乳酸鏈球菌的發酵工藝的制作方法
【專利摘要】本發明涉及高密度液體發酵乳酸鏈球菌的制備方法，并提供了后期處理工藝。本發明提供的乳酸鏈球菌發酵工藝采用菌種的活化、種子培養和發酵培養等步驟進行液體發酵培養。發酵工藝中使用的發酵培養基主要成分為豆粕粉、玉米粉、酵母膏和番茄汁等，原料廉價易得。利用該發酵培養基進行發酵培養時，乳酸鏈球菌生長穩定，發酵液活菌數≥140億/mL，大大高于預期值。本發明進一步對乳酸鏈球菌發酵液進行了后期包埋固定處理，該工藝簡便易行，通過包埋及凍干處理，得到高產量、高活性的乳酸鏈球菌菌劑。本發明有效解決了傳統乳酸鏈球菌發酵成本高、規模小和難長久保存等問題，實現了中試發酵水平上，低成本制備乳酸鏈球菌菌劑產品的目標。
【專利說明】乳酸鏈球菌的發酵工藝
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物發酵【技術領域】，具體地說，涉及乳酸鏈球菌的發酵工藝。
【背景技術】
[0002]乳酸菌是腸道益生菌，能夠促進動物生長，調節胃腸道菌群、維持微生態平衡，從而改善胃腸道功能；提高食物消化率和生物效價；抑制腸道內腐敗菌生長，提高機體免疫力等。1989年，研究者將乳酸菌作為微生態制劑添加到仔豬飼料中，發現乳酸菌可以預防消化道疾病，促進仔豬生長作用；1998年，SOTokulova研究發現飼喂益生菌可提高巨噬細胞活性，增強動物的免疫力。
[0003]隨著生物技術的發展，對微生態制劑的研究不斷深入。微生態制劑是通過益生菌或有益菌群的增殖來調整腸道微生態平衡，促進宿主健康。益生菌主要通過競爭抑制和營養助生長兩種方式，促進動物生長和防病治病。例如，益生菌群進入宿主動物腸道后，通過增強粘膜屏障，提高對腸道病原菌的抗性，在宿主腹瀉后恢復正常的腸道微生態環境；而有些益生菌能與有害菌群競爭營養物質和氧氣，競爭性的排斥有害菌，抑制其生長繁殖；另外一些益生菌可以產生乳酸、乙酸和丙酸等小分子有機酸，降低腸道pH值，改善生理生化環境。同時,益生菌群產生的溶菌酶、過氧化氫等抗菌物質能夠殺死外源病原菌。此外,益生菌群代謝產生的蛋白酶、淀粉酶、植酸酶等各種消化酶能幫助動物消化，增進食欲，并能夠促進機體對蛋白質、維生素、鈣、鋅、鐵的吸收，有效促進動物的生長。 [0004]目前可用于微生態制劑的微生物種類已有多種，主要包括乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌、放線菌、光合細菌等幾大類。其中，乳酸菌是一群相當龐雜的細菌，根據細胞呈球狀或呈桿狀，又分成乳酸桿菌族和鏈球菌族。近年來，主要側重于對鏈球菌族中乳酸菌的研究，應用范圍由傳統食品、乳制品工業發展到植物原料發酵食品以及新興的微生態制劑，為人類健康，農林牧副的發展，醫藥保健和環境保護作出了重要貢獻。
[0005]乳酸鏈球菌隸屬鏈球菌族，是一種專性厭氧菌，對營養條件要求高，由于乳酸鏈球菌大規模生產對發酵技術要求較高，以及后期處理工藝復雜，導致乳酸鏈球菌尚無法達到工業化生產。
【發明內容】
[0006]本發明針對目前無法對乳酸鏈球菌進行工業化生產的問題，提供一種中試規模的高密度液體發酵制備乳酸鏈球菌的方法。
[0007]為了實現本發明目的，本發明提供一種乳酸鏈球菌的發酵工藝，將乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)在改良MRS固體培養基上進行傳代培養，然后將活化后的乳酸鏈球菌接種到液體種子培養基中進行靜止培養，所得種子液按2~5%的接種量接種到發酵培養基中，經過擴大培養得到乳酸鏈球菌發酵液。
