一組用于淋病奈瑟氏菌實時熒光pcr檢測的引物和探針及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一組用于淋病奈瑟氏菌實時熒光PCR檢測的引物和探針，并具體公開了上游引物NG16s169F、下游引物NG16s235R和探針NG16s210P的核苷酸序列。本發明的用于淋病奈瑟氏菌實時熒光PCR檢測的引物和探針具有靈敏度高、特異性好、操作便捷等優點。
【專利說明】—組用于淋病奈瑟氏菌實時熒光PCR檢測的引物和探針及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學領域，具體地，涉及一組用于淋病奈瑟氏菌實時熒光PCR檢測的引物和探針及其應用。
【背景技術】
[0002]淋病奈瑟氏菌(Afci1S1SeriaNG)是常見的泌尿生殖系統傳播疾病病原體。淋病菌感染引起的臨床表現取決于感染的程度，機體的敏感性，細菌的毒力，感染的部位及感染時間的長短，同時和身體的健康狀況。其潛伏期短、傳染性強，最常見的是有癥狀的泌尿生殖系統的感染，如尿道炎、宮頸炎、附睪炎、前列腺炎、輸卵管炎等，如不及時治療，淋球菌可侵犯眼睛、眼部、皮膚、直腸、盆腔等部位，甚至可經血液傳播到全身其他部位，形成淋病性關節炎、腱鞘炎、腦膜炎、敗血癥等。同時還有5%-20%的男性和60%的女性病人呈現出無癥狀感染。因此，淋球菌的實驗室檢測對淋病的臨床輔助診斷具有重要作用。
[0003]常規檢測方法包括涂片檢查和培養法。雙球菌涂片主要針對有大量膿性分泌物的單純淋菌性前尿道炎患者檢測時陽性率在90%左右，但對于女性患者陽性率僅為50-60%且有假陽性。主要原因是女性宮頸分泌物中雜菌多，敏感性和特異性較差，因此世界衛生組織推薦用培養法檢查女病人。淋球菌培養是診斷的重要佐證，培養法對癥狀很輕或無癥狀的男性、女性病人都是較敏感的方法，特異性為100%，只要培養陽性就可確診。在基因診斷問世以前，培養是世界衛生組織推薦的篩選淋病的唯一方法。培養陽性率男性80-95%，女性80-90%。培養法的陽性率大于涂片法，后者對女性淋病尤其是無癥狀帶菌者檢出率較低，容易漏檢。由于約50%的女性淋病患者都沒有明顯癥狀，因此女性淋病的實驗室檢查主要依靠培養法。與男性淋病患者有過性接觸的女性，應每周做I次宮頸分泌物涂片和培養，連續3次，都是陰性者才能排除。
[0004]全世界每年約有600多萬人感染此病傳統的臨床檢測方法是使用細菌培養法，但是該方法操作難度大，耗時長，標本運送條件極為嚴格，并且還存著檢出率低的缺點，容易導致漏診誤診。此外，該方法還需侵入式的獲取樣本，對患者造成較大的痛苦。常規的PCR檢測方法可以避免這一問題，并已有一些利用核酸擴增的方法檢測淋病奈瑟氏菌的商業試劑盒，但是常規PCR存在靈敏度低、易污染等缺點，同時常規PCR專利已經失去保護，很難形成商品化試劑盒。
[0005]實時突光定量PCR (Fluorescence quantitative PCR)技術從常規PCR定性檢測邁上量化的臺階，它相對常規PCR技術先進、操作簡便、利用實時熒光定量PCR技術能夠實現實時監測、絕對定量和快速檢測的目的，同時具有具有靈敏度高、特異性好、操作便捷等優點，因此非常適合臨床檢測。
[0006]實時熒光定量PCR技術有很多分支，其定量方式也不同，主要分為熒光染料嵌入技術、熒光探針技術和自身淬滅熒光技術等。熒光染料嵌入技術是利用SYBR green I嵌A DNA雙鏈是熒光強度增加的特性，將熒光信號引入雙鏈DNA，該方法特異性較差，結果常受到引物二聚體的存在的干擾而導致假陽性等問題，因此不適合用于臨床，目前國內已有應用自身淬滅熒光技術檢測淋病奈瑟菌方法的專利，專利號為200510020234.3，然而該專利設計的引物針對于淋病奈瑟菌隱蔽性質粒(cppB基因GenBank登錄號L40552)為模板，近年研究表明cppB基因在一些淋病奈瑟菌株存在交叉反應以及靶序列在一些淋病奈瑟菌株中缺乏，因此Bruisten等認為cppB基因不宜作為淋病奈瑟氏菌擴增的靶基因。熒光探針技術如Taqman技術、分子信標技術等因為其特異性比熒光染料嵌入技術和自身淬滅熒光技術要好，因此更適合臨床使用。。
【發明內容】
[0007]本發明要解決的技術問題是克服現有的缺陷，提供了一組用于淋病奈瑟氏菌實時熒光PCR檢測的引物和探針，它具有靈敏度高、特異性好、操作便捷等優點。
[0008]為了解決上述技術問題，本發明提供了如下的技術方案:
一組用于淋病奈瑟氏菌實時熒光PCR檢測的引物和探針，所述引物和探針的核苷酸序列如下:
上游引物 NG16sl69F:5’ -GCTAATACCGCATACGTCTTGAGA-3’
下游引物 NG16s235R:5’ -GCTAATACCGCATACGTCTTGAGA-3’
探針 NG16s210P:5’ -FAM-TCGGGCCTTGCGCTATCCGA-TAMRA-3’
