作為昆蟲防治劑的dsRNA的制作方法

作為昆蟲防治劑的dsRNA的制作方法
【專利摘要】本發明涉及通過RNAi介導的基因沉默來防治害蟲侵害的方法，其通過將完好的昆蟲細胞與該昆蟲細胞外部的雙鏈RNA接觸以及通過所述雙鏈RNA被所述完好的昆蟲細胞攝取來實現。在一個具體的實施方案中，本發明的方法用于減輕昆蟲害蟲對植物的侵害。作為替代地，所述方法用于向有此處理和/或防止需要的基層或對象進行處理和/或防止昆蟲侵害。公開了適當的昆蟲靶基因及其片段、dsRNA構建體、重組構建體和組合物。
【專利說明】作為昆蟲防治劑的dsRNA
[0001] 本申請是中國專利申請200780002294. X的分案，后者是2007年1月12日提交的 PCT申請PCT/EP2007/000287于2008年7月11日進入中國國家階段的申請。

【技術領域】
[0002] 本發明涉及在昆蟲物種中雙鏈RNA(dsRNA)介導基因沉默的領域。更具體地，本發 明涉及設計用于表達對應于新靶基因的dsRNA的遺傳構建體。這些構建體在RNAi介導的 害蟲防治中尤其有用。本發明還涉及用于防治昆蟲的方法、用于防止昆蟲侵害的方法以及 使用RNAi下調昆蟲中基因表達的方法。

【背景技術】
[0003] 昆蟲及其它害蟲可通過其叮咬或螫刺而導致損傷甚至死亡。而且，許多害蟲傳播 導致疾病的細菌及其它病原體。例如，蚊子傳播導致瘧疾、黃熱病、腦炎和另一些疾病的病 原體。腺鼠疫（或黑死病）由感染大鼠和另一些嚙齒動物的細菌所引起。用于防治微觀害 蟲侵害的組合物已經以抗生素、抗病毒和抗真菌的組合物的形式提供。用于防治害蟲（如 線蟲和昆蟲）侵害的方法通常采用化學組合物的形式，將所述化學組合物應用于害蟲停留 的表面上，或者以丸劑、粉劑、片劑、糊劑或膠囊劑的形式施用于被侵擾動物。
[0004] 重要農作物的昆蟲害蟲防治是非常重要的領域，例如破壞茄科植物的昆蟲害蟲， 尤其是鞘翅目害蟲的防治，所述爺科植物尤指馬鈴薯（Solanum tuberosum),以及番爺 (Solanum lycopersicum)、爺子（Solanum melongena)、辣椒（Solanum capsicum)和爺屬植 物（例如，Solanum aculeastrum、S. bulbocastanum( -種野生馬鈴薯）、S. cardiophyllum、 S. douglasii、歐白英（S. dulcamara)、S. lanceolatum、S. robustum 和 S. triquetrum) 〇
[0005] 在過去的幾十年中，用于防治植物中昆蟲侵害的更有效方法和組合物的開發已取 得顯著進展。化學殺蟲劑在根除害蟲侵害中已非常有效。
[0006] 使用印楝籽提取物進行生物防治已顯示出對植物鞘翅目害蟲有作用。基于印楝的 市售殺蟲劑將印楝素作為主要的活性成分。這些殺蟲劑適用于廣譜的昆蟲。它們作為昆蟲 生長調節劑；印楝素通過抑制一種昆蟲激素（蛻皮素）的產生而阻止昆蟲蛻皮。
[0007] 使用來自蘇云金芽孢桿菌粉蟲變種（Bacillus thuringiensis varieties tenebrionis)和圣地亞哥變種（varieties san diego)的Cry3A蛋白以及衍生的殺蟲蛋白 進行生物防治是化學防治的可替代方法。所述Bt(Bacillus thuringiensis)毒素蛋白對 于防治馬鈴薯葉甲幼蟲是有效的，該毒素蛋白或者作為在植物上噴灑的制劑或者在馬鈴薯 的葉中表達。
[0008] -種可替代的生物制劑是dsRNA。在過去的幾年里，借助RNA干擾或"RNAi "下調 多細胞生物中的基因（也稱為"基因沉默"）已成為成熟的技術。
[0009] RNA干擾或"RNAi"是序列特異性下調基因表達的方法（也稱為"基因沉默"或"RNA 介導的基因沉默"），其由序列與待下調靶基因區域互補的雙鏈RNA (dsRNA)起始（Fire， A.Trends Genet. Vol. 15, 358-363,1999 ；Sharp,P. A. Genes Dev. Vol. 15,485-490,2001)〇
[0010] 在過去的幾年里，借助RNA干擾（RNAi)下調多細胞生物的靶基因已成為成熟的技 術。可參考國際申請W099/32619(卡內基學院）和W000/01846(本 申請人:）。
[0011] dsRNA基因沉默應用于許多不同的領域中，例如在臨床應用（W02004/001013)和 植物中dsRNA介導的基因沉默。在植物中，還已將用于基因沉默的dsRNA構建體設計成可 被切割及加工成小干擾RNA(siRNA)。
[0012] 盡管本領域已普遍了解植物、秀麗隱桿線蟲（C. elegans)和哺乳動物細胞中 的RNAi技術若干年，然而對于使用RNAi下調昆蟲中基因表達迄今幾乎是未知的。自從 W000/01846和W099/32619申請的提交和公布以來，僅有少量涉及使用RNAi保護植物免受 昆蟲侵害的其它申請被公布。這些包括國際申請W001/37654(DNA Plant Technologies)、 W02005/019408 (Bar Ilan 大學）、W02005/049841 (CSIR0, Bayer Cropscience)、 W005/047300(猶他大學研究基金會）和美國申請2003/00150017 (Mesa等）。本發明提供 了用于RNAi介導的昆蟲害蟲防治的靶基因和構建體。相應地，本發明提供了通過抑制、延 遲或降低特定害蟲中靶基因的表達來防治害蟲侵害的方法和組合物。


【發明內容】

[0013] 本發明描述了用于防治作物昆蟲害蟲的不基于化合物、不基于蛋白質的新方法。 其活性成分是核酸（雙鏈RNA (dsRNA))，所述核酸可用作殺蟲制劑（例如，作為葉的噴霧 劑）。所述dsRNA的序列對應于昆蟲必需基因的部分或全部，并通過RNA干擾（RNAi)導致 昆蟲靶標的下調。由于mRNA的下調，所述dsRNA阻止昆蟲靶蛋白的表達，并因此導致昆蟲 死亡、生長停滯或不育。
[0014] 本發明的方法可實際應用在需要抑制昆蟲的生存、生長、發育或繁殖或者降低昆 蟲的致病性或感染性的任何【技術領域】。本發明的方法還實際應用于需要特異性下調昆蟲中 一種或多種靶基因表達的情形。特別有用的實際應用包括但不限于：（1)保護植物免受昆 蟲害蟲侵害；(2)在人和動物中的藥物或獸醫用途（例如，控制、治療或預防人和動物中的 昆蟲感染）；(3)保護物品免遭昆蟲破壞；(4)保護易腐的物品（如食品、種子等）免遭昆蟲 破壞；以及通常需要防治昆蟲和/或需要防止昆蟲引起破壞的任何應用。
[0015] 根據一個實施方案，本發明涉及控制細胞或生物上昆蟲生長的方法，或者防止昆 蟲侵害對昆蟲感染敏感的細胞或生物的方法，其包括將昆蟲與雙鏈RNA接觸，其中所述雙 鏈RNA包含退火的互補鏈，其中一條退火互補鏈包含與昆蟲靶基因核苷酸序列之至少一部 分互補的核苷酸序列，該雙鏈RNA被昆蟲攝取并因此控制生長或防止侵害。
[0016] 因此，本發明提供了分離的新的昆蟲靶基因核苷酸序列，所述分離的核苷酸序列 包含選自以下的至少一種核酸序列：
[0017] (i)如下表示的任意序列：SEQ ID N01，3,5,7,9，ll，13，15，17，19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,240 至 247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,508 至 513， 515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767， 768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888， 890,892,894,896,908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075， 1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105， 1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612， 1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684， 1686.1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050， 2055, 2060, 2065, 2070,2075, 2080, 2085, 2090, 2095,2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 或 2460, 2461，2466， 2471，2476, 2481或2486,或其互補序列，
[0018] (ii)與如下表示的任意序列具有至少70%，優選至少75%、80%、85%、90%，更 優選至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列：
[0019] SEQ ID N01，3,5,7,9,11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173， 178.183.188.193.198.203.208.215.220.225.230.240 至 247,249,251，253,255,257， 259,275至 472,473,478,483,488,493,498,503,508至 513,515,517,519,521，533至 575， 576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793， 795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040， 1041，1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087， 1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571， 1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642， 1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696， 1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080， 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359， 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476, 2481 或 2486,或其互補 序列，以及
[0020] (iii)包含如下表示的任意序列之至少17個連續核苷酸的序列：
[0021] SEQ ID N01，3,5,7,9,11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173， 178.183.188.193.198.203.208.215.220.225.230.240 至 247,249,251，253,255,257， 259,275至 472,473,478,483,488,493,498,503,508至513,515,517,519,521，533至575， 576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793， 795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040， 1041，1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087， 1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571， 1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642， 1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696， 1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080， 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359， 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476, 2481 或 2486,或其互補 序列，或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17個連續核苷酸的基因 的直系同源物：SEQ ID N049 至 158、275 至 472、533 至 575、621 至 767、813 至 862、908 至 1040U161至1571、1730至2039、2120至2338、2384至2460，或其互補序列，所述核酸序列 可用于制備本發明的用于控制昆蟲生長的雙鏈RNA。
[0022] 本發明使用的"防治害蟲"意指殺死害蟲，或阻止害蟲發育或生長，或防止害蟲感 染或侵害。本文使用的防治害蟲還包括控制害蟲的后代（卵的發育）。本文使用的害蟲防 治還包括抑制昆蟲的生存、生長、發育或繁殖，或降低昆蟲的致病性或感染性。本文所述的 化合物和/或組合物可用于維持生物健康，并可以治療性、預防性或全身性地使用來防治 害蟲或者阻止昆蟲生長或發育或者感染或侵害。
[0023] 本發明涉及的特定害蟲是昆蟲害蟲。因此，本文使用的"防治昆蟲"還包括控制昆 蟲的后代（例如昆蟲害蟲的卵的發育）。本文使用的防治昆蟲還包括抑制昆蟲的生存、生 長、發育或繁殖，或者降低昆蟲的致病性或感染性。在本發明中，防治昆蟲可以抑制昆蟲中 的生物活性，其導致一種或多種以下特征：昆蟲進食減少，昆蟲生存力降低，昆蟲死亡，抑制 昆蟲的分化和發育，以下的缺失或能力下降：昆蟲有性繁殖、肌肉形成、保幼激素形成、保幼 激素功能調節、離子調節和轉運、細胞膜電勢的維持、氨基酸的生物合成、氨基酸降解、精子 形成、信息素合成、信息素的感知、觸角形成、翅的形成、足的形成、發育和分化、卵的形成、 幼蟲的成熟、消化酶的形成、血淋巴的合成、血淋巴的維持、神經傳遞、細胞分裂、能量代謝、 呼吸、凋亡以及真核細胞的細胞骨架結構（如肌動蛋白和微管蛋白）的任何組分。本文所 述的化合物和/或組合物可用于維持生物健康，并可以治療性、預防性或全身性地使用來 防治昆蟲，或阻止害蟲生長或發育或者感染或侵害。因此，本發明可以使先前的敏感生物對 昆蟲侵害產生抗性。
[0024] 本文使用的表述"與……的至少一部分互補"是指所述核苷酸序列與靶標的核苷 酸序列在超過兩個核苷酸的長度上，例如超過至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更 多個連續核苷酸的長度上完全互補。
[0025] 根據又一實施方案，本發明涉及用于下調昆蟲中靶基因表達的方法，其包括將所 述昆蟲與雙鏈RNA接觸，其中所述雙鏈RNA包含退火的互補鏈，其中一條退火互補鏈包含與 待下調昆蟲靶基因核苷酸序列之至少一部分互補的核苷酸序列，其中所述雙鏈RNA被昆蟲 攝取并因此下調昆蟲靶基因的表達。
[0026] 在無數量詞修飾時，"靶基因"是指"至少一種"靶基因。同樣地，靶生物是指"至 少一種"靶生物，RNA分子或宿主細胞是指"至少一種"RNA分子或宿主細胞。這在后面還有 詳述。
[0027] 根據一個實施方案，本發明的方法依賴于昆蟲攝取其外部的雙鏈RNA(例如，通過 進食），而不需要在昆蟲細胞中表達雙鏈RNA。另外，本發明還包括如上所述的方法，其中所 述昆蟲與包含該雙鏈RNA的組合物接觸。
[0028] 可通過原核的（例如但不限于細菌）或真核的（例如但不限于酵母）宿主細胞或 宿主生物來表達所述雙鏈RNA。
