一種試劑盒以及安氏隱孢子蟲的檢測方法
【專利摘要】本發明提供的試劑盒，包括LAMP引物、2×反應緩沖液、BstDNA聚合酶、熒光目視檢測試劑、超純水和安氏隱孢子蟲陽性模板，所述的LAMP引物包括外引物、內引物及環引物。安氏隱孢子蟲的檢測方法，其檢測步驟包括LAMP引物的設計與合成；LAMP反應體系的建立；LAMP擴增，判斷樣品中菌種的種類。本發明提供的試劑盒及檢測方法，按建立的體系加樣即可實時檢測安氏隱孢子蟲，方便基層快速、準確簡便的檢測安氏隱孢子蟲。
【專利說明】一種試劑盒以及安氏隱孢子蟲的檢測方法
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明涉及微生物檢測【技術領域】，具體涉及ー種安氏隱孢子蟲的檢測方法以及該方法所采用的試劑盒。
【背景技術】
[0003]隱孢子蟲(Cryptosporidium Tyzzer)是ー種危害嚴重的機會性致病人獸共患胃腸道原蟲，卵囊污染水源、食物等造成隱孢子蟲病暴發流行，宿主廣泛，可感染包括人在內的多種動物。在絕大部分地面水、受地面水污染的淺井和防護條件較差的深井水、處理不良的自來水、處理或未處理過的排放污水、經過濾的游泳池水中，均可檢出隱孢子蟲卵囊(沈玉娟等，2005)。安氏隱孢子蟲(Cryptosopridium andersoni)主要感染斷奶犢牛、育成牛和成年牛(Paul等，2009)，感染奶牛后可引起奶牛產奶量下降，體質變弱，是影響奶牛業發展的重要致病因素之一(任文陟等，2010)。
[0004]傳統檢測方法如糞便濃集、改良抗酸染色和免疫熒光染色法等檢測卵囊步驟繁瑣，敏感性低，許多干擾因素如酵母、飼料顆粒以及腸道內容物等均影響檢測效果(陳甫等，2006)。而目前使用最普遍的分子生物學檢測隱孢子蟲方法為Xiao等建立的Nest-PCR-RFLP(Xiao等，1999)，特點是通用性好，可檢測目前發現的所有隱孢子蟲種類，但需要兩輪PCR以及酶切鑒定的過程方能定種，耗時較長。鑒于安氏隱孢子蟲的危害性，急需建立ー種快速檢測方法。
[0005]Notomi等在2000年報道了一種新的DNA擴增技術-環介導等溫擴增(簡稱LAMP)技木，該技術具有方法簡單、快速、特異性強的特點，而且不需要PCR儀，肉眼可判斷結果及反應時間短等優點。該技術中所用到的LAMP方法檢測需1小時后加入染料才能判斷結果，反應中加入的突光染料syber-gr`een,需采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像，存在開蓋跑電泳觀察造成的氣溶膠污染，缺乏對反應的實時監控很難排除這些干擾因素，不能對檢測結果做出準確的判定，這已成為限制LAMP技術進ー步發展的一大難題。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供ー種為基層簡便、快捷準確地檢測安氏隱孢子蟲的方法，公開ー種安氏隱孢子蟲的檢測方法以及該方法所采用的試劑盒。
[0007]本發明提供的試劑盒，包括LAMP引物、2X反應緩沖液、Bst DNA聚合酶、熒光目視檢測試劑、超純水和預先處理的安氏隱孢子蟲陽性模板；所述的LAMP引物包括外引物、內引物及環引物；
所述的外引物是F3和B3 ；
所述的內引物是FIP和BIP ；
所述的環引物是LF和LB;其中引物的序列分別為:
F3 CAGGTTTTACATTTTCAGGGAA B3 CATACATTGCTGCCCAGA
FIP GCATGTTCCATTCTCCAATACAGTCAGTCTGATACTGCACCTCC
BIP GCAAGTAGATACTATATGCCCACCTTGGACATATTTTGTTTGCTGG
LF CCAGGAGGACATTCAGGGTT
LB GAGGAGGGAAATAGATGTGTCCAG ；
各組分的份量為:
F3100 μ 1
Β3100 μ 1
FIP100 μ 1
BIP100 μ 1
LF100 μ 1
LB100 μ 1
2X反應緩沖液12.5μ1