其中，所述探針NG16s210P中的FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團。
[0009]上述探針NG16s210P中的熒光報告基團FAM可替換為TET、J0E、HEX或VIC中的一種。
[0010]上述探針NG16S210P中的熒光淬滅基團TAMRA可替換為DABCYL或BHQ。
[0011]本發明的用于淋病奈瑟氏菌實時熒光PCR檢測的引物和探針在制備淋病奈瑟氏菌檢測試劑盒中的應用。
[0012]本發明還提出了一對用于擴增淋病奈瑟氏菌16s rRNA基因片段的引物，所述引物的核苷酸序列如下:
上游引物 NG16slllF:5’ -CGGGTGAGTAACATATCGGAAC-3’
下游引物 NG16s674R:5’ -CACCTCCCTCTGACACACTCG-3’。
[0013]上述用于擴增淋病奈瑟氏菌16s rRNA基因片段的引物在擴增淋病奈瑟氏菌16srRNA基因片段中的應用。
[0014]本發明具有以下有益效果:
本發明提供用于對淋病奈瑟氏菌進行定性、定量檢測的引物和探針，通過提取待檢測樣品中的DNA，再結合實時熒光定量PCR檢測技術，可達到準確定量待測標本中淋病奈瑟氏菌DNA含量的目的。本發明所提供的引物和探針可用于臨床及科研中對感染淋病奈瑟氏菌的患者攜帶的淋病奈瑟氏菌DNA進行定性、定量分析，對判斷淋病奈瑟氏菌感染的發生、治療效果評價以及病情的動態觀察具有重要意義，本發明在臨床醫學檢測領域發揮重要作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]附圖用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發明的實施例一起用于解釋本發明，并不構成對本發明的限制。在附圖中:
圖1是用于淋病奈瑟氏菌實時熒光PCR檢測的引物和探針體系優化實驗結果圖；
圖2是靈敏度實驗結果示意圖；
在圖 2 中，A3-A10 對應質粒濃度分別為 1.00X 108copies/ml、l.0OX 107copies/ml、1.00 X IO6Copies/ml、1.00 X IO5Copies/ml、1.00 X IO4Copies/ml、1.00 X IO3Copies/ml、1.00X 102copies/ml、陰性對照。
[0016]圖3是特異性實驗結果示意圖；
在圖3中，A2-A14分別為:金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、糞腸球菌、乙型溶血性鏈球菌、流感嗜血桿菌、奇異變形桿菌、福氏志賀菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏囷、腦I旲炎奈瑟囷、淋病奈瑟囷、陰性對照。
【具體實施方式】
[0017]本發明目的在于設計一組淋病奈瑟菌特異性引物和探針序列，建立一種能廣泛應用于臨床的快速、靈敏、特異性好的用熒光定量PCR檢測方法。本發明采用基因克隆技術，將淋病奈瑟氏菌16s rRNA基因片段插入到載體pMD18-T中，獲得含有16srRNA基因片段的重組質粒，以此作為標準品。根據淋病奈瑟氏菌16s rRNA的基因片段編碼基因序列設計并合成一組特異性引物和探針，優化PCR反應條件，建立以實時熒光定量聚合酶鏈反應為平臺的檢測方法，并對所建立的方法進行評估。
[0018]本發明通過以下技術方案予以實現:提供一對用于擴增淋病奈瑟氏菌(NG) 16srRNA保守片段序列的引物，稱 [0019]本發明所提供的外圍引物，其上游引物為5’ -CGGGTGAGTAACATATCGGAAC-3’，下游引物為5’-CACCTCCCTCTGACACACTCG-3’。采用該引物以淋病奈瑟氏菌標準菌為模板進行PCR擴增,擴增產物為564bp。
[0020]本發明還提供了用于對淋病奈瑟氏菌進行定量檢測的一組引物和探針，探針采用Taqman探針，上游引物為5’ -GCTAATACCGCATACGTCTTGAGA-3’，下游引物為5’ -GCTAATACCGCATACGTCTTGAGA-3’，
探針為 5’ -FAM-TCGGGCCTTGCGCTATCCGA-TAMRA-3’。
[0021]上述引物和探針的衍生序列也為本發明的保護范圍，所述衍生序列包括引物序列的互補鏈序列，同時還可以向5’端和3’方向延伸一至數個堿基或刪減一至數個堿基得到的序列。探針5’端的熒光報告基團是FAM，同時也可以標記其他的熒光報告基團如TET、JOE、HEX、VIC中的一種；3’端標記的是熒光淬滅基團TAMRA，也可為DABCYL或BHQ等。
[0022]本發明還提供了基于上述設計的引物和探針的一種檢測淋病奈瑟氏菌的實時熒光定量PCR試劑盒。本發明所提供的試劑盒包括用于淋病奈瑟氏菌進行定性、定量檢測的引物和探針。
[0023]以下將通過實驗具體說明:
下述實驗例中所用方法如無特殊說明均為常規方法，所用引物、探針和所用序列測定工作均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成和完成。
[0024]實驗一 16s rRNA基因標準品的制備
要建立實時熒光定量PCR方法，首先必須制備方法所需的外部標準品，標準品應包含高度保守、特異的序列，要保證反應的高特異性。本研究采用淋病奈瑟氏菌16s rRNA作為靶序列。本部分主要采用PCR技術擴增淋病奈瑟菌標準菌株16s rRNA基因，利用基因重組技術將其連接到質粒載體PMD18-T中，構建出重組質粒pMD18-T-NG16s，并進行相應的PCR鑒定和測序鑒定，最后經定量作為待建立方法的標準品，為下一步的方法及評估奠定基礎。
[0025]一、模板DNA的制備
提取淋病奈瑟氏菌(標準菌株ATCC49226，購自中國醫學細菌保藏管理中心)基因組DNA，用作16s rRNA基因PCR擴增的模板
吸取500 ill培養的淋病奈瑟氏菌菌液加入到1.5ml離心管中10000 rpm離心I分鐘，取上清，加入200 ill滅菌的TE buffer，震蕩懸浮，然后放入到沸水浴鍋中煮沸10分鐘后，迅速置于冰上放置5分鐘，10000 rpm離心3分鐘，轉移上清液至新的離心管中_20°C保存。
[0026]二、16s rRNA基因片段的PCR擴增 1、引物的設計與合成
本發明通過對NCBI數據庫中淋病奈瑟氏菌16s rRNA全序列進行生物信息學比對分析，選取適合設計引物和探針的保守片段序列為祀目標，應用Primer express 3軟件、Primer Premier 5軟件以及Oligo 7軟件，設計了一組實時熒光定量PCR引物和探針以及一組相關序列的外圍引物。
[0027]本發明選取的擴增序列(淋病奈瑟氏菌16s rRNA基因片段)如下(如序列表SEQID N0.1):
OaA^^XCGM*^^OMTA>:CTGC?ITCiCrCCTGC3vTAAA*jGC<'C'ACCAAGC?CGA?,'GATCACTAv::CfGGTvrCiAGA0<3AI<iAT€CGCCAC4CfG^ACTGA€ACAC6QCCC4GA':TCOdiAtG OOJk OOJkOTOO OOCiww a
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該外圍引物序列如下:
上游引物 NG16slllF:5’ -CGGGTGAGTAACATATCGGAAC-3’
下游引物 NG16s674R:5’ -CACCTCCCTCTGACACACTCG-3’
擴增片段大小為:564bp。
[0028]2、PCR反應體系和反應條件
以煮沸法得到的上清液為模板，以上述外圍引物NG16sl11F/NG16S674R為擴增引物，采用下述體系和反應條件進行PCR擴增。
[0029]PCR 體系:
【權利要求】
1.一組用于淋病奈瑟氏菌實時熒光PCR檢測的引物和探針，其特征在于，所述引物和探針的核苷酸序列如下:
上游引物 NG16sl69F:5’ -GCTAATACCGCATACGTCTTGAGA-3’
下游引物 NG16s235R:5’ -GCTAATACCGCATACGTCTTGAGA-3’
探針 NG16s210P:5’ -FAM-TCGGGCCTTGCGCTATCCGA-TAMRA-3’ 其中，所述探針NG16s210P中的FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團。
2.根據權利要求1所述的一組用于淋病奈瑟氏菌實時熒光PCR檢測的引物和探針，其特征在于，所述探針NG16s210P中的熒光報告基團FAM可替換為TET、JOE、HEX或VIC中的一種。
3.根據權利要求1或2所述的一組用于淋病奈瑟氏菌實時熒光PCR檢測的引物和探針，其特征在于，所述探針NG16s210P中的熒光淬滅基團TAMRA可替換為DABCYL或BHQ。
4.權利要求1-3任一項所述一組用于淋病奈瑟氏菌實時熒光PCR檢測的引物和探針在制備淋病奈瑟氏菌檢測試劑盒中的應用。
5.一對用于擴增淋病奈瑟氏菌16s rRNA基因片段的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下:
上游引物 NG16slllF:5’ -CGGGTGAGTAACATATCGGAAC-3’
下游引物 NG16s674R:5’ -CACCTCCCTCTGACACACTCG-3’。`
6.權利要求5所述用于擴增淋病奈瑟氏菌16srRNA基因片段的引物在擴增淋病奈瑟氏菌16s rRNA基因片段中的應用。
【文檔編號】C12R1/36GK103484534SQ201310243291
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年6月19日 優先權日:2013年6月19日
【發明者】車團結, 徐進章, 尤崇革, 黃超杰, 李琳 申請人:蘭州百源基因技術有限公司