[0008]其中，所述發酵培養基的配方為:豆柏粉15~25g/L、玉米粉10~20g/L、蔗糖5~10g/L、蛋白胨5~10g/L、酵母膏3~5g/L、番茄汁50mL/L、磷酸二氫鉀2g/L、結晶硫酸鎂0.5g/L，pH值6.2~6.9 ;發酵培養條件為:30~35°C (優選30°C )，溶解氧0%，間歇式旋轉環境中培養20~45h。
[0009]所述改良MRS固體培養基的配方為:葡萄糖10~20g/L、蛋白胨10~15g/L、酵母膏5~7.5g/L、牛肉膏10~15g/L、磷酸二氫鉀0.2g/L、乙酸鈉2g/L、檸檬酸三胺2g/L、結晶硫酸鎂0.5g/L、瓊脂18g/L、水lOOOmL，pH值6.2~6.9 (優選pH值6.8)。所述傳代培養是指將乳酸鏈球菌菌株接種到改良MRS固體斜面培養基上，于30~35 V (優選30°C )培養3~5天。
[0010]所述液體種子培養基的配方為:豆柏粉15~25g/L、玉米粉10~20g/L、蔗糖5~10g/L、蛋白胨5~10g/L、酵母膏3~5g/L、牛肉膏3~5g/L、磷酸二氫鉀0.2~2g/L、乙酸鈉2~5g/L、檸檬酸三胺2g/L、結晶硫酸鎂0.5g/L、水lOOOmL，pH值6.2~6.9 (優選pH值
6.8);靜止培養的條件為:30~35°C (優選30°C )，每隔6h搖瓶一次，靜止培養18~24h。[0011]配制上述培養基中使用的豆柏粉、玉米粉的細度為80目。發酵培養基中添加的番茄汁，其制備方法為:番茄清洗后置于90~95°C水中5~lOmin，然后將番茄剝皮后榨汁，調pH值6.2~6.9，100~110°C滅菌10~15min，即得。
[0012]前述發酵工藝中，所述擴大培養是指進行三級發酵:將種子液按2~5%的接種量接種到100L發酵罐中進行發酵培養，發酵完成后，將該罐發酵液全部轉接入1000L發酵罐中，繼續發酵培養,完成后,將1000L罐中發酵液全部轉接入10000L發酵罐中進行發酵培養，得到發酵產物；其中，各發酵罐的裝液量為60~70%。
[0013]本發明中涉及的乳酸鏈球菌為中國農業微生物菌種保藏管理中心提供的編號ACCC10295 的菌株。
[0014]本發明還提供一種乳酸鏈球菌菌劑的制備方法，將按照上述發酵工藝制備的乳酸鏈球菌發酵液與保護劑混合，然后將所述混合物用海藻酸鈉溶液進行包埋處理，冷凍干燥后，即得乳酸鏈球菌菌劑。其中，所述保護劑為純度在99%以上的大豆粉。
[0015]前述制備方法中，將乳酸鏈球菌發酵液與滅菌后的大豆粉按1:3~6的重量比混合，以迅速吸附發酵液中的游離水。大豆粉的滅菌條件為:110°c，干熱滅菌0.5~lh。
[0016]前述制備方法中，所述包埋處理具體為:將所述混合物與3~5%的海藻酸鈉溶液按1:3~5的重量比混合均勻，然后進行冷凍干燥，待樣品呈疏松狀態取出。
[0017]本發明進一步提供按照上述方法制備的乳酸鏈球菌菌劑。