[0029] 所述昆蟲可以是任何昆蟲，意指屬于動物界、特別是節肢動物門、尤其是昆蟲綱或 蛛形綱的任何生物。本發明的方法適用于對利用RNA干擾進行的基因沉默敏感的所有昆 蟲，以及能夠從其鄰近環境將雙鏈RNA內化的所有昆蟲。本發明還適用于處于其任何發育 階段的昆蟲。因為昆蟲具有無生命的外骨骼，所以它們不能以均一的速率生長，而是通過周 期性蛻落其外骨骼進行分階段生長。該過程稱作"蛻皮"。蛻皮之間的階段稱作"齡"，而這 些階段可以作為本發明的靶標。同時，昆蟲的卵或活的幼蟲也可作為本發明的靶標。發育 周期中的所有階段（包括有翅昆蟲中的變態）均可以作為本發明的靶標。因此，單個階段 (如幼蟲、蛹、若蟲等發育階段）均可以作為靶標。
[0030] 在本發明的一個實施方案中，所述昆蟲可以屬于以下的目：蜱螨目、蜘蛛目、虱目、 鞘翅目、彈尾目、革翅目、網翅目、雙尾目、雙翅目、紡足目、蜉蝣目、蛩蠊目、半翅目、同翅目、 膜翅目、等翅目、鱗翅目、食毛目、長翅目、脈翅目、蜻蜓目、直翅目、竹節蟲目、櫝翅目、原尾 目、嚙蟲目、蚤目、虱目、纓尾目、捻翅目、纓翅目、毛翅目和缺翅目。
[0031] 在本發明優選的非限制性實施方案和方法中，所述昆蟲選自：
[0032] (1)植物昆蟲害蟲，例如但不限于褐飛風屬物種（Nilaparvata spp.))(例如，褐 飛風（N.lugens))、灰飛風屬物種（Laodelphax spp.)(例如，灰飛風（L.striatellus))、 黑尾葉蝶屬物種（Nephotettix spp.)(例如，二點黑尾葉蝶（N. virescens)，或黑尾葉 蝶（N.cincticeps)，或二條黑尾葉蝶（N.nigropictus))、白背飛風屬物種（Sogatella spp.)(例如，白背飛風（S. furcifera))、桿長蝽屬物種（Blissus spp.)(例如，美洲谷桿 長蝽（B.leucopterus leucopterus))、黑蝽屬物種（Scotinophora spp.)(例如，稻黑蝽 (S. vermidulate))、綠蝽屬物種（Acrosternum spp.)(例如，擬綠蝽（A. hilare))、稻弄蝶 屬物種（Parnara spp.)(例如，直紋稻弄蝶（P. guttata))、禾草螟屬物種（Chilo spp.)(例 如，二化螟（C.suppressalis)、臺灣稻螟（C.auricilius)或稻多麗螟（C.polychrysus))、 禾草螟屬物種（Chilotraea spp.)(例如，稻桿螟（C. polychrysa))ji^夜蛾屬物種 (Sesamia spp.)(例如，稻駐莖夜蛾（S.inferens))、駐禾螟屬物種（Tryporyza spp.)(例 如，白稻螟（T. innotata)或三化螟（T. incertulas))、縱卷葉野螟屬物種（Cnaphalocrocis spp.)(例如，稻縱卷葉野螟（C. medinalis))、潛蠅屬物種（Agromyza spp.)(例如，日本 稻潛蠅（A.oryzae)或玉米斑潛蠅（A.parvicornis))、桿草螟屬物種（Diatraea spp.) (例如，小鹿螟（D.saccharalis)或西南玉米桿草螟（D.grandiosella))、Narnaga屬 物種（例如，綠稻毛蟲（N. aenescens))、黃夜蛾屬物種（Xanthodes spp.)(例如，犁 紋黃夜蛾（X. transversa))、灰翅夜蛾屬物種（Spodoptera spp.)(例如，草地貪夜蛾 (S. frugiperda)、甜菜夜蛾（S. exigua)、海灰翅夜蛾（S. littoralis)或西部黃條夜蛾 (S. praefica))、秘夜蛾屬物種（Mythimna spp.)(例如，粘蟲（Mythmna(Pseudaletia) seperata))、鈴夜蛾屬物種（Helicoverpa spp.)(例如，谷實夜蛾（H.zea))、Colaspis 屬 物種（Colaspis spp.)(例如，葡萄肖葉甲（C.brunnea)、稻水象屬物種（Lissorhoptrus spp.)(例如，稻水象甲（L.oryzophilus))、稻象屬物種（Echinocnemus spp.)(例如，稻象 (E.squamos))、稻鐵甲屬物種（Diclodispa spp.)(例如，水稻鐵甲（D.armigera))、禾谷 負泥蟲屬物種（Oulema spp.)(例如，水稻負泥蟲（O.oryzae))、米象屬物種（Sitophilus spp.)(例如，米象（S. oryzae))、Pachydiplosis 屬物種（例如，稻癭蚊（Ρ· oryzae))、 毛眼水蠅屬物種（Hydrellia spp.)(例如，麥葉毛眼水蠅（H. griseola)或日稻毛眼 水蠅（H. sasakii) )、Chlorops屬物種（例如，稻桿潛蠅（C. oryzae))、根螢葉甲屬物 種（Diabrotica spp.)(例如，玉米根葉甲（D. virgifera virgifera)、北美玉米根葉 甲（D. barberi)、黃瓜十一星葉甲食根亞種（D. undecimpunctata howardi)、墨西哥玉米 根葉甲（D. virgifera zeae)、條紋黃瓜葉甲（D.balteata))、桿野螟屬物種（Ostrinia spp.)(例如，玉米螟（0. nubilalis))、地虎屬物種（Agrotis spp.)(例如，小地老虎 (A. ipsilon))、Elasmopalpus 屬物種（例如，南美玉米苗斑螟（E. lignosellus))、梳爪 叩頭蟲屬物種（Melanotus spp.)(線蟲）、圓頭犀金龜屬物種（Cyclocephala spp.)(例 如，北部偽裝金龜（C. borealis)或南部偽裝金龜（C. immaculata))、弧麗金龜屬物種 (Popillia spp.)(例如，日本弧麗金龜（Ρ· japonica))、跳甲屬物種（Chaetocnema spp.) (例如，玉米銅色跳甲（C.pulicaria))、龍頸象屬物種（Sphenophorus spp.)(例如，玉米 長_象（S.maidis))、纟益管姆屬物種（Rhopalosiphum spp.)(例如，玉米姆（R.maidis))、 圓尾姆屬物種（Anuraphis spp.)(例如，玉米根姆（A. maidiradicis))、黑幢屬物種 (Melanoplus spp.)(例如，紅足黑幢（M. femurrubrum))、特異黑幢（M. differentialis) 或迀飛黑幢（Μ· sanguinipes))、種蠅屬物種（Hylemya spp.)(例如，種蠅（Η· platura))、 呆薊馬屬物種（Anaphothrips spp.)(例如，黃呆薊馬（A. obscrurus))、火蟻屬物種 (Solenopsis spp.)(例如，盜蟻（S.milesta))、葉螨屬物種（Tetranychus spp.)(例如， 二點葉螨（T. urticae)、朱砂葉螨（T. cinnabarinus))、鈴夜蛾屬物種（例如，谷實夜蛾或 棉鈴蟲（H. atmigera))、Pectinophora 屬物種（例如，紅鈴麥蛾（P. gossypiella))、金剛 鉆屬物種（Earias spp.)(例如，翠紋鉆夜蛾（E. vittella))、實夜蛾屬物種（Heliothis spp.)(例如，煙芽夜蛾（H.virescens))、花象屬物種（Anthonomus spp.)(例如，墨西哥 棉鈴象（A. grandis))、Pseudatomoscelis 屬物種（例如，棉偽斑腿盲蝽（P. seriatus))、 結翅粉風屬物種（Trialeurodes spp.)(例如，結翅粉風（T. abutiloneus)、溫室粉風 (T.vaporariorum))、小粉風屬物種（Bemisia spp.)(例如，銀葉粉風（B.argentifolii))、 蟲牙屬物種（Aphis spp.)(例如，棉姆（A. gossypii))、草盲蝽屬物種（Lygus spp.)(例如，美 國牧草盲疇（L. lineolaris)或美洲牧草盲疇（L. hesperus))、美洲疇屬物種（Euschistus spp.)(例如，斑點美洲蝽（Ε· conspersus))、Chlorochroa屬物種（例如，賽氏蝽（C. sayi))、 綠蝽屬物種（Nezara spp.)(例如，稻綠蝽（N.viridula))、薊馬屬物種（Thrips spp.)(例 如，煙薊馬（T. tabaci))、花薊馬屬物種（Frankliniella spp.)(例如，煙褐薊馬（F. fusca) 或西方花薊馬（F.occidentalis))、馬鈴薯葉甲屬物種（Leptinotarsa spp.)(例如，馬鈴 薯葉甲（L.decemlineata)、偽馬鈴薯葉甲（L. juncta)或胡頹子葉煎葉甲（L.texana))、 合爪負泥蟲屬物種（Lema spp.)(例如，三條負泥蟲（L. tri 1 ineata))、煎跳甲屬物種 (Epitrix spp.)(例如，美國馬鈴薯跳甲（E.cucumeris)、煙草跳甲（E.hirtipennis)或塊 莖跳甲（E.tuberis))、豆芫菁屬物種（Epicauta spp.)(例如，北美豆芫菁（E.vittata))、 猿葉甲屬物種（Phaedon spp.)(例如，辣根猿葉甲（P. cochleariae))、食植瓢蟲屬物種 (Epilachna spp.)(例如，墨西哥豆瓢蟲（E.varivetis))、Acheta屬物種（例如，居屋艾 幡（A. domesticus))、綠小葉蝶屬物種（Empoasca spp.)(例如，蠶豆小綠葉蝶（E. fabae))、 瘤蟲牙屬（Myzus spp.)(例如，桃姆（M.persicae))、薯個木風屬物種（Paratrioza spp.) (例如，馬鈴薯木風（P.cockerelli))、寬胸金針蟲屬物種（Conoderus spp.)(例如，南部 馬鈴薯線蟲（C.falli)或煙草線蟲（C.vespertinus))、麥蛾屬物種（Phthorimaea spp.) (例如，馬鈴薯麥蛾（P. operculella))、長管姆屬物種（Macrosiphum spp.)(例如，大 戟長管姆（M. euphorbiae))、Thyanta 屬物種（例如，紅肩蝽象（T. pallidovirens))、 麥蛾屬物種（Phthorimaea spp.)(例如，馬鈴薯麥蛾（P. operculella))、鈴夜蛾屬物 種（例如，谷實夜蛾）、Keiferia屬物種（例如，番煎蠢蛾（K. lycopersicella))、金針 蟲屬物種（Limonius spp.)(線蟲）、Manduca屬物種（例如，煙草天蛾（M. sexta)或 番煎天蛾（M.quinquemaculata))、斑潛蠅屬物種（Liriomyza spp.)(例如，蔬菜斑潛 蠅（L.sativae)、三葉草斑潛蠅（L.trifolli)或南美斑潛蠅（L.huidobrensis))、果蠅 屬物種（Drosophilla spp.)(例如，黑腹果蠅（D.melanogaster)、D.yakuba、擬暗果蠅 (D.pseudoobscura)或擬果M (D.simulans))、步甲屬物種（Carabus spp.)(例如，粒步甲 (C.granulatus))、搖蚊屬物種（Chironomus spp.)(例如，搖蚊（C.tentanus))、柿首蚤屬 物種（Ctenocephalides spp.)(例如，貓柿首蚤（C.felis))、非耳_象屬物種（Diaprepes spp.)(例如，根象鼻蟲（D. abbreviatus))、齒小蠢屬物種（Ips spp.)(例如，美松齒小蠢 (I.pini))、擬谷盜屬物種（Tribolium spp.)(例如，赤擬谷盜（T.castaneum))、舌蠅屬物 種（Glossina spp.)(例如，刺舌蠅（G.morsitans))、按蚊屬物種（Anopheles spp.)(例如， 甘比亞按蚊（A. gambiae))、鈴夜蛾屬（例如，棉鈴蟲（H. armigera))、Acyrthosiphon屬物種 (例如，豌豆姆（A. pisum))、蜜蜂屬物種（Apis spp.)(例如，意大利蜜蜂（A. melifera))、 Homalodisca屬物種（例如，琉璃葉蝶（H.coagulate))、伊蚊屬物種（Aedes spp.)(例 如，埃及斑紋（Ae. aegypti))、蠶蛾屬物種（Bombyx spp.)(例如，家蠶（B. mori))、飛蟲皇 屬物種（Locusta spp.)(例如，飛幢（L.migratoria))、牛蜱屬物種（Boophilus spp.) (例如，微小牛蜱（B. microplus))、Acanthoscurria屬物種（例如，紅毛巧克力捕鳥蛛 (A. gomesiana))、甲蠊屬物種（Diploptera spp.)(例如，太平洋折翅蠊（D. punctata))、袖 蝶屬物種（Heliconius spp.)(例如，瓦氏袖蝶（H.erato)或詩神袖蝶（H.melpomene))、象 蟲屬物種（Curculio spp.)(例如，歐洲櫟象（C. glandium))、Plutella屬物種（例如，菜 蛾（P. xylostella))、鈍眼蜱屬物種（Amblyomma spp.)(例如，彩飾花蜱（A. variegatum))、 豐乍香屬物種（Anteraea spp.)(例如，天香（A.yamamai))和阿蚊屬物種（Armigeres spp.) (例如，騷擾阿蚊（A.subalbatus));
[0033] (2)能夠侵擾或損傷人和/或動物的昆蟲，例如但不限于具有可見于半翅目和 某些膜翅目以及雙翅目（如蚊子、蜜蜂、黃蜂、虱、蚤和螞蟻）的刺吸式口器的昆蟲以及 蛛形綱動物（Arachnidae)(如蜱和螨）：蜱螨目（蜱和螨），例如代表性的科：軟蜱科 (Argasidae)、皮刺螨科（Dermanyssidae)、硬蜱科（Ixodidae)、癢螨科（Psoroptidae)或 擠螨科（Sarcoptidae)，以及代表性的物種：花蜱屬物種（Amblyomma spp.)、暗眼蜱屬物 種（Anocentor spp·)、銳緣蜱屬物種（Argas spp·)、牛蜱屬物種（Boophilus spp·)、姬螯 螨屬物種（Cheyletiella spp·)、足螨屬物種（Chorioptes spp·)、懦形螨屬物種（Demodex spp.)、革蜱屬物種（Dermacentor spp.)、皮刺螨屬物種（Dermanyssus spp.)、血蜱屬物 種（Haemophysalis spp·)、璃眼蜱屬物種（Hyalomma spp·)、硬蜱屬物種（Ixodes spp·)、 Lynxacarus屬物種、中氣門亞目物種（Mesostigmata spp.)、背肛螨屬物種（Notoedres spp.)、鈍緣蜱屬物種（Ornithodoros spp.)、禽刺螨屬物種（Ornithonyssus spp.)、殘_蜱 屬物種（Otobius spp·)、耳癢螨屬物種（Otodectes spp·)、肺刺螨屬物種（Pneumonyssus spp.)、癢螨屬物種（Psoroptes spp.)、扇頭蜱屬物種（Rhipicephalus spp.)、擠螨屬物種 (Sarcoptes spp.)或恙螨屬物種（Trombicula spp.);風目（吸咣和叮咬的風），例如代表 性物種：牛毛風屬物種（Bovicola spp·)、血風屬物種（Haematopinus spp·)、顎風屬物種 (Linognathus spp.)、雞風屬物種（Menopon spp.)、人風屬物種（Pediculus spp.)、瘦綿蟲牙 屬物種（Pemphigus spp·)、根瘤姆屬物種（Phylloxera spp.)或管風屬物種（Solenopotes spp.);雙翅目（蠅），例如代表性的物種：伊蚊屬物種（Aedes spp.)、按蚊屬物種 (Anopheles spp·)、麗蠅屬物種（Calliphora spp·)、金蠅屬物種（Chrysomyia spp·)、斑 蛇屬物種（Chrysops spp·)、錐蠅屬物種（Cochliomyia spp·)、庫蚊屬物種（Culex spp·)、 庫蠓屬物種（Culicoides spp·)、黃蠅屬物種（Cuterebra spp·)、皮蠅屬物種（Dermatobia spp·)、胃蠅屬物種（Gastrophilus spp·)、舌蠅屬物種（Glossina spp·)、黑角蠅屬物種 (Haematobia spp.)、麻蛇屬物種（Haematopota spp.)、風Μ屬物種（Hippobosca spp.)、皮 蠅屬物種（Hypoderma spp.)、綠蠅屬物種（Lucilia spp.)、角蠅屬物種（Lyperosia spp.)、 蜱蠅屬物種（Melophagus spp·)、狂蠅屬物種（Oestrus spp·)、綠蠅屬物種（Phaenicia spp.)、白蛉屬物種（Phlebotomus spp.)、伏蠅屬物種（Phormia spp.)、麻蠅屬物種 (Sarcophaga spp·)、蚋屬物種（Simulium spp·)、螫蠅屬物種（Stomoxys spp·)、蛇屬物種 (Tabanus spp. )、Tannia屬物種或大蚊屬（Tipula spp.);食毛目（叮咬的風），例如代表 性的物種：Damalina屬物種、貓毛風屬物種（Felicola spp.)、Heterodoxus屬物種或卩齒毛 風屬物種（Trichodectes spp.);蚤目（無翅昆蟲），例如角葉蚤屬物種（Ceratophyllus spp·)、蚤屬物種（Pulex spp.)或客蚤屬物種（Xenopsylla spp.);臭蟲科（臭蟲），例如代 表性的物種：臭蟲屬物種（Cimex spp. )、Tritominae屬物種、Rhodinius屬物種或錐蝽屬物 種（Triatoma spp.)以及