Bst DNA 聚合酶60 μ 1`` 熒光目視檢測試劑0.1ml
超純水1ml
安氏隱孢子蟲陽性模板 100 μ 1 ;
所述的 2Χ 反應緩沖液包括 Tris-HCL、KCL、MgS04、(NH4)2S04、Tween20、Betaine 和dNTPs ；2X反應緩沖液具體配制方法是將PH值為8.8的Tris-HCL 40mM、KCL 20mM、MgS0416mM、(NH4) 2S04 20mM、Tween20 0.2 %、Betaine 1.6M 和 dNTPs 2.8 mM 混合均勻。
[0008]以上所述的熒光目視檢測試劑采用鈣黃綠素熒光試劑，熒光試劑在反應前加入。
[0009]以上所述的安氏隱孢子蟲陽性模板預先處理步驟是取待檢牛的新鮮糞便20.0-50.0g，置滅菌燒杯充分攪勻，稱取攪拌后的糞便樣本18(T220mg于2ml離心管中，反復凍融3飛次，按糞便基因組DNA提取說明書提取。
[0010]本發明提供的安氏隱孢子蟲的檢測方法，含有以上所述的試劑盒，具體檢測步驟如下:
OLAMP引物的設計與合成；
2)LAMP反應體系的建立；
3)LAMP擴增，判斷樣品中菌種的種類。
[0011 ] 以上所述的LAMP反應體系以25 μ 1計:
2X反應緩沖液12.5μ1
F35pmol
B35pmol
FIP40pmol
BIP40pmol
LF20pmol
LB20pmol安氏隱孢子蟲陽性模板2μ1 超純水補足25 μ 1。
[0012]以上所述的判斷樣品菌株的方法采用特異性檢測、敏感性檢測和熒光可視化檢測。
[0013]本發明的實質性特點和進步是:
1)特異性強
使用本發明所設計的LAMP引物，結合本發明引物的試劑盒檢測安氏隱孢子蟲的特異性，檢測結果表明所檢測的陰性對照株均無陽性結果出來，與PCR檢測結果一致。
[0014]2)靈敏度高
用天根糞便基因組DNA試劑盒分別提取DNA后，結合本發明LAMP引物，進行環介導等溫擴增，得到細菌純培養物檢測限為2-3卵嚢/克糞，而普通PCR法細菌純培養物檢測限ー般為10卵囊/克糞，靈敏性比PCR方法得到明顯提高。
[0015]3)迅速得出結果
普通的PCR整個過程在24小時左右才能得出結果，現在普遍應用的LAMP方法也要在1小時左右得出結果，本發明提供的試劑盒所用的檢測方法，其反應在20-35min間出現擴增，便可獲得LAMP反應結果，反應迅速，結果可靠。
[0016]4)不造成污染
現有LAMP方法檢測熒光可視化檢測，用于觀察的熒光染料為反應后加入，加入的商用染料(非syber-green)，該方法存在開蓋跑氣溶膠，污染實驗室的危險；本發明使用的熒光染料為鈣黃緑素，熒光染料在反應前加入，檢測過程不需要開蓋，避免污染實驗室。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1是本發明LAMP檢測方法的特異性檢測結果；2株安氏隱孢子蟲反應管出現濁度的上升曲線，5株陰性對照菌反應管無擴增情況。
[0018]圖2是本發明LAMP檢測方法的敏感性檢測結果；LAMP法細菌純培養物均出現濁度的上升現象，檢測限為2卵囊/克糞。
[0019]圖3是本發明LAMP檢測方法的熒光可視化檢測結果，加入熒光染料后肉眼觀察結果；右管為以安氏隱孢子蟲為模板的反應情況，出現亮綠色的熒光；左管為陰性對照。
【具體實施方式】
[0020]本發明以安氏隱孢子蟲的C0WP基因作為檢測目標，C0WP基因序列設計合成引物。C0WP基因是安氏隱孢子蟲的卵囊壁基因序列，為在種屬間的變異率低的保守序列，因而可以作為通用性基因來監測安氏隱孢子蟲。本發明所用的試劑盒包，括LAMP引物、反應緩沖液、Bst DNA聚合酶、熒光目視檢測試劑、超純水和安氏隱孢子蟲陽性模板。
[0021]所述的LAMP引物包括外引物、內引物及環引物；
所述的外引物是F3和B3 ；
所述的內引物是FIP和BIP ；
所述的環引物是LF和LB;
其中引物的序列分別為:F3 CAGGTTTTACATTTTCAGGGAA B3 CATACATTGCTGCCCAGA