[0018]本發明涉及高密度液體發酵乳酸鏈球菌的制備方法，并提供了后期處理工藝。本發明提供的乳酸鏈球菌發酵工藝采用菌種的活化、種子培養和三級發酵培養等步驟進行液體發酵培養。發酵工藝中使用的發酵培養基主要成分為豆柏粉、玉米粉、酵母膏和番茄汁，其中豆柏粉、玉米粉、酵母膏為菌株的生長提供碳、氮源，而酵母膏、番茄汁可為菌株生長提供所需的氨基酸、維生素和生長因子。采用本發明提供的發酵培養基進行發酵培養時，乳酸鏈球菌生長穩定，發酵液活菌數> 140億/mL，大大高于預期值。本發明進一步對乳酸鏈球菌發酵液進行了后期包埋固定處理，該工藝簡便易行，旨在減少游離水，瞬間抑制乳酸鏈球菌的新陳代謝，將發酵液與保護劑按1:3~6的重量比充分混合，然后用載體(海藻酸鈉)進行包埋凍干處理，得到高產量、高活性的乳酸鏈球菌菌劑。
[0019]本發明具有以下優點:
[0020](一)本發明中使用的發酵培養基組成成分簡單，原料來源廣泛，價格低廉，如豆柏粉、玉米粉、番茄均可在市場采購，適合大規模工業化生產。
[0021](二）本發明提供的乳酸鏈球菌的發酵工藝，實現了在中試發酵水平上，低成本制備乳酸鏈球菌菌劑產品的目標。
[0022](三）本發明的乳酸鏈球菌發酵液后期處理工藝簡便易行，與其他益生菌的包埋處理相比,大大降低了生產成本。
[0023](四）本發明有效解決了乳酸鏈球菌發酵成本高，發酵工藝復雜，產品質量不穩定，保質期短等問題。
【具體實施方式】
[0024]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。[0025]以下實施例中使用的改良MRS固體培養基、液體種子培養基和發酵培養基的配方如下：
[0026]改良MRS固體培養基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸鈉2g/L、檸檬酸三胺2g/L、磷酸二氫鉀O. 2g/L、結晶硫酸鎂O. 5g/L、瓊脂18g/L、水1000mL, pH 值6. 8。
[0027]發酵培養基：豆柏粉20g/L、玉米粉10g/L、蔗糖5g/L、蛋白胨5g/L、酵母膏5g/L、番茄汁50mL/L、磷酸二氫鉀2g/L、結晶硫酸鎂O. 5g/L，pH值6. 8。
[0028]液體種子培養基：豆柏粉20g/L、玉米粉10g/L、蔗糖10g/L、蛋白胨5g/L、酵母膏3g/L、牛肉膏3g/L、乙酸鈉2g/L、檸檬酸三胺2g/L、磷酸二氫鉀2g/L、結晶硫酸鎂0. 5g/L、水1000mL, pH 值 6. 8。
[0029]實施例I乳酸鏈球菌的發酵工藝
[0030]將乳酸鏈球菌菌株（ACCC10295)經改良MRS固體斜面培養基傳代活化（35°C培養3~5天）至活力恢復后，挑取2環，接種到液體種子培養基中，35°C靜止培養18h左右（每隔6h搖瓶一次),作為種子液。按2%的接種量將種子液接種到盛有發酵培養基的100L發酵罐(發酵罐的裝液量為60%)中發酵培養40h。發酵條件為：pH值6. 2-6. 4，溫度35°C，溶氧量0%,轉速150r/min。
[0031]實驗設計：發酵結束后，用無菌三角瓶取200mL發酵液進行活菌數檢測，平行取樣3次，檢測采用平板菌落計數法，稀釋倍數為ΙΟ7、108、IO9共3個梯度，每個梯度設3個平行，取菌落數為30~300個的平板(平板直徑為90mm)計數，計算3個平板的平均值。
[0032]結果表明：乳酸鏈球菌在100L發酵罐中，生長狀態良好，活菌數(表1)達到預期值，表明乳酸鏈球菌可以按照該發酵工藝進行100L罐發酵生產。
[0033]表1乳酸鏈球菌100L發酵罐發酵結果
[0034]
【權利要求】