[0034] (3)導致對基層（substrate)或物品的不利破壞的昆蟲，如攻擊食品、種子、木材、 涂料、塑料、衣物等的昆蟲。
[0035] (4)與公共健康和衛生相關的昆蟲或蛛形綱動物，包括住屋昆蟲和體外寄生 蟲，例如但不限于蠅、葉螨、薊馬、蜱、紅色家禽螨、螞蟻、蟑螂、白蟻、蟋蟀（包括住屋蟋 蟀）、蠢蟲、書虱、甲蟲、蠼螋、蚊子和蚤。更優選的靶標是蟑螂（蜚蠊目），例如但不限 于小蠊屬物種（Blatella spp.)(例如，德國小蠊（Blatella germanica)、大蠊屬物種 (Periplaneta spp.)(例如，美洲大臟（Periplaneta americana)和澳洲大臟（Periplaneta australiasiae)、蜚臟屬物種（Blatta spp.)(例如，東方蜚臟（Blatta orientalis))和皮 蠊屬物種（Supella spp.)(例如，長須蜚蠊（Supella longipalpa))，螞蟻（蟻總科），如但 不限于火蟻屬（Solenopsis spp.)(例如，紅火蟻（Solenopsis invicta))、小家蟻屬物種 (Monomorium spp.)(例如，小家蟻（Monomorium pharaonis))、弓背蟻屬物種（Camponotus spp.)(例如，弓背蟻屬物種（木匠蟻））、毛蟻屬物種（Lasius spp.)(例如，黑毛蟻（lasius niger))、鋪道蟻屬物種（Tetramorium spp.)(例如，鋪道蟻（Tetramorium caespitum))、紅 蟻屬物種（Myrmica spp.)(例如，小紅蟻（Myrmica rubra))、蟻屬物種（Formica spp.)(木 蟻）、舉腹蟻屬物種（Crematogaster spp.)(例如，舉腹蟻（Crematogaster lineolata))、 虹臭蟻屬物種（Iridomyrmex spp.)(例如，阿根廷蟻（Iridomyrmex humilis))、大頭 蟻屬物種（Pheidole spp.)(大頭蟻）和 Dasymutilla 屬物種（例如，Dasymutilla occidentalis (蟻蜂）），白蟻（等翅目和/或白蟻科），例如但不限于丫白蟻屬物種 (Amitermes spp.)(例如佛羅里達黑翅散白蟻（Amitermes floridensis))、散白蟻屬物 種（Reticulitermes spp.)(例如，黃肢散白蟻（Reticulitermes flavips)、西部散白 蟻（Reticulitermes hesperus))、乳白蟻屬物種（Coptotermes spp.)(例如，臺灣乳白 蟻（Coptotermes formosanus))、植白蟻屬物種（Incisitermes spp.)(例如，小植白蟻 (Incisitermes minor))、新白蟻屬物種（Neotermes spp.)(例如，森林樹白蟻（Neotermes connexus))〇
[0036] 受益于本發明的"敏感生物"包括對害蟲侵害敏感的任何生物。許多不同生物的害 蟲，所述生物例如動物（如人、家畜（如寵物（如貓、犬等））和牲畜（包括綿羊、奶牛、豬、 雞等））。
[0037] 由此，在本發明的優選但非限制的實施方案中，所述昆蟲或蛛形綱動物選自：
[0038] (1)蜱螨目：包括蜱亞目（蜱）的螨類
[0039] (2)蛛形綱：蜘蛛目（蜘蛛）和盲蛛目（盲蜘蛛），實例包括黑寡婦蜘蛛 (Latrodectus mactans)和掠色隱遁蝴蛛（Loxosceles recluse)
[0040] (3)風目：風，如體風（Pediculus humanus)
[0041] (4)蜚蠊目：蟑螂,包括德國小蠊、大蠊屬的美洲大蠊和澳洲大蠊、蜚蠊屬的東方 蜚蠊以及皮蠊屬的長須蜚蠊。最優選的靶標是德國小蠊。
[0042] (5)鞘翅目：甲蟲，實例包括長蠹總科；大小蠹屬物種（Dendroctonus spp.) (Black Turpentine Beetle、南部松小蠹（Southern Pine Beetle)、IPS 雕刻小蠹（IPS Engraver Beetle));地毯甲蟲（Carpet Beetles)(圓皮蠹屬物種（Anthrenus spp·)、毛皮 蠹屬物種（Attagenus spp·)) ;01d House Borer(天牛科：家天牛（Hylotrupes bajulus)); 家俱竊蠹（Anobium punctatum);擬谷盜屬物種（面象蟲）；谷斑皮蠹（Trogoderma granarium) ；0ryzaephilus sarinamensis (鍋谷盜（Toothed Grain Beetle))等（書蟲）
[0043] (6)革翅目：蠼螋類
[0044] (7)雙翅目：蚊（蚊科）和蠅（短角亞目），實例是Anophehnae (如按蚊屬物種）和 庫蚊亞科（如 Aedes fulvus);蛇科如 Tabanus punctifer (馬妮）、Glossina morsitans morsitans (舌蠅）、drain flies (毛艨科）以及有瓣蠅類（Calyptratae)如家蠅（Musca domestica)、肉蠅（麻蠅科）等
[0045] (8)異翅亞目：臭蟲，如溫帶臭蟲（Cimex lectularius)(床風）
[0046] (9)膜翅目：黃蜂（細腰亞目），包括螞蟻（蟻總科）、蜜蜂（蜜蜂總科）：紅火蟻、 小家蟻、弓背蟻屬物種（木匠蟻）、黑毛蟻、鋪道蟻、小紅蟻、蟻屬物種（木蟻）、舉腹蟻、阿根 廷蟻、大頭蟻屬物種（大頭蟻）和Dasymutilla occidentalis (蟻蜂）等
[0047] (10)等翅目：白蟻，實例包括佛羅里達黑翅散白蟻（Amitermes fioridensis)、 黃肢散白蟻、西部散白蟻（R.hesperus)、臺灣乳白蟻、小植白蟻、森林樹白蟻（Neotermes connexus))和白蟻科
[0048] (11)鱗翅目：蛾，實例包括谷蛾科和織蛾科（如衣蛾（Tineola bisselliella))以 及螟蛾科（如紫斑谷螟（Pyralis farinalis))等
[0049] (12)嚙蟲目：書虱（嚙蟲目）
[0050] (13)蚤目：蚤，如致癢蚤（Pulex irritans)
[0051] (14)胸喙亞目：蟲牙蟲（蚜科）
[0052] (15)衣魚目：蠹蟲，實例是：小灶衣魚（Thermobia domestica)和衣魚（Lepisma saccharina)
[0053] 本發明優選的植物病原性昆蟲是植物害蟲并選自：馬鈴薯葉甲屬物種（例如，馬 鈴薯葉甲、偽馬鈴薯葉甲或胡頹子葉茄葉甲）、褐飛虱屬物種（例如，褐飛虱）、灰飛虱屬 物種（例如，灰飛虱）、黑尾葉蟬屬物種（例如，二點黑尾葉蟬，或黑尾葉蟬，或二條黑尾葉 蟬）、白背飛虱屬物種（例如，白背飛虱）、禾草螟屬物種（例如，二化螟、臺灣稻螟或稻多麗 螟）、蛀莖夜蛾屬物種（例如，稻蛀莖夜蛾）、蛀禾螟屬物種（例如，白稻螟或三化螟）、根螢 葉甲屬物種（例如，玉米根葉甲、北美玉米根葉甲、黃瓜十一星葉甲食根亞種、墨西哥玉米 根葉甲）、桿野螟屬物種（例如，玉米螟）、呆薊馬屬物種（例如，黃呆薊馬）、Pectinophora 屬物種（例如，紅鈴麥蛾）、實夜蛾屬物種（例如，煙芽夜蛾）、結翅粉風屬物種（例如，結翅 粉虱、溫室粉虱）、小粉虱屬物種（例如，銀葉粉虱）、蚜屬物種（例如，棉蚜）、草盲蝽屬物種 (例如，美國牧草盲蝽或美洲牧草盲蝽）、美洲蝽屬物種（例如，斑點美洲蝽）、Chlorochroa 屬物種（例如，賽氏蝽）、綠蝽屬物種（例如，稻綠蝽）、薊馬屬物種（例如，煙薊馬）、花薊馬 屬物種（例如，煙褐薊馬或西方花薊馬）、瘤蚜屬物種（例如，桃蚜）、長管蚜屬物種（例如， 大戟長管蚜）、桿長蝽屬物種（例如，美洲谷桿長蝽）、綠蝽屬物種（例如，擬綠蝽）、禾草螟 屬物種（例如，稻桿螟（C. polychrysa))、稻水象屬物種（例如，稻水象甲）、縊管蚜屬物種 (例如，玉米姆）和圓尾姆屬物種（例如，玉米根姆（A.maidiradicis))。
[0054] 根據一個更具體的實施方案，本發明的方法適用于馬鈴薯葉甲屬物種。馬鈴薯葉 甲屬屬于葉甲科或葉甲類。葉甲（如跳甲和玉米根蟲）和象甲（如苜蓿葉象甲）是特別重 要的害蟲。跳甲包括多種小型食葉甲蟲，其以多種草、谷類和草本植物的葉為食。跳甲包括 多個屬（例如，八1：1：；^3、4口口111：11〇仙、4找〇口丨8七68、0丨8〇115^1^、爺跳甲屬、長附跳甲屬、潛跳甲 屬（Prodagricomela)、Systena和黃條跳甲屬）。蔬菜黃條跳甲（Phyllotreta cruciferae) (也叫作油菜跳甲（Rape Flea Beetle))是特別重要的害蟲。玉米根蟲包括葉甲屬的物種 (例如，黃瓜十一星葉甲（D. undecimpunctata undecimpunctata)、黃瓜十一星葉甲食根亞 種、D. longicornis、玉米根葉甲和條紋黃瓜葉甲）。玉米根蟲對玉米和瓜類（curcubit)造 成廣泛破壞。黃瓜i 星葉甲（Western Spotted Cucumber Beetle)是美國西部的瓜類害 蟲。苜蓿葉象甲（亦稱三葉草象甲）屬于葉象屬（紫苜蓿葉象（H. postica)、埃及苜蓿葉象 (H. brunneipennis)、H. nigrirostris、三葉草葉象（H. punctata)和 H. meles)，并被認為是 重要的豆類害蟲。埃及苜蓿葉象是美國西部的重要苜蓿害蟲。
[0055] 馬鈴薯葉甲屬物種超過30種。因此，本發明包括用于防治馬鈴薯葉甲屬物種的 方法，更特別地用于殺死昆蟲、或阻止馬鈴薯葉甲屬昆蟲發育或生長、或者防止昆蟲感染 或侵害的方法。本發明所防治的特定馬鈴薯葉甲屬物種包括馬鈴薯葉甲（Leptinotarsa decemlineata(Say))和偽馬鈴薯葉甲（Leptinotarsa juncta(Say))。
[0056] CPB (Colorado Potato Beetle，馬鈴薯葉甲）對我們本國的馬鈴薯、其它栽培和野 生的有塊莖和無塊莖的馬鈴薯物種（例如，S.demiSSUm(墨西哥馬鈴薯野生種）、富利亞薯 (S.phureja a.o.))以及另一些茄屬植物物種是（嚴重的）害蟲，所述植物物種包括： [0057] (a)作物物種番爺（若干番爺屬物種）、爺子、胡椒（若干辣椒屬物種）、煙草（若 干煙草屬物種，其包括觀賞性植物）和醋栗（酸漿屬物種）；
[0058] (b)雜草/草本植物物種，北美刺龍葵（S. carolinense)、歐白英（S. dulcamara)、 顛茄（顛茄屬物種）、曼陀羅（曼陀羅屬物種）、天仙子（天仙子屬物種）和黃花刺茄 (S.rostratum)〇
[0059] FPB(False Potato Beetle,偽馬鈴薯葉甲）主要發現于北美刺龍葵上，也發生在 歐白英、醋栗和酸漿（酸漿屬物種）上。
[0060] 術語"昆蟲"包括所有類型以及所有發育階段的昆蟲，包括卵、幼蟲或若蟲、蛹和成 蟲階段。
[0061] 本發明延伸至本文所述的方法，其中所述昆蟲是馬鈴薯葉甲，所述植物是馬鈴薯、 茄子、番茄、胡椒、煙草、醋栗或者稻、玉米或棉花。
[0062] 本發明延伸至本文所述的方法，其中所述昆蟲是辣根猿葉甲，所述植物是芥菜、大 白菜、蕪菁、羽衣甘藍或小白菜。
[0063] 本發明延伸至本文所述的方法，其中所述昆蟲是墨西哥豆瓢蟲，所述植物是豆類、 菜豆、四季豆、食莢菜豆、利馬豆、綠豆、青豆、牛眼豆、絨毛豆、大豆、豇豆、木豆、三葉草或苜 蓿。
[0064] 本發明延伸至本文所述的方法，其中所述昆蟲是墨西哥棉鈴象，所述植物是棉花。 [0065] 本發明延伸至本文所述的方法，其中所述昆蟲是赤擬谷盜，所述植物以貯藏谷物 的形式，如面粉、谷類、粗粉、餅干、豆類、調味品、面食、點心粉、干的寵物食品、干花、巧克 力、堅果、種子甚至干的博物館標本。
[0066] 本發明延伸至本文所述的方法，其中所述昆蟲是桃蚜，所述植物是樹木如李屬，特 別是桃、杏和李子；茄科、藜科、菊科、十字花科和葫蘆科的蔬菜作物，其包括但不限于：朝 鮮薊、蘆筍、豆類、甜菜、嫩莖花椰菜、抱子甘藍、卷心菜、胡蘿卜、花椰菜、哈蜜瓜、芹菜、玉 米、黃瓜、茴香、無頭甘藍、大頭菜、蕪菁、茄子、萵苣、芥菜、菜秋葵、歐芹、歐洲防風草、豌豆、 胡椒、馬鈴薯、蘿卜、菠菜、南瓜、番茄、蕪菁、豆瓣菜和西瓜；農田作物例如但不限于：煙草、 糖用甜菜和向日葵；花作物或其它觀賞性植物。
[0067] 本發明延伸至本文所述的方法，其中所述昆蟲是褐飛虱，所述植物是稻類植物。 [0068] 本發明延伸至本文所述的方法，其中所述昆蟲是二化螟，所述植物是稻類植物、大 麥（bareley)、高粱、玉米、小麥或草。
[0069] 本發明延伸至本文所述的方法，其中所述昆蟲是菜蛾，所述植物是蕓苔屬物種，例 如但不限于卷心菜、大白菜、抱子甘藍、無頭甘藍、油菜籽、嫩莖花椰菜、花椰菜、蕪菁、芥菜 或蘿卜。
[0070] 本發明延伸至本文所述的方法，其中所述昆蟲是居屋艾蟋，所述植物是本文所述 的任何植物或任何有機體。
[0071] 在本文中，術語"植物"包括期望被處理從而阻止或降低昆蟲生長和/或昆蟲侵 害的任何植物材料。這包括整株植物、幼苗、增殖或繁殖材料（如種子、插條、接穗、外植體 等），以及植物細胞和組織培養物等。所述植物材料應當表達RNA分子或者具有表達RNA分 子的能力，所述RNA分子包含至少一種核苷酸序列，該核苷酸序列是害蟲至少一種靶基因 的有義鏈核苷酸序列之至少一部分的RNA互補序列或代表了其RNA等價物，從而所述RNA 分子通過植物與害蟲的相互作用被害蟲攝取，所述RNA分子能夠通過RNA干擾來抑制靶基 因或者下調靶基因的表達。
[0072] 所述靶基因可以是本文所述的任何靶基因，例如對于害蟲的生存、生長、發育或繁 殖必需的靶基因。本發明涉及昆蟲中可被下調的任何目的基因（本文可稱作"靶基因"）。
[0073] 術語"下調基因表達"和"抑制基因表達"可互換使用，其指在靶基因的蛋白質產物 和/或mRNA產物水平上可測量的或可觀察的基因表達減少或者完全消除可檢測的基因表 達。優選地，所述下調不顯著地直接抑制昆蟲其它基因的表達。當與正常的基因表達比較 時，dsRNA對基因表達的下調效果可計算為至少為30%、40%、50%、60%，優選70%、80%， 或者更優選90 %或95 %。取決于靶基因的性質，可通過對細胞或整只昆蟲進行表型分析或 者使用分子技術測量mRNA或蛋白質的表達來驗證昆蟲細胞中基因表達的下調或抑制，所 述分子技術如RNA溶液雜交、PCR、核酸酶保護實驗、Northern雜交、逆轉錄、使用微列陣監 測基因表達、抗體結合、酶聯免疫吸附測定（ELISA)、We Stern印跡、放射免疫測定（RIA)、其 它免疫測定或熒光激活細胞分析（FACS)。