FIP GCATGTTCCATTCTCCAATACAGTCAGTCTGATACTGCACCTCC
BIP GCAAGTAGATACTATATGCCCACCTTGGACATATTTTGTTTGCTGG
LF CCAGGAGGACATTCAGGGTT
LB GAGGAGGGAAATAGATGTGTCCAG ；
各組分的份量為:
F3100 μ 1
Β3100 μ 1
FIP100 μ 1
BIP100 μ 1
LF100 μ 1
LB100 μ 1
2X反應緩沖液12.5μ1
Bst DNA 聚合酶60 μ 1
熒光目視檢測試劑0.1ml
超純水1ml
安氏隱孢子蟲陽性模板 100 μ 1 ;
所述的 2Χ 反應緩沖液包括 Tris-HCL、KCL、MgS04、(NH4)2S04、Tween20、Betaine 和dNTPs ；2X反應緩沖液具體配制方法是將PH值為8.8的Tris-HCL 40mM、KCL 20mM、MgS0416mM、(NH4) 2S04 20mM、Tween20 0.2 %、Betaine 1.6M 和 dNTPs 2.8 mM 混合均勻。
[0022]運用本發明試劑盒，具體檢測安氏隱孢子蟲的步驟如下:
1、材料的準備
安氏隱孢子蟲、球蟲由廣西壯族自治區獸醫研究所實驗室分離鑒定；牛泰勒氏蟲、牛巴貝斯蟲、伊氏錐蟲、食道ロ線蟲為廣西大學寄生蟲研究室李健老師惠贈。LAMP法DNA擴增試劑盒購自北京藍譜生物科技有限公司。
[0023]2、LAMP引物的設計與合成
根據GenBank中的安氏隱孢子蟲的C0WP基因序列，利用LAMP法引物輔助設計軟件PrimerExplorer V4軟件設計一套LAMP引物，其中F3/B3為外引物，FIP/BIP為內引物，LF/LB為環引物；
F3 CAGGTTTTACATTTTCAGGGAA B3 CATACATTGCTGCCCAGA
FIP GCATGTTCCATTCTCCAATACAGTCAGTCTGATACTGCACCTCC
BIP GCAAGTAGATACTATATGCCCACCTTGGACATATTTTGTTTGCTGG
LF CCAGGAGGACATTCAGGGTT
LB GAGGAGGGAAATAGATGTGTCCAG?
[0024]3、陽極模板前處理
取待檢牛的新鮮糞便20.0-50.0g，置滅菌燒杯充分攪勻，稱取攪拌后的糞便樣本18(T220mg于2ml離心管中，反復凍融3飛次，按糞便基因組DNA提取說明書提取，提取的是安氏隱孢子蟲模板為陽極模板。
[0025]4、LAMP反應體系建立
按照試劑盒說明書，按25 μ 1體系配置:
2X反應緩沖液12.5μ1
F35pmol
B35pmol
FIP40pmol
BIP40pmol
LF20pmol
LB20pmol
安氏隱孢子蟲陽性模板2μ1
超純水補足25 μ 1
LAMP反應在實時濁度儀(LA-320C，日本榮研公司)進行密閉全程監控的形式監測本方法的檢出情況，反應溫度以試劑盒推薦的63°C做為反應溫度。
[0026]5、LAMP檢測方法 1)特異性檢測
分別提取2株安氏隱孢子蟲、牛泰勒氏蟲、牛巴貝斯蟲、伊氏錐蟲、食道ロ線蟲和球蟲DNA,進行LAMP擴增，檢驗LAMP方法的特異性，實時監測試驗進程進行結果判定。
[0027]2)敏感性檢測
測定敏感度時，將經過計數的隱孢子蟲卵囊加入牛糞中，濃度分別為2X105、2X104、2X 103、2X 102、2X 10\0個卵囊/g糞，用天根糞便基因組DNA試劑盒分別提取DNA后，進行擴增。
[0028]3)熒光可視化檢測
根據實時濁度儀監控優化的條件，加入熒光染料，熒光染料在反應前加入，加入的染料為鈣黃緑素商用染料，63°C下反應25分鐘后，在紫外燈下觀察，不采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像，避免開蓋跑電泳觀察造成的氣溶膠污染。
[0029]實施例1 LAMP檢測方法的特異性結果