1.乳酸鏈球菌的發酵工藝，其特征在于，將乳酸鏈球菌(Streptococcuslactis)在改良MRS固體培養基上進行傳代培養，然后將活化后的乳酸鏈球菌接種到液體種子培養基中進行靜止培養，所得種子液按2~5%的接種量接種到發酵培養基中，經過擴大培養得到乳酸鏈球菌發酵液； 其中，所述發酵培養基的配方為:豆柏粉15~25g/L、玉米粉10~20g/L、蔗糖5~10g/L、蛋白胨5~10g/L、酵母膏3~5g/L、番茄汁50mL/L、磷酸二氫鉀2g/L、結晶硫酸鎂0.5g/L，pH值6.2~6.9 ;發酵培養條件為:30~35°C，溶解氧0%，間歇式旋轉環境中培養20 ~45h。
2.根據權利要求1所述的發酵工藝，其特征在于，所述改良MRS固體培養基的配方為:葡萄糖10~20g/L、蛋白胨10~15g/L、酵母膏5~7.5g/L、牛肉膏10~15g/L、磷酸二氫鉀0.2g/L、乙酸鈉2g/L、檸檬酸三胺2g/L、結晶硫酸鎂0.5g/L、瓊脂18g/L、水lOOOmL，pH值6.2~6.9 ;所述傳代培養是指將乳酸鏈球菌菌株接種到改良MRS固體斜面培養基上，于30~35°C培養3~5天。
3. 根據權利要求1所述的發酵工藝，其特征在于，所述液體種子培養基的配方為:豆柏粉15~25g/L、玉米粉10~20g/L、鹿糖5~10g/L、蛋白胨5~10g/L、酵母膏3~5g/L、牛肉膏3~5g/L、磷酸二氫鉀0.2~2g/L、乙酸鈉2~5g/L、檸檬酸三胺2g/L、結晶硫酸鎂0.5g/L、水lOOOmL，pH值6.2~6.9 ;靜止培養的條件為:30~35°C，每隔6h搖瓶一次，靜止培養18~24h。
4.根據權利要求1所述的發酵工藝，其特征在于，所述擴大培養是指進行三級發酵:將種子液按2~5%的接種量接種到100L發酵罐中進行發酵培養，發酵完成后,將該罐發酵液全部轉接入1000L發酵罐中，繼續發酵培養，完成后，將1000L罐中發酵液全部轉接入10000L發酵罐中進行發酵培養，得到發酵產物；其中，各發酵罐的裝液量為60~70%。
5.根據權利要求1所述的發酵工藝，其特征在于，所述發酵培養基中添加的番茄汁，其制備方法為:番茄清洗后置于90~95°C水中5~lOmin，然后將番茄剝皮后榨汁，調pH值6.2~6.9,100~IlCTC高壓蒸汽滅菌10~15min,即得。
6.根據權利要求1所述的發酵工藝，其特征在于，所述乳酸鏈球菌為ACCC10295。
7.乳酸鏈球菌菌劑的制備方法，將根據權利要求1-6任一項所述發酵工藝制備的乳酸鏈球菌發酵液與保護劑混合，然后將所述混合物用海藻酸鈉溶液進行包埋處理，冷凍干燥后，即得乳酸鏈球菌菌劑； 其中，所述保護劑為純度在99%以上的大豆粉。
8.根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于，將乳酸鏈球菌發酵液與滅菌后的大豆粉按1:3~6的重量比混合。
9.根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述包埋處理具體為:將所述混合物與3~5%的海藻酸鈉溶液按1:3~5的重量比混合。
10.根據權利要求7-9任一項所述方法制備的乳酸鏈球菌菌劑。
【文檔編號】C12R1/46GK103540541SQ201310297621
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年7月16日 優先權日:2013年7月16日
【發明者】豐來, 呂黎, 羅志威, 徐麗媛, 嚴征 申請人:湖南泰谷生物科技股份有限公司