[0074] "靶基因"基本上可以是由于其干擾昆蟲的生長或致病性或感染性而期望被抑制 的幾乎任何基因。例如，如果本發明的方法用于阻止昆蟲生長和/或侵害，則優選地選擇 對昆蟲的生存、生長、發育或繁殖必需的靶基因，或者參與昆蟲的致病性或感染性的任何基 因，從而對靶基因的特異性抑制導致致死性表型或者降低或阻止昆蟲侵害。
[0075] 根據一個非限制性的實施方案，所述靶基因是當使用本發明的方法下調或抑制其 表達時，昆蟲被殺死或者昆蟲的繁殖或生長被阻止或阻滯的那些基因。認為這類靶基因是 昆蟲生存所必需的，并稱作必需基因。因此，本發明包括本文所述的方法，其中所述靶基因 是必需基因。
[0076] 根據另一非限制性的實施方案，所述靶基因是當使用本發明的方法將其下調時， 昆蟲的侵害或感染、昆蟲造成的破壞和/或昆蟲侵害或感染宿主生物和/或導致此類破壞 的能力有所降低。一般地，術語"侵害"和"感染"始終可互換使用。認為這類靶基因參與昆 蟲的致病性或感染性。因此，本發明延伸至本文所述的方法，其中所述靶基因參與昆蟲的致 病性或感染性。選擇后一類型靶基因的優勢在于阻斷了昆蟲進一步感染植物或植物部分， 并抑制其形成后代。
[0077] 根據一個實施方案，靶基因是保守基因或昆蟲特異性基因。
[0078] 另外，在本發明的方法中可以使用能夠指導RNAi或RNA介導的基因沉默或者抑制 昆蟲靶基因的任何適當的雙鏈RNA片段。
[0079] 在另一實施方案中，選擇實質性參與害蟲（如昆蟲）生長、發育和繁殖的基因。示 例性的基因包括但不限于核糖體蛋白的結構亞基和β -外被體基因（如CHD3基因）。核 糖體蛋白如S4(RpS4)和S9(RpS9)是參與蛋白質生物合成的核糖體的結構組分，并且是胞 質小核糖體亞基的組分，核糖體蛋白如L9和L19是參與蛋白質生物合成的核糖體的結構組 分，并且定位于核糖體。秀麗隱桿線蟲中的β-外被體基因編碼蛋白質，所述蛋白質形成 膜泡外衣的多聚復合體的亞基。已在多種生物中發現類似的序列，如擬南芥（Arabidopsis thaliana)、黑腹果妮（Drosophila melanogaster)和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)。在多種生物中發現相關的序列，如馬鈴薯葉甲、辣根猿葉甲、墨西哥豆瓢蟲、 墨西哥棉鈴象、赤擬谷盜、桃蚜、褐飛虱、二化螟、菜蛾和居屋艾蟋。
[0080] 本發明使用的其它靶基因可包括例如在生存、生長、發育、繁殖和感染性中扮演重 要角色的基因。這些靶基因包括例如持家基因、轉錄因子和害蟲特異性基因或者線蟲或果 蠅中致死性敲除突變。本發明使用的靶基因還可以是來自其它生物的基因，例如來自昆蟲 或蛛形綱動物（例如，馬鈴薯葉甲屬物種、猿葉甲屬物種、食植瓢蟲屬物種、花象屬物種、擬 谷盜屬物種、瘤姆屬物種、褐飛風屬物種、禾草螟屬物種、Plutella屬物種或Acheta屬物 種）的基因。
[0081] 優選的靶基因包括表1A中指定的基因以及來自其它靶生物（如來自其它害蟲） 的直向同源基因。
[0082] 在本發明的方法中，使用dsRNA抑制昆蟲生長或干擾昆蟲的致病性或感染性。
[0083] 因此，本發明涉及包含退火互補鏈的分離的雙鏈RNA，其中一條退火互補鏈包含與 昆蟲靶基因的靶核苷酸序列之至少一部分互補的核苷酸序列。所述靶基因可以是本文所述 的任意靶基因，或者其發揮同樣功能的一部分。
[0084] 根據本發明的一個實施方案，提供了包含退火互補鏈的分離的雙鏈RNA，其中一條 退火互補鏈包含與昆蟲靶基因核苷酸序列之至少一部分互補的核苷酸序列，其中所述靶基 因包含選自以下的序列：
[0085] (i)與如下表示的任意序列具有至少75%-致性的序列：SEQ ID N01，3,5,7,9， 11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,1160-163,168,173,178,183,188,193,198,203， 208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488， 493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605， 607.609.621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868， 873.878.883.888.890.892.894.896.908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071， 1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101， 1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602， 1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677， 1682.1684.1686.1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040， 2045,2050, 2055,2060,2065,2070,2075,2080,2085, 2090,2095,2100,2102,2104, 2106， 2108.2120 至 2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476 或 2481，或其互補序列，以及
[0086] (ii)包含以下任意序列之至少17個連續核苷酸的序列：SEQ ID N01、3、5、7、9， 11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203， 208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488， 493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605， 607.609.621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868， 873.878.883.888.890.892.894.896.908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071， 1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101， 1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602， 1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677， 1682.1684.1686.1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040， 2045,2050,2055,2060,2065,2070,2075, 2080,2085,2090,2095,2100,2102,2104, 2106， 2108.2120 至 2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476或2481，或其互補序列，或者，其中所述昆蟲靶基因是包含以 下任意序列之至少17個連續核苷酸的基因的昆蟲直系同源物：SEQ ID N049至158、275至 472、533 至 575、621 至 767、813 至 862、908 至 1040U161 至 1571U730 至 2039、2120 至 2338、2384至2460或其互補序列。
[0087] 取決于用于測量基因沉默的測定，與已用對照dsRNA處理的害蟲相比，生長抑制 可定量為大于約5%、10%，更優選約20%、25%、33%、50%、60%、75%、80%，最優選約 90%、95%或約 99%。
[0088] 根據本發明的另一實施方案，提供了分離的雙鏈RNA，其中至少一條所述退火互 補鏈包含如下表示的任意序列之至少一種核苷酸序列的RNA等價物：SEQ ID N01、3、5、 7,9,11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198， 203,208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483， 488,493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，566,591，596,601，603， 605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863， 868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071， 1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093,1095,1097,1099,1101， 1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602， 1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677， 1662,1684,1666,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730 至 2039, 2040， 2045,2050,2055, 2060,2065,2070,2075,2080,2085,2090, 2095,2100,2102,2104, 2106， 2108,2120 至 2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476或2481，或者其中至少一條所述退火互補鏈包含其長度為至 少17個堿基對、優選其長度為至少18、19、20或21，更優選至少22、23或24個堿基對的RNA 等價物的片段。
[0089] 如果本發明的方法用于在宿主細胞或宿主生物中或者對宿主細胞或宿主生物特 異性控制特定昆蟲的生長或侵害，則優選所述雙鏈RNA不與任何宿主基因具有任何顯著的 同源性，或者至少不與宿主的任意必需基因具有任何顯著的同源性。在這種情況下，優選所 述雙鏈RNA與宿主細胞任意基因的核酸序列一致性低于30%，更優選低于20%，更優選低 于10%，甚至更優選低于5%。序列一致性百分比應當在所述雙鏈RNA的全長區域上計算。 如果可獲得宿主生物的基因組序列數據，則可以使用標準生物信息學工具來相互校驗與所 述雙鏈RNA的序列一致性。在一個實施方案中，所述dsRNA與宿主序列之間不存在超過21 個連續核苷酸的序列一致性，即在這種情況下，優選宿主生物的基因組中不存在所述dsRNA 的21個連續堿基對。在另一實施方案中，所述dsRNA與宿主物種任意核苷酸序列之間在24 個連續核苷酸上的序列一致性低于約10%或低于約12. 5%。
[0090] 所述雙鏈RNA包含退火的互補鏈，其中一條退火互補鏈包含對應于待下調之靶基 因的靶核苷酸序列的核苷酸序列。所述雙鏈RNA的另一條鏈能夠與上述第一條鏈進行堿基 配對。
[0091] 所述昆蟲靶基因的"靶區域"或"靶核苷酸序列"可以是基因的任何適當的區域或 核苷酸序列。所述靶區域應包含靶基因的至少17、至少18或至少19個連續核苷酸，更優選 至少20或至少21個核苷酸，并且更優選所述靶基因的至少22、23或24個核苷酸。
[0092] 優選（至少部分的）所述雙鏈RNA與昆蟲靶基因的靶區域具有100%的序列一致 性。然而應當理解的是，在所述雙鏈區域的全長上具有100 %序列一致性不是功能性RNA抑 制的必要條件。還發現，相對于靶序列來說帶有插入、缺失和單點突變的RNA序列對RNA抑 制是有效的。術語"對應于"或"與……互補"在本文可互換使用，并且當這些術語用于指所 述雙鏈RNA和靶基因的靶區域之間的序列對應性時，應解釋為并非絕對需要100%的序列 一致性。然而，所述雙鏈RNA和靶區域之間的序列一致性百分比通常為至少80%或85% - 致，優選至少90%、95%、96%-致，或者更優選至少97%、98%-致，以及更優選至少99% 一致。當兩條核酸鏈的至少85%堿基配對時，它們是"基本上互補的"。
[0093] 本文使用的術語"互補的"涉及DNA-DNA互補性和DNA-RNA互補性。類似地，術語 "RNA等價物"實際上指在DNA序列中堿基"T"可以被通常存在于核糖核酸中的對應堿基 "U"所替代。
[0094] 盡管所述dsRNA包含對應于靶基因中靶區域的序列，然而整個dsRNA都對應于靶 區域的序列卻不是絕對必需的。例如，所述dsRNA可在靶標特異性序列的側翼包含短的非 靶區域，只要該序列不實質性影響該dsRNA的RNA抑制性能即可。
[0095] 所述dsRNA可包含一個或多個替代堿基從而優化RNAi的性能。對于本領域技術 人員來說，如何依次改變所述dsRNA的每個堿基并測試所得dsRNA的活性（例如，在適當的 體外測試系統中）從而優化給定dsRNA的性能是顯而易見的。
[0096] 所述dsRNA還可以包含DNA堿基、非天然的堿基或者糖-磷酸主鏈的非天然主鏈 連接或修飾，從而例如提高保藏期間的穩定性或者增強對核酸酶降解的抗性。
[0097] 先前已有報道，對于有效的基因沉默來說，形成約21bp的小干擾RNA(siRNA)是理 想的。然而，在 申請人:的應用中已顯示，dsRNA的最小長度優選至少約80-100bp以便被某 些害蟲有效攝取。有跡象表明，在無脊椎動物（如自由生活的秀麗隱桿線蟲或植物寄生性 的南方根結線蟲（Meloidogyne incognita))中，這些較長的片段在基因沉默中更加有效， 這可能由于無脊椎動物攝取這些較長的dsRNA更為有效所致。
[0098] 最近還提出，與常規的21聚體（21-mer)siRNA相比，由27聚體平端組成的合成 RNA雙鏈體或者具有29bp的莖和2-nt3'突出端的短發夾（short hairpin，sh)RNA組成的 合成RNA雙鏈體是RNA干擾更有力的誘導物。因此，基于上述已鑒定靶標、并且為27聚體 平端RNA分子或者具有29bp的莖和2-nt3'突出端的短發夾RNA分子的分子也包括在本發 明的范圍內。
[0099] 因此，在一個實施方案中，所述雙鏈RNA片段（或區域）本身的長度優選為至少 17bp，長度優選為18或19bp，更優選至少20bp，長度更優選至少21bp，或至少22bp，或至少 23bp，或至少24bp、25bp、26bp或至少27bp。"雙鏈RNA片段"或"雙鏈RNA區域"是指對應 于（部分）靶基因的雙鏈RNA小實體。
[0100] 通常，所述雙鏈RNA優選為約17-1500bp，更優選約80-1000bp，最優選約17-27bp 或約 80-250bp ;如雙鏈 RNA 區域約為 17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、 27bp、50bp、80bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、 600bp、650bp、700bp、900bp、100bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp 或 1500bp。
[0101] 所述雙鏈RNA的長度上限可取決于i)昆蟲攝取該dsRNA的需要，以及ii)該dsRNA 在細胞內部加工成指導RNAi的片段的需要。所選長度還可受RNA合成方法以及向細胞遞 送RNA的模式的影響。優選地，本發明方法中待使用的雙鏈RNA的長度小于10, 000bp，更優 選1000bp或更小，更優選500bp或更小，更優選300bp或更小，更優選100bp或更小。對于 任何給定的祀基因和昆蟲來說，所述dsRNA進行有效抑制的最佳長度可通過實驗來確定。
[0102] 所述雙鏈RNA可以是完全或部分雙鏈的。部分雙鏈RNA可在雙鏈部分的一端或兩 端包含短的單鏈突出端，只要所述RNA仍能被昆蟲攝取并指導RNAi即可。所述雙鏈RNA還 可包含內部的非互補區。
[0103] 本發明的方法包括向同一昆蟲同時或依次提供兩種或更多種不同的雙鏈RNA或 RNA構建體，從而實現下調或抑制多種靶基因或者更有效地抑制單種靶基因。
[0104] 或者，通過提供命中多種靶序列的一種雙鏈RNA來命中多個靶標，并且多于一個 拷貝的對應于靶基因的雙鏈RNA片段的存在可更有效地抑制單個靶標。因此，在本發明的 一個實施方案中，所述雙鏈RNA構建體包含多個dsRNA區域，每個dsRNA區域的至少一條鏈 包含與昆蟲靶基因的靶核苷酸序列之至少一部分互補的核苷酸序列。根據本發明，所述RNA 構建體中的dsRNA區域可以與同樣或不同的靶基因互補，和/或所述dsRNA區域可以與來 自相同或不同昆蟲物種的靶標互補。
[0105] 術語"命中"是指所述dsRNA的至少一條鏈與靶基因或核苷酸序列互補，并由此可 與之結合。
[0106] 在一個實施方案中，所述雙鏈RNA區域包含與靶基因互補的核苷酸序列的多個拷 貝。或者，所述dsRNA命中同一靶基因的多于一種靶序列。因此，本發明包括分離的雙鏈 RNA構建體，其包含與昆蟲靶標的核苷酸序列之至少一部分互補的核苷酸序列的至少兩個 拷貝。
[0107] 在本文中，本發明的術語"多種（個）"意指至少2種（個）、至少3種（個）、至少 4種（個）、至少5種（個）、至少6種（個）等。
[0108] "另一靶基因"或"至少另一種靶基因"是指例如第二、第三或第四種靶基因等。
[0109] 本發明的方法開發并使用了命中多于一種上述靶標的dsRNA或者針對上述不同 靶標的不同dsRNA的組合。
[0110] 因此，本發明涉及分離的雙鏈RNA構建體，其包含如下表示的至少一種核苷酸序 列之RNA等價物的至少兩個拷貝：
[0111] SEQ ID 吣1，3,5,7,9，11，13，15，17，19,21，23,49至158，1599，160-163，168，173， 178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,247,2249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586， 591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799， 801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040，1041，1046， 1051,1056,1061,1071,1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093， 1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582， 1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657， 1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702， 1704,1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095， 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368， 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476 或 2481，或者其長度為至少 17 個堿基對、 優選其長度為至少18、19、20或21個堿基對，更優選至少22、23或24個堿基對之片段的 RNA等價物的至少兩個拷貝，。優選地，所述雙鏈RNA包含核苷酸序列SEQ ID N0159或160 的RNA等價物，或者其長度為至少17、優選至少18、19、20或21、更優選至少22、23或24個 堿基對的片段。在另一實施方案中，本發明涉及分離的雙鏈RNA構建體，其包含核苷酸序列 SEQ ID N0159或160的RNA等價物的至少兩個拷貝。
[0112] 因此，本發明延伸至本文所述的方法，其中所述dsRNA包含退火的互補鏈，其中一 條退火互補鏈包含與昆蟲靶基因的靶核苷酸序列之至少一部分互補并包含彼此獨立選擇 的至少兩種核苷酸序列的RNA等價物的核苷酸序列。在一個實施方案中，所述dsRNA包含獨 立選自如下表示的序列之至少兩種、優選至少三種、四種或五種核苷酸序列的RNA等價物 ：
[0113] SEQ ID N01，3,5,7,9,11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173， 178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586， 591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799， 801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040，1041，1046， 1051,1056,1061,1071,1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093， 1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582， 1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657， 1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702， 1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095， 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368， 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476 或 2481，或者其長度為至少 17 個堿基對， 優選至少18、19、20或21、更優選至少22、23或24個堿基對的片段。
[0114] 所述至少兩種核苷酸序列可以來源于本文所述的靶基因。根據一個優選的實施方 案，所述dsRNA命中對昆蟲生存、生長、發育或繁殖必需的至少一種靶基因，并命中參與上 文所述的致病性或感染性的至少一種基因。或者，所述dsRNA命中同類的多種基因，例如所 述dsRNA命中至少兩種必需基因或者至少兩種參與同樣細胞功能的基因。根據又一實施方 案，所述dsRNA命中至少兩種靶基因，所述靶基因參與不同的細胞功能。例如，所述dsRNA 命中參與蛋白質合成（例如核糖體亞基）、細胞內蛋白質轉運、細胞核mRNA剪接或者參與表 1A中所述功能之一的兩種或更多種基因。
[0115] 優選地，本發明延伸至本文所述的方法，其中所述昆蟲靶基因包含選自以下的序 列：
[0116] (i)與如下表示的任意序列具有至少75%-致性的序列：SEQ ID N01，3,5,7， 9,11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203， 208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488， 493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605， 607.609.621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868， 873.878.883.888.890.892.894.896.908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071， 1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101， 1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602， 1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677， 1682.1684.1686.1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040， 2045,2050,2055,2060,2065,2070, 2075,2080,2085,2090,2095,2100,2102, 2104, 2106， 2108,2120 至 2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476 或 2481，或其互補序列，以及
[0117] (ii)包含以下任意序列之至少17個連續核苷酸的序列：SEQ ID N01、3、5、7、9， 11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203， 208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488， 493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605， 607.609.621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868， 873.878.883.888.890.892.894.896.908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071， 1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101， 1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602， 1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677， 1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730 至 2039, 2040， 2045,2050,2055,2060,2065,2070, 2075,2080,2085,2090,2095,2100,2102, 2104, 2106， 2108,2120 至 2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476 或 2481，或其互補序列，
[0118] 或者其中所述昆蟲靶基因是包含以下任意序列之至少17個連續核苷酸的基因的 昆蟲直系同源物：SEQ ID N049 至 158、275 至 472、533 至 575、621 至 767、813 至 862、908 至 1040U161 至 1571U730 至 2039、2120 至 2338、2384 至 2460 或其互補序列。
[0119] 所述雙鏈RNA中的dsRNA區域（或片段）可如下進行組合：
[0120] a)當組合那些靶向單一靶基因的多個dsRNA區域時，在RNA構建體中可以以原始 的順序（即，該區域在靶基因中出現的順序）對它們進行組合，
[0121] b)或者，可以不管所述片段的原始順序，將它們隨機地或有目的地以任意順序組 合成雙鏈RNA構建體，
[0122] c)或者，一種片段可以在所述dsRNA構建體中重復若干次，例如1?10次，例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 次，或者
[0123] d)所述dsRNA區域（靶向一種或不同的靶基因）可以以有義或反義的方向進行組 合。
[0124] 另外，所述待組合的靶基因可選自以下種類的一種或多種基因：
[0125] e)上述"必需的"基因或"致病性基因"包括對于一種或多種靶昆蟲來說關鍵性的 基因，當其被沉默時導致致死的或嚴重的（例如，進食、繁殖、生長）表型。選擇強致死性靶 基因導致有效的RNAi效果。在本發明的RNA構建體中，靶向相同或不同的（非常有效的） 致死基因的多個dsRNA區域可以進行組合，以進一步增強RNAi作用在防治害蟲中的效力、 功效或速度。
[0126] f) "弱"基因包括在本文所述的細胞途徑之一中具有特別感興趣的功能、但當其被 單獨沉默時導致弱表型效果的靶基因。在本發明的RNA構建體中，靶向一種或不同弱基因 的多個dsRNA區域可以進行組合從而獲得較強的RNAi效果。
[0127] g) "昆蟲特異性"基因包括在非昆蟲生物中沒有顯著同源性對應物的基因，其可以 通過生物信息同源性檢索來確定，例如通過BLAST檢索。選擇昆蟲特異性靶基因導致物種 特異性的RNAi作用，而在非靶生物中沒有作用或沒有顯著的（不利）作用。
[0128] h) "保守基因"包括在靶生物和非靶生物之間（在氨基酸水平上）保守的基因。 為了降低對非靶物種的可能的作用，分析這些有效但保守的基因，并選擇這些保守基因可 變區域的靶序列作為RNA構建體中的dsRNA區域的靶標。此時，在核酸序列水平評估保守 性。因此，這些可變區域包括保守靶基因中最不保守的部分（核酸序列水平）。
[0129] i) "保守途徑"基因包括參與相同生物學途徑或細胞過程的基因，或者包括在不同 昆蟲物種中具有相同功能的基因，其導致特異性且有力的RNAi作用并更有效地防治昆蟲；
[0130] j)或者，本發明的RNA構建體靶向來自不同生物學途徑的多種基因，其導致廣泛 的細胞RNAi作用并更有效地防治害蟲。
[0131] 根據本發明，所有雙鏈RNA區域包含與本文所述任何靶基因之至少一部分核苷酸 序列互補的至少一條鏈。然而，如果一個雙鏈RNA區域包含與本文所述任一靶基因的核苷 酸序列一部分互補的至少一條鏈，則另一個雙鏈RNA區域可包含與任何其它昆蟲靶基因 (包括已知靶基因）的一部分互補的至少一條鏈。
[0132] 根據本發明的另一實施方案，提供了本文所述的分離的雙鏈RNA或RNA構建體，其 還包含至少一種另外的序列以及任選地包含接頭。在一個實施方案中，所述另一序列選自 ： (i)有利于大規模生產所述dsRNA構建體的序列；（ii)提高或降低所述dsRNA穩定性的序 列；（iii)允許結合蛋白質或其它分子從而有利于昆蟲攝取所述RNA構建體的序列；（iv) 適配子序列，其結合昆蟲表面上或細胞質中的受體或分子，從而有利于昆蟲的攝取、胞吞和 /或轉胞吞；或者（v)催化dsRNA區域加工的其它序列。在一個實施方案中，所述接頭是條 件性自切割RNA序列，優選pH敏感性接頭或疏水敏感性接頭。在一個實施方案中，所述接 頭是內含子。
[0133] 在一個實施方案中，所述雙鏈RNA構建體的多個dsRNA區域通過一個或多個接頭 進行連接。在另一實施方案中，所述接頭存在于所述RNA構建體中使得所述dsRNA區域與 另一目的區域分隔的位點。本發明提供了用于所述dsRNA構建體的不同類型接頭。
[0134] 在另一實施方案中，所述雙鏈RNA構建體的多個dsRNA區域不使用接頭而進行連 接。
[0135] 在本發明的一個具體實施方案中，所述接頭可用于隔開害蟲中多個較小的dsRNA 區域。有利的是，在該情形中所述接頭序列可以在特定的條件下促使將長的dsRNA拆分為 較小的dsRNA區域，這導致在這些條件下釋放單獨的dsRNA區域，并且這些較小的dsRNA 區域導致更有效地基因沉默。適當的條件性自切割接頭的實例是在高pH條件下自切割的 RNA 序列。這些 RNA 序列的適當實例由 Borda 等（Nucleic Acids Res. 2003Mayl5;31(10): 2595-600)描述，該文獻通過參考并入本文中。所述序列源自錘頭核酶HH16的催化核心。