對2株安氏隱孢子蟲、牛泰勒氏蟲、牛巴貝斯蟲、伊氏錐蟲、食道ロ線蟲和球蟲DNA應用試劑盒進行LAMP擴增，結果如圖1所示，2株安氏隱孢子蟲反應管在25分鐘左右出現濁度的上升曲線，為陽性結果，5株陰性對照反應管曲線均無擴增情況出現，LAMP呈陰性結果。
[0030]實施例2 LAMP檢測方法的敏感性結果
將經過計數的隱孢子蟲卵囊加入牛糞中，濃度分別為2X105、2X104、2X103、2X102、2X10\0個卵囊/g糞，結合試劑盒進行LAMP擴增，結果如圖2所示，從圖中看出，LAMP法細菌純培養物檢測限約為2卵囊/g糞，而PCR法細菌純培養物檢測限一般為10卵囊/g糞數量級。
[0031]實施例3 LAMP檢測方法的熒光`可視化檢測結果
根據濁度儀監控優化的條件，加入熒光染料，63°C反應30分鐘后，在紫外燈下觀察，圖3為觀察結果，右管為以安氏隱孢子蟲為模板的反應情況，左管為陰性對照，表明建立的方法可以方便基層使用，只需使用試劑盒配合本方法設計的LAMP引物，加入樣品后，用低廉的水浴鍋來保持63℃ 30分鐘，即可快速觀察結果，且無需開蓋，避免了污染。
【權利要求】
1.ー種試劑盒，其特征在于:包括LAMP引物、2X反應緩沖液、Bst DNA聚合酶、熒光目視檢測試劑、超純水和預先處理的安氏隱孢子蟲陽性模板，所述的LAMP引物包括外引物、內引物及環引物； 所述的外引物是F3和B3 ； 所述的內引物是FIP和BIP ； 所述的環引物是LF和LB; 其中引物的序列分別為: F3 CAGGTTTTACATTTTCAGGGAA B3 CATACATTGCTGCCCAGA
FIP GCATGTTCCATTCTCCAATACAGTCAGTCTGATACTGCACCTCC
BIP GCAAGTAGATACTATATGCCCACCTTGGACATATTTTGTTTGCTGG
LF CCAGGAGGACATTCAGGGTT
LB GAGGAGGGAAATAGATGTGTCCAG ； 各組分的份量為: F3100 μ 1 Β3100 μ 1 FIP100 μ 1 BIP100 μ 1 LF100 μ 1 LB100 μ 1 2X反應緩沖液12.5μ1 Bst DNA 聚合酶60 μ 1 熒光目視檢測試劑0.1ml超純水1ml 安氏隱孢子蟲陽性模板 100 μ 1 ; 所述的 2Χ 反應緩沖液包括 Tris-HCL、KCL、MgS04、(NH4)2S04、Tween20、Betaine 和dNTPs。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的熒光目視檢測試劑采用鈣黃綠素熒光試劑，熒光試劑在反應前加入。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的安氏隱孢子蟲陽性模板預先處理步驟是取待檢牛的新鮮糞便20.0-50.0g，置滅菌燒杯充分攪勻，稱取攪拌后的糞便樣本18(T220mg于2ml離心管中，反復凍融3飛次，按糞便基因組DNA提取說明書提取。
4.安氏隱孢子蟲的檢測方法，其特征在于:使用權利要求1所述的試劑盒，具體檢測步驟如下: 1)LAMP引物的設計與合成； 2)LAMP反應體系的建立； 3)LAMP擴增，判斷樣品中菌種的種類。
5.根據權利要求4所述安氏隱孢子蟲的檢測方法，其特征在于:所述的LAMP反應體系以25 μ 1計:2X反應緩沖液12.5μ1F35pmolB35pmolFIP40pmolBIP40pmolLF20pmolLB20pmol 安氏隱孢子蟲陽性模板2μ1超純水補足25 μ 1。
6.根據權利要求5所述安氏隱孢子蟲的檢測方法，其特征在于:所述的判斷樣品菌株的方法采用特異性檢測、敏感性檢測和熒光可視化檢測。
【文檔編號】C12Q1/68GK103451278SQ201310301656
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年7月17日 優先權日:2013年7月17日
【發明者】李軍, 彭昊, 陶立, 謝永平, 韋志鋒, 秦若甫, 蘭美益, 潘艷, 禤雄標, 胡帥, 謝宇舟, 馬春霞, 楊威, 陳澤祥 申請人:廣西壯族自治區獸醫研究所