2次，風 干。加 100uLTE(pH8. 0)溶解。加入 2uLRNaseA(10mg/ml)，37°C溫箱中 30min。加等體積氯 仿：異戊醇（24 :1)，振蕩混勻，10000r/min離心lOmin取上清。加入2倍的冷的無水乙醇 和 1/10 的 3MNaAC，-20°C放置 15-30min。10000r/min 離心 lOmin。取沉淀，70% 乙醇清洗 2 次，風干，加20uLTE(pH8. 0)溶解，4°C保存。
[0011] 2.2 ERIC 分子鑒定 通過ERIC分子標記技術，剔除掉相互間異名同種的白金針菇菌菌株，保留下相互間有 差異的白金菇菌株。最后，白金針菇菌種資源來源，如下表所示： 表1白金針菇菌株來源 Table 1 Sources of Flammulina velutipes
【權利要求】
1. 種細胞質融合在白金針菇菌包工廠標準化生產中的育種技術，其特征在于該新品種 通過兩個菌株細胞質體融合成雜交合體。
2. 具體工藝步驟為： 供試菌株的菌絲體液體培養 原生質體的制備 原生質體的形成 原生質體的融合 融合的原生質體再生 融合子的篩選 優良融合子的鑒定 白金針菇菌包工廠標準化生產。
3. 根據權利要求1 一種細胞質融合在白金針燕菌包工廠標準化生產中的育種技術所 述，其步驟2特征在于包括：配制穩滲劑，并用針孔過濾器過濾除菌；將-20 °C冰箱中保存 的溶壁酶稱取〇. 05 g的溶壁酶至無菌5 ml的EP管中，并用過濾除菌的穩滲劑稀釋并加入 5 μ 1氯霉素溶液除菌，待用；去25 °C下培養5天的2個金針菇菌株菌絲體取出并用穩滲 劑清洗兩次；將清洗后的白金針菇菌絲體轉至盛有溶壁酶液的EP管中，并用封口膜封口， 劇烈震蕩使菌絲體破裂便于消化； 將EP管置于30°C的恒溫振蕩培養箱中消化，每半小時取0. 1 ml的酶液觀察并計數，直 至原生質體數量開始下降，最后一次計數的時間減去半小時即為最佳消化時間；將最佳消 化時間內消化的酶液用四層的擦鏡紙過濾兩次(注意過濾次數不宜過多，否則收集到的原 生質體數量將受到明顯影響)，離心收集菌體，并用穩滲劑調整菌體濃度至1X l〇7r/ml，計 算獲得的原生質體比例，三次計數取平均值。
4. 根據權利要求1 一種細胞質融合在白金針燕菌包工廠標準化生產中的育種技術所 述，其步驟3特征在于用不同的溶液作為滲透壓穩定劑，以蒸餾水作為對照，在相同條件 下，用溶壁酶進行作用，結果如表1所示。表1穩滲劑對原生質體得率的影響
經上表我們可以看出0. 6M的KC1溶液和MgS04溶液做穩滲劑效果較好，但在觀察中發 現利用MgS04溶液做穩滲劑得到的原生質體在4°C的冰箱中保存兩天后細胞破裂嚴重，所以 本實驗中采用KC1做穩滲劑。
5. 根據權利要求1 一種細胞質融合在白金針燕菌包工廠標準化生產中的育種技術所 述，其步驟5的特征在于與酵母菌等低等真菌不同，白金針菇屬于高等真菌，在進行原生質 體再生時的再生比例一般低于5%，因此取稀釋濃度為1000col/ml的原生質體懸濁液0. lml 進行復壁培養并進行五次計數取平均值，以降低因菌體未混勻帶來的偶然性。
6. 根據權利要求1 一種細胞質融合在白金針燕菌包工廠標準化生產中的育種技術 所述，其步驟8特征在于包括：拌料一打包一滅菌一接菌一:1?養（18 -20°C )-催雷（13- 15°C)-出菇(冷庫4-8°C)-采收一包裝一運輸銷售。
【文檔編號】C12N15/04GK104250644SQ201310221260
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2013年6月3日 優先權日:2013年6月3日
【發明者】蔡德華 申請人:魯東大學