[0136] 在本發明的另一方面，接頭定位于所述RNA構建體中使得所述dsRNA區域與例如 另一目的序列分隔的位點，所述另一目的序列優選地向所述RNA構建體提供某種額外的功 能。
[0137] 在本發明的一個具體實施方案中，本發明的dsRNA構建體包含適配子從而有利于 昆蟲攝取該dsRNA。設計所述適配子使之結合昆蟲攝取的物質。這樣的物質可來源于昆蟲 或植物。適配子的一個具體實例是結合跨膜蛋白（例如，昆蟲的跨膜蛋白）的適配子。或 者，所述適配子可以結合昆蟲攝取的（植物）代謝物或營養物。
[0138] 或者，所述接頭在內體中進行自切割。這在本發明的構建體通過胞吞作用或轉胞 吞作用被昆蟲攝取并因此在昆蟲的內體中被區室化時可能是有利的。所述內體可具有低的 pH環境，導致所述接頭被切害|]。
[0139] 當通過細胞壁轉運從一個細胞向另一細胞轉移時，例如當穿過昆蟲害蟲的細胞壁 時，上述在疏水條件中自切割的接頭對于本發明的dsRNA構建體尤其有用。
[0140] 內含子也可用作接頭。本文使用的"內含子"可以是信使RNA的任何非編碼RNA序 列。用于本發明構建體的適當的具體內含子序列為⑴富含U(35-45%) ; (2)平均長度為 100bp (在約50和約500bp之間變化），可隨機選擇其堿基對或者可以基于已知的內含子序 列；（3)在5'端以-AG :GT-或-CG :GT-起始，和/或⑷在其3'端具有-AG :GC-或-AG : AA。
[0141] 約1個堿基對至約10, 000個堿基對的非互補RNA序列也可用作接頭。
[0142] 不希望拘泥于任何特定的理論或機制，認為昆蟲從其鄰近的環境攝取長的雙鏈 RNA。雙鏈RNA被攝取進入腸道并轉移至腸上皮細胞，然后通過內源核酸內切酶的作用在細 胞內加工成為短的雙鏈RNA (稱為小干擾RNA(siRNA))。然后，所得的siRNA通過形成多組 分的RNA酶復合體（稱為RISC或RNA干擾性沉默復合體）來介導RNAi。
[0143] 為了實現在昆蟲細胞內下調靶基因，加至細胞壁外部的雙鏈RNA可以是可被攝取 進入細胞然后在細胞內加工成siRNA從而介導RNAi的任何dsRNA或dsRNA構建體，或者加 至細胞外部的RNA本身可以是可被攝取進入細胞從而指導RNAi的siRNA。
[0144] siRNA通常是短的雙鏈RNA，其長度范圍為19?25個堿基對，或20?24個堿基 對。在優選的實施方案中，可使用對應于待下調靶基因的siRNA，其具有19、20、21、22、23、 24或25個堿基對，尤其是21或22個堿基對。然而，本發明不意在限于這樣的siRNA的用 途。
[0145] siRNA可以在雙鏈部分側翼的一端或兩端包含單鏈突出端。在一個特別優選的 實施方案中，所述siRNA可包含3'突出的核苷酸，優選兩個3'突出的胸苷（dTdT)或尿苷 (UU)。如果緊接所述dsRNA雙鏈部分所包含序列的上游靶基因序列是AA，則在siRNA中可 包含3'TT或UU突出端。這使得所述siRNA中的TT或UU突出端與靶基因雜交。盡管所述 siRNA的另一端也可包含3' TT或UU突出端，然而所述siRNA雙鏈部分所包含序列的下游 靶序列中包含AA不是必需的。在本文中，RNA/DNA嵌合體形式的siRNA也涵蓋在內。這些 嵌合體包括：例如，包含具有3'DNA堿基突出端（例如，dTdT)的雙鏈RNA的siRNA (如上所 述），以及其中一個或多個RNA堿基（或核糖核苷酸）或者甚至整條鏈上所有核糖核苷酸被 替換為DNA堿基（或脫氧核糖核苷酸）的多核苷酸形式的雙鏈RNA。
[0146] 所述dsRNA可由通過（非共價）堿基配對退火到一起的兩條單獨的（有義和反義） RNA鏈形成。或者，所述dsRNA可具有折回的莖-環或發夾結構，其中所述dsRNA的兩條退 火鏈是共價連接的。在該實施方案中，所述dsRNA的有義鏈和反義鏈由部分自我互補的單 個多核苷酸分子的不同區域形成。如果所述dsRNA欲通過體內表達（例如在如下所述的宿 主細胞或生物中）或通過體外轉錄進行合成，則具有該結構的RNA是方便的。除了不應當 破壞所述分子的雙鏈部分介導RNAi的能力以外，連接所述兩條RNA鏈的"環"的確切性質 和序列對于本發明來說通常是不重要的。用于RNAi中的"發夾"或"莖-環"RNA的特征通 常是本領域已知的（參見，例如CSIR0名下的W099/53050,其內容通過參考并入本文中）。 在本發明的另一些實施方案中，所述環結構可包含接頭序列或如上所述的其它序列。
[0147] 所述雙鏈RNA或構建體可以通過本身已知的方式進行制備。例如，可以使用本領 域公知的化學或酶促RNA合成技術在體外合成雙鏈RNA。在一個方法中，可以分別合成兩 條單獨的RNA鏈，然后退火從而形成雙鏈。在另一實施方案中，可以在宿主細胞或生物中從 適當的表達載體通過細胞內表達來合成雙鏈RNA或構建體。以下將進一步詳細地討論該方 法。
[0148] 昆蟲接觸的所述雙鏈RNA的量要能夠實現特異性下調所述一種或多種靶基因。所 述RNA可以以每個細胞遞送至少一拷貝的量被引入。然而，在某些實施方案中，較高劑量 (例如，每個細胞至少5、10、100、500或1000個拷貝）的雙鏈1?^可得到更有效地抑制。對 于任意給定的昆蟲基因靶標來說，可通過常規實驗來確定有效抑制的最佳dsRNA量。
[0149] 所述昆蟲可以以允許昆蟲直接攝取所述雙鏈RNA的任何適當的方式與所述雙鏈 RNA接觸。例如，所述昆蟲可以接觸純凈或基本純凈形式的所述雙鏈RNA，例如含有所述 dsRNA的水溶液。在該實施方案中，可以僅用含有所述雙鏈RNA的水溶液將所述昆蟲"浸 濕"。在另一實施方案中，可通過用包含所述雙鏈RNA的液體組合物向昆蟲噴灑從而使所述 昆蟲與所述雙鏈RNA進行接觸。
[0150] 或者，所述雙鏈RNA可以與所述昆蟲的食物組分（如哺乳動物病原性昆蟲的食物 組分）連接，從而增強該昆蟲對所述dsRNA的攝取。
[0151] 還可以將所述雙鏈RNA摻入所述昆蟲生長的培養基中，或者被該昆蟲侵擾的物品 或基層中（或其上），或者浸入對昆蟲侵害敏感的基層或物品中。
[0152] 根據另一實施方案，所述dsRNA表達在細菌或真菌的細胞中，并且所述細菌或真 菌的細胞被所述昆蟲攝取或攝食。
[0153] 如實施例中舉例說明的，可以改造細菌從而產生本發明的任何dsRNA或dsRNA構 建體。這些細菌可被昆蟲攝食。一旦被攝取，所述dsRNA可以起始RNAi應答，其導致靶mRNA 降解并削弱或殺死攝食昆蟲。
[0154] 因此，在更具體的實施方案中，所述雙鏈RNA或RNA構建體通過原核的（如細菌） 或真核的（如酵母）宿主細胞或宿主生物來表達。根據該實施方案，可以使用能夠表達 dsRNA或dsRNA構建體的任何細菌或酵母細胞。所述細菌選自革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽 性細菌，例如但不限于埃希氏菌屬物種（Escherichia spp.)(例如，大腸桿菌（E.coli)、芽 孢桿菌屬物種（Bacillus spp.)(例如，蘇云金芽孢桿菌（B.thuringiensis))、根瘤菌屬物 種（Rhizobium spp·)、乳桿菌屬物種（Lactobacillus spp·)、乳球菌屬物種（Lactococcus spp.)等。所述酵母可選自酵母屬物種（Saccharomyces spp.)等。
[0155] 某些細菌與宿主植物具有非常緊密的相互作用，例如但不限于共生的根瘤菌與豆 科植物（Legminosea)(例如，大豆）。這樣的重組細菌可以與種子混合（例如，作為涂層） 并用作土壤改良劑。
[0156] 因此，本發明還包括包含本文所述的任何核苷酸序列或重組DNA構建體的細胞。 本發明還包括原核細胞（例如但不限于革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌細胞）和真核細胞 (例如但不限于酵母細胞或植物細胞）。優選地，所述細胞是細菌細胞或酵母細胞或藻類細 胞。
[0157] 在另一些實施方案中，所述昆蟲可以與本文進一步描述的組合物接觸。除了所述 dsRNA或DNA，所述組合物還可包含賦形劑、稀釋劑或載體。這樣的組合物的優選特征在以 下更詳細地討論。
[0158] 或者，可以將產生dsRNA的細菌或酵母細胞直接噴灑到作物上。
[0159] 因此，如上所述，本發明提供包含本發明的RNA構建體和/或DNA構建體和/或表 達構建體的宿主細胞。優選地，所述宿主細胞是細菌或酵母的細胞，也可以是例如病毒。可 以使用特異性感染昆蟲的病毒（如桿狀病毒）。這確保了對哺乳動物（尤其是人類）的安 全性，因為所述病毒不會感染哺乳動物，所以不會發生不希望的RNAi作用。
[0160] 優選地，所述細菌細胞或酵母細胞在用作生物殺蟲劑前應被滅活，例如當該試劑 用于人類或其它哺乳動物可能接觸的環境（如廚房）時。可通過任何方法實現滅活，如通 過熱處理、苯酚或甲醛處理，或通過機械處理。
[0161] 在一個可替代的實施方案中，可利用滅活的病毒（如適當修飾的桿狀病毒）來遞 送本發明的dsRNA區域用于介導昆蟲害蟲的RNAi。
[0162] 可能的應用包括集中的溫室培育（例如從GM0角度而言意義較小的作物）以及更 廣泛的農田作物（如大豆）。
[0163] 該方法具有幾個優勢，例如：因為不存在可能的植物宿主切割（dicing)的問題， 所以它允許將大的dsRNA片段遞送進入攝食害蟲的腸內腔；使用細菌作為殺蟲劑不涉及產 生轉基因作物，尤其是對于某些難以獲得轉基因變體的作物；存在廣泛和靈活的應用，因為 可以在同一塊農田上同時處理不同的作物和/或可以同時靶向不同的害蟲，例如通過組合 那些產生不同dsRNA的不同細菌。
[0164] 本發明的另一方面是本文公開的昆蟲靶基因的靶核苷酸序列。所述靶核苷酸序列 對于設計本發明的dsRNA構建體特別重要。這些靶核苷酸序列的長度優選至少17、優選至 少18、19、20或21、更優選至少22、23或24個核苷酸。優選靶核苷酸序列的非限制性實例 在實施例中給出。
[0165] 根據一個實施方案，本發明提供了編碼本文所述的雙鏈RNA或雙鏈RNA構建體的 分離的核苷酸序列。
[0166] 根據一個更具體的實施方案，本發明涉及由如下表示的任意序列組成的分離的核 酸序列：SEQ ID N049 至 158、275 至 472、533 至 575、621 至 767、813 至 862、908 至 1040、 1161 至 1571U730 至 2039、2120 至 2338、2384 至 2460,或者其至少 17、優選至少 18、19、20 或21、更優選至少22、23或24個核苷酸的片段。
[0167] 本領域技術人員會認識到，可以找到這些靶基因的同源物，并且這些同源物也用 于本發明的方法。
[0168] 如果蛋白質或核苷酸序列顯示"顯著"水平的序列相似性或更優選地序列一致 性，則它們可能是同源的。真正同源的序列通過從共同的祖先基因趨異從而具有相關性。 序列同源物可以有兩種類型：（i)當同源物存在于不同物種中時，它們被稱為直系同源物 (orthologue)。例如，小鼠和人中的α-珠蛋白基因是直系同源物。（ii)旁系同源物是在一 個物種內部的同源基因，例如小鼠中的α-和β-珠蛋白基因是旁系同源物（paralogue)。
[0169] 優選的同源物是包含與選自如下表示的序列具有至少約85 %或87. 5 %，更優選 約90%，更優選至少約95%以及最優選至少約99%-致性的序列的基因 ：SEQ ID N01，3， 5,7,9,11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198， 203,208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483， 488,493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603， 605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863， 868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071， 1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093,1095,1097,1099,1101, 1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602， 1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677， 1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730 至 2039, 2040， 2045,2050,2055,2060,2065,2070, 2075,2080,2085,2090,2095,2100,2102, 2104, 2106， 2108,2120 至 2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460，2461，2466，2471，2476或2481，或其互補序列。用于確定序列一致性的方法是本領域 常規的，其包括使用 Blast 軟件和 EMBOSS 軟件（The European Molecular Biology Open Software Suite(2000), Rice, P.Longden, I.and Bleasby, A.Trends in Geneticsl6, (6) PP276-277)。本文使用的術語"一致性"是指序列之間在核苷酸水平上的關系。通過在比 較窗中對最優比對的序列（例如，兩條或更多）進行比較來確定"一致性百分比"，其中所述 比較窗中的序列部分與最優序列比對的參考序列相比可包含插入或缺失。所述參考序列不 包含插入或缺失。所述參考窗選自至少10個連續核苷酸至約50、約100或者至約150個核 苷酸，優選約50?150個核苷酸。然后，通過測定所述窗中的序列之間一致的核苷酸數目 并將該數目除以所述窗中的核苷酸數并乘以100來計算"一致性百分比"。
[0170] 另一些同源物是包含如下表示的任意序列的等位基因 ：SEQ ID N01，3,5,7,9，ll， 13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208， 215,220,225,230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493， 498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607， 609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873， 878.883.888.890.892.894.896.908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071，1073， 1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103， 1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607， 1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682， 1684.1686.1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045， 2050,2055,2060,2065,2070,2075,2080,2085,2090,2095,2100,2102,2104,2106,2108, 2120 至 2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460， 2461，2466，2471，2476或2481。另一些優選的同源物是與包含如下表示的任意序列的基因 相比包含至少一種單核苷酸多態性（SNP)的基因 ：SEQ ID N01，3,5,7,9，ll，13，15，17，19， 21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225， 230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,513， 515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767， 768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888， 890.892.894.896.908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071，1073,1075,1077,1079， 1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109， 1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622， 1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688， 1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060， 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339， 2344, 2349, 2354, 2359,2364, 2366, 2368, 2370, 2372,2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476 或 2481。
[0171] 根據另一實施方案，本發明包括那些包含如下表示的任意核苷酸序列的基因的 昆蟲直系同源物的靶基因 ：SEQ ID 吣1，3,5,7,9，11，13，15，17，19,21，23,49 至158，159， 160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,247,249,251，253， 255.257.259.275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788， 793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087， 1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571， 1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642， 1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696， 1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080， 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359， 2364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460,2461，2466,2471，2476 或 2481。舉例來說，直 系同源物可包含如下表示的任意核苷酸序列：SEQ ID N049至123、275至434、533至562、 621 至 738、813 至 852、908 至 1010U161 至 1437U730 至 1987、2120 至 2290 以及 2384 至 2438,或其至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個核苷酸的片段。表4中給出了包 含本發明所述序列之一的至少17bp片段的昆蟲或蛛形綱直系同源物基因或序列的非限制 性列表。
[0172] 根據另一實施方案，本發明包括那些包含如下表示的任意核苷酸序列的基因的 線蟲直系同源物的靶基因：1、3、5, 7,9,11，13,15,17,19, 21，23,49 至 158,159,160-163， 168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257， 259.275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576， 581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795， 797, 799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040,1041， 1046,1051，1056,1061，1071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091， 1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577， 1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652， 1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700， 1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090， 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366， 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476 或 248。舉例來說，線蟲直系同源物 可包含如下表示的任意核苷酸序列：SEQ ID N0124至135、435至446、563至564、739至 751、853、854、1011 至 1025U438 至 1473U988 至 200U2291 至 2298、2439 或 2440,或者其 至少17、18、19、20或21個核苷酸的片段。根據另一方面，本發明因此包括本文所述的用于 控制線蟲在生物中生長的任何方法，或者用于防止線蟲侵害對線蟲感染敏感的生物的任何 方法，所述方法包括將線蟲細胞與雙鏈RNA接觸，其中所述雙鏈RNA包含退火的互補鏈，其 中一條退火互補鏈包含與祀基因的核苷酸序列之至少一部分互補的核苷酸序列，其包含如 下表示的任意序列之至少17、18、19、20或21個核苷酸的片段 ：SEQIDN0124至135、435 至 446、563 至 564、739 至 751、853、854、1011 至 1025U438 至 1473U988 至 200U2291 至 2298、2439或2440,所述雙鏈RNA被線蟲攝取并因此控制生長或防止侵害。表5中給出了 包含本發明的序列之一的至少17bp片段的線蟲直系同源物基因或序列的非限制性列表。
[0173] 根據另一實施方案，本發明包括那些包含如下表不的任意核苷酸序列的基因的 真菌直系同源物的靶基因：1、3、5、7、9,11，13,15,17,19, 21，23,49 至 158,159,160-163， 168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257， 259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576， 581，566,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795， 797, 799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040,1041， 1046,1051，1056,1061，1071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091， 1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577， 1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652， 1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700， 1702,1704,1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090， 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366， 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476 或 2481。舉例來說，真菌直系同源 物可包含如下表示的任意核苷酸序列：SEQ ID N0136至158、447至472、565至575、752至 767、855 至 862U026 至 1040U475 至 157U2002 至 2039、2299 至 2338、2441 至 2460,或者 其至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個核苷酸的片段。根據另一方面，本發明因 此包括本文所述的用于控制真菌在細胞或生物上的生長、或者用于防止真菌侵害對真菌感 染敏感的細胞或生物的任何方法，該方法包括將真菌細胞與雙鏈RNA接觸，其中所述雙鏈 RNA包含退火的互補鏈，其中一條退火互補鏈包含與祀基因的核苷酸序列之至少一部分互 補的核苷酸序列，其包含如下表示的任意序列之至少17、18、19、20或21個核苷酸的片段： SEQ ID N0136 至 158、447 至 472、565 至 575、752 至 767、855 至 862U026 至 1040、1475 至 157U2002至2039、2299至2338、2441至2460,所述雙鏈RNA被真菌攝取并因此控制生長 或防止侵害。表6中給出了包含本發明的序列之一的至少17bp片段的真菌直系同源物基 因或序列的非限制性列表。
[0174] 術語"調節序列"涉及較寬的范圍，其指能夠實現與其有效連接之序列的表達的調 節性核酸。
[0175] 上述術語包括激活或增強核酸表達的啟動子和核酸或其合成的融合分子或衍生 物，稱為激活子或增強子。本文使用的術語"有效連接"是指在"啟動子"序列與目的核酸 分子之間的功能性連接，使得所述"啟動子"序列能夠起始核酸分子轉錄從而產生適當的 dsRNA〇
[0176] 優選的調節序列是啟動子，其可以是組成型或誘導型啟動子。優選的啟動子是誘 導型啟動子，從而嚴格控制所述RNA分子的表達。優選可通過使用適當的化學試劑（如 IPTG)來誘導的啟動子。或者，將編碼所述RNA分子的轉基因置于強組成型啟動子的控制 下。優選地，所使用的任何啟動子將指導所述RNA強烈表達。所使用啟動子的性質可部分 地由用于產生所述RNA的特定宿主細胞來決定。在一個實施方案中，所述調節序列包含噬 菌體啟動子，如T7、T3、SV40或SP6啟動子，最優選T7啟動子。在本發明的另一些實施方案 中，使用用于表達RNA的另一些啟動子，其包括但不限于來自RNA聚合酶I、RNA聚合酶II 或RNA聚合酶III的啟動子。也可以酌情使用來源于酵母或病毒基因的其它啟動子。
[0177] 在一個可替代的實施方案中，所述調節序列包含啟動子，該啟動子選自公知的 tac、trc和lac啟動子。適用于細菌宿主的誘導型啟動子包括β -內酰胺酶啟動子、大腸 桿菌λ噬菌體PL和PR啟動子以及大腸桿菌半乳糖啟動子、阿拉伯糖啟動子和堿性磷酸 酶啟動子。因此，本發明還包括用于得到本發明的任何RNA分子或RNA構建體的方法。該 方法包括以下步驟：在允許所述核酸或重組（DNA)構建體轉錄從而產生下調目的靶基因的 RNA (當所述宿主細胞被靶生物攝食時，或者當宿主細胞或從其來源的提取物被靶生物攝取 時）的條件下，將本發明的分離的核酸或重組（DNA)構建體引入（例如，通過轉化、轉染或 注射）本發明的宿主細胞中。
[0178] 任選地，也可以將一種或多種轉錄終止序列或"終止子"引入本發明的重組構建體 中。術語"轉錄終止序列"包括轉錄單元末端的控制序列，其發出初級轉錄物的3'加工和 多聚腺苷酸化作用以及轉錄終止的信號。所述轉錄終止序列用于防止轉錄的連讀，從而所 述RNA分子在宿主細胞中或者由宿主細胞正確地產生。在一個實施方案中，所述終止子包 括T7、T3、SV40或SP6終止子，優選T7終止子。也可以酌情使用來源于酵母或病毒基因的 其它終止子。
[0179] 可以將另外的調節元件（如轉錄或翻譯的增強子）引入所述表達構建體中。
[0180] 本發明的重組構建體還可包含在特定細胞類型中維持和/或復制所需的復制起 點。一個實例是表達構建體需要作為細胞中的附加型遺傳元件（例如，質粒或粘粒分子） 在細菌細胞中維持的情形。優選的復制起點包括但不限于fl-ori和colElori。
[0181] 所述重組構建體任選地可包含選擇性標記基因。本文使用的術語"選擇性標記基 因"包括賦予細胞一種表型的任何基因，該基因在所述細胞中表達從而有利于鑒定和/或選 擇用本發明的重組（表達）構建體轉染或轉化的細胞。適當的選擇性標記的實例包括抗氨 芐青霉素的基因（Ampr)、抗四環素的基因（Ter)、抗卡那霉素的基因（Kanr)、抗膦絲菌素的 基因和抗氯霉素的基因（CAT)。另一些適當的標記基因提供了代謝性狀，例如manA。還可 使用可見的標記基因，其包括例如β-葡糖醛酸酶（GUS)、螢光素酶和綠色熒光蛋白（GFP)。
[0182] 在本發明的另一些實施方案中，使用可用于表達dsRNA的另一些啟動子，其包括 但不限于來自RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、T7RNA聚合酶或SP6RNA聚 合酶的啟動子。這些啟動子通常用于體外產生dsRNA，然后將所述dsRNA包含在殺蟲劑 (antiinsecticidal agent)中，例如在殺蟲劑液體、噴霧劑或粉末中。
[0183] 因此，本發明還包括用于產生本發明的任何雙鏈RNA或RNA構建體的方法。該方 法包括以下步驟：
[0184] a.將本發明的分離的核酸或重組DNA構建體與無細胞組分接觸；或者
[0185] b.將本發明的分離的核酸或重組DNA構建體引入（例如，通過轉化、轉染或注射） 細胞，
[0186] 以上在允許所述核酸或重組DNA構建體轉錄從而產生所述dsRNA或RNA構建體的 條件下進行。
[0187] 任選地，本發明的重組構建體中還可以引入一種或多種轉錄終止序列。術語"轉錄 終止序列"包括轉錄單元末端的控制序列，其發出初級轉錄物的3'加工和多聚腺苷酸化作 用以及轉錄終止的信號。可將另一些調節元件（如轉錄或翻譯的增強子）引入所述表達構 建體。
[0188] 本發明的重組構建體還可包括在特定細胞類型中維持和/或復制所需的復制起 點。一個實例是表達構建體需要作為細胞中的附加型遺傳元件（例如，質粒或粘粒分子） 在細菌細胞中維持。優選的復制起點包括但不限于Π -ori和colElori。
[0189] 所述重組構建體任選地可包含選擇性標記基因。本文使用的術語"選擇性標記基 因"包括賦予細胞以表型的任何基因，該基因在所述細胞中表達從而有利于鑒定和/或選擇 經本發明的重組（表達）構建體轉染或轉化的細胞。適當的選擇性標記的實例包括抗氨芐 青霉素的基因（Ampr)、抗四環素的基因（Ter)、抗卡那霉素的基因（Kanr)、抗膦絲菌素的基 因和抗氯霉素的基因（CAT)。另一些適當的標記基因提供了代謝性狀，例如manA。還可使 用可見的標記基因，其包括例如β-葡糖醛酸酶（GUS)、熒光素酶和綠色熒光蛋白（GFP)。
[0190] 本發明涉及用于阻止昆蟲在植物上生長或用于防止昆蟲侵害植物的方法。根據 本發明的方法待處理的植物包括選自以下的植物：苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、蘆筍、鱷梨、香 蕉、大麥、豆、甜菜、黑莓、藍莓、嫩莖花椰菜、抱子甘藍、卷心菜、蓖麻、胡蘿卜、木薯、花椰菜、 谷類、芹菜、櫻桃、柑桔、克萊門氏小柑橘（clemintine)、咖啡、玉米、棉花、黃瓜、茄子、菊苣、 桉樹、無花果、葡萄、葡萄柚、落花生、醋栗、獼猴桃、萵苣、亜、檸檬、萊姆酸橙、松樹、玉米、芒 果、瓜、小米、蘑菇、燕麥（nut aot)、菜秋葵、洋蔥、橙、觀賞性植物或花或樹、番木瓜、歐芹、 豌豆、桃、花生、豌豆（peat)、胡椒、柿子、菠蘿、車前草、李子、石榴、馬鈴薯、南瓜、菊苣、蘿 卜、油菜籽、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、黃豆（soy)、大豆（soybean)、菠菜、草莓、糖用甜菜、甘 蔗、向日葵、紅薯、橘子、茶、煙草、番茄、藤本植物、西瓜、小麥、山藥或西葫蘆；優選馬鈴薯、 茄子、番爺、胡椒、煙草、醋栗、稻米或棉花植物），或者種子或塊莖（例如，苜蓿、蘋果、杏、朝 鮮薊、蘆筍、鱷梨、香蕉、大麥、豆、甜菜、黑莓、藍莓、嫩莖花椰菜、抱子甘藍、卷心菜、蓖麻、胡 蘿卜、木薯、花椰菜、谷類、芹菜、櫻桃、柑桔、克萊門氏小柑橘、咖啡、玉米、棉花、黃瓜、茄子、 菊苣、桉樹、無花果、葡萄、葡萄柚、落花生、醋栗、稱猴桃、萵苣、·、梓檬、萊姆酸橙、松樹、玉 米、芒果、瓜、小米、蘑燕、燕麥（nut aot)、菜秋葵、橙、觀賞性植物或花或樹、番木瓜、歐療、 豌豆、桃、花生、豌豆（peat)、胡椒、柿子、菠蘿、車前草、李子、石榴、馬鈴薯、南瓜、菊苣、蘿 卜、油菜籽、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、大豆、大豆、菠菜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、紅薯、 橘子、茶、煙草、番茄、藤本植物、西瓜、小麥、山藥或西葫蘆。
[0191] 所述靶生物攝取（優選攝食）靶向RNA的量要實現特異性下調一種或多種靶基 因。所述RNA可以以每個細胞遞送至少一拷貝的量在宿主細胞中表達。然而，在某些實施 方案中，較高劑量（例如，每個靶生物細胞至少5、10、100、500或1000個拷貝）的雙鏈1?^ 可得到更有效的抑制。對于任意給定的靶基因和靶生物來說，可通過常規實驗來確定有效 抑制的靶標RNA分子的最佳量。
[0192] 所述靶生物可以以任何適當的方式與表達所述RNA分子的宿主細胞接觸，從而允 許靶生物攝食。優選地，表達所述dsRNA的宿主細胞可以與所述靶生物的食物組分連接，從 而增強該靶生物對所述dsRNA進行攝取。還可以將表達所述dsRNA的宿主細胞引入所述靶 生物生長的培養基中，或者被害蟲生物侵擾的物品或基層中（或其上），或者浸入對害蟲生 物侵害敏感的基層或物品中。
[0193] 在可替代的實施方案中，可使用源自表達所述RNA分子的宿主細胞的適當提取物 來實現下調靶生物中的靶基因。此時，所述提取物可以通過裂解表達所述RNA分子的宿主 細胞的任何適當的方法來產生。例如，可以使用如超聲處理、弗氏壓碎（French press)、凍 融和溶菌酶處理的技術（參見 Sambrook and Russell-Molecular Cloning A laboratory manual-third edition以及表15-4中提供的參考文獻）來制備宿主細胞粗提物（裂解 物）。可以酌情對該提取物進行進一步純化，只要所述提取物介導靶基因表達的靶向下調的 能力不受不利影響即可。例如可以使用親和純化。向所述提取物添加某些成分以防止RNA 分子降解可能也是合適的。例如，可以向源自表達RNA的宿主細胞的提取物添加 RNA酶抑 制劑。在一個實例中，所述靶生物可以接觸純凈或基本純凈形式的表達RNA的宿主細胞，例 如含有所述細胞提取物的水溶液。在該實施方案中，可以簡單地用含有所述宿主細胞提取 物的水溶液將所述靶生物（尤其是害蟲生物，如昆蟲）"浸濕"。在另一實施方案中，可通過 用包含所述細胞提取物的液體組合物向所述靶生物噴灑從而使所述靶生物與所述表達RNA 分子的宿主細胞進行接觸。
[0194] 如果使用本發明的方法來特異性控制特定害蟲的生長或侵害，則優選宿主細胞中 表達的RNA不與非害蟲生物的基因具有任何顯著的同源性，尤其是不與非害蟲生物的任何 必需基因具有任何顯著的同源性。因此，所述非害蟲生物通常是對害蟲侵害敏感的生物，為 此根據本發明的方法保護所述非害蟲生物免受所述害蟲侵害。因此，例如，非害蟲物種可包 括植物或哺乳動物物種。優選地，所述哺乳動物物種為人類。所述非靶物種還可包括除了 人以外的動物，其可以暴露于所述保護免受侵害的生物或基層。實例包括鳥類（其可以以 被保護的植物為食）以及牲畜和家畜（如貓、犬、馬、牛、雞、豬、綿羊等）。在這種情況下， 優選所述dsRNA與敏感生物或非靶生物的任一基因的核酸序列一致性低于30%，更優選低 于20 %，更優選低于10 %，甚至更優選低于5 %。序列一致性百分比應當在所述靶標RNA的 全長區域上來計算。如果可獲得本發明待保護生物或任一非靶生物的基因組序列數據，則 可以使用標準生物信息學工具來相互校驗與所述靶標RNA的序列一致性。在一個實施方案 中，所述RNA分子與非害蟲生物的基因之間不存在21個連續核苷酸上的序列一致性，即在 這種情況下，優選所述非害蟲生物的基因組中不存在所述RNA的21個連續核苷酸。在另一 實施方案中，所述RNA與非害蟲（敏感的）物種的任一核苷酸序列之間在24個連續核苷酸 上的序列一致性低于約10%或低于約12. 5%。特別地，可以特別注意非害蟲物種的直向同 源基因，因為所述害蟲生物的必需基因常可成為本發明的方法的靶標。因此，在一個實施方 案中，所述RNA分子與非害蟲物種直向同源基因的對應核苷酸序列具有低于12. 5%的序列 一致性。
[0195] 在另一實施方案中，本發明涉及用于控制昆蟲生長和/或防止或降低昆蟲侵害的 組合物，該組合物包含至少一種雙鏈RNA，其中所述雙鏈RNA包含退火的互補鏈，其中一條 退火互補鏈包含與昆蟲靶基因的核苷酸序列之至少一部分互補的核苷酸序列。本發明還涉 及包含本文所述的至少一種核苷酸序列或至少一種重組DNA構建體的組合物。本發明還涉 及包含至少一種細菌細胞或酵母細胞的組合物，所述細菌細胞或酵母細胞表達本文所述的 至少一種雙鏈RNA或雙鏈RNA構建體，或者表達本文所述的至少一種核苷酸序列或重組DNA 構建體。任選地，所述組合物還包含至少一種適當的載體、賦形劑或稀釋劑。所述靶基因可 以是本文所述的任一靶基因。優選地，所述昆蟲靶基因是昆蟲生存、生長、發育或繁殖所必 需的。
[0196] 另一方面，本發明涉及如上所述的組合物，其中所述昆蟲靶基因包含與選自如 下表示的的任意序列具有至少75 %，優選至少80 %、85 %、90 %，更優選至少95 %、98 % 或99%的一致性的序列：SEQIDN01，3,5,7,9，11，13，15，17，19,21，23,49 至158，159， 160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,240 至 247,249， 251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,508 至 513,515,517， 519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773， 778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892， 894,896,908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075,1077,1079， 1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109， 1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622， 1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688， 1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060， 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339， 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476， 2481或2486,或其互補序列，或者其中所述昆蟲靶基因是包含如下表示的任意序列之至 少17個連續核苷酸的基因的昆蟲直系同源物：SEQ ID N01，3,5,7,9，ll，13，15，17，19,21， 23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230， 240 至 247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,508 至 513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883， 888,890,892,894,896,908至 1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075， 1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105， 1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612， 1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684， 1686.1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050， 2055, 2060, 2065, 2070,2075, 2080, 2085, 2090,2095, 2100, 2102, 2104, 2106,2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466， 2471，2476, 2481或2486,或其互補序列。
[0197] 本發明還涉及組合物，其包含至少一種雙鏈RNA、至少一種雙鏈RNA構建體、至少 一種核苷酸序列、至少一種重組DNA構建體和/或至少一種表達本發明的dsRNA的宿主細 胞（例如，細菌細胞或酵母），或者編碼本發明的dsRNA的病毒，任選地還包含至少一種適當 的載體、賦形劑或稀釋劑。
[0198] 所述組合物可以采用向昆蟲應用的任何適當的物理形式。例如，所述組合物可以 采用固體形式（如粉劑、丸劑或餌劑）、液體形式（如，噴霧劑）或凝膠形式。
[0199] 根據非常優選的實施方案，所述組合物采用適于昆蟲攝食的形式。
[0200] 所述組合物可包含另外的組分，所述組分作用于在組合物長期儲存期間穩定所述 dsRNA和/或防止dsRNA降解。
[0201] 所述組合物還可包含增強或促進昆蟲攝取所述dsRNA的組分。這些可包括例如通 常促進RNA攝取進入細胞的化學試劑，例如lipofectamin (脂轉染胺）等。
[0202] 所述組合物還可包含在長期儲存期間保持所述宿主細胞生存力的組分。
[0203] 所述組合物可采取向昆蟲、基層、細胞（例如，植物細胞）或者被昆蟲感染的或對 昆蟲侵害敏感的生物應用的任何適當的物理形式。
[0204] 在一個實施方案中，所述組合物可以采用噴霧劑的形式。因此，使用者可以直接用 該組合物噴灑昆蟲或基層。
[0205] 因此，本發明涉及噴霧劑，其包含含有至少一種細菌細胞或酵母細胞的組合物，所 述細菌細胞或酵母細胞表達本文所述的至少一種雙鏈RNA或雙鏈RNA構建體，或表達本文 所述的至少一種核苷酸序列或重組DNA構建體。更特別地，本發明涉及如上定義的噴霧劑， 其中所述細菌細胞包含如下表示的任意序列之至少一種序列：SEQ ID N01，3,5,7,9，ll， 13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208， 215,220,225,230,240 至 247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488， 493,498,503,508 至 513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603， 605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863， 868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099， 1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597， 1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672， 1677.1682.1684.1686.1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039， 2040,2045, 2050,2055,2060,2065,2070,2075,2080, 2085,2090,2095,2100,2102,2104， 2106, 2108, 2120 至 2338,2339, 2344, 2349, 2354, 2359,2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至2460，2461，2466，2471，2476、2481或2486，或其至少17個連續核苷酸的片段。優選地，所 述噴霧劑包含至少一種如下表示的任意序列：SEQ ID N01，3,5,7,9，ll，13，15，17，19,21， 23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230， 240 至 247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,508 至 513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883， 888,890,892,894,896,908至 1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075， 1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105， 1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612， 1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684， 1686.1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050， 2055, 2060, 2065, 2070,2075, 2080, 2085, 2090, 2095,2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466， 2471，2476、2481或2486,或其至少17個連續核苷酸的片段。
[0206] 本發明還涉及噴霧劑，其包含本文所述的至少一種組合物或者包含至少一種宿主 細胞，還包含至少一種佐劑以及任選地至少一種表面活性劑。
[0207] 殺蟲劑的有效性可取決于所述噴霧劑應用的有效性。佐劑可以減少或消除噴霧劑 應用的許多問題，所述問題與殺蟲劑的穩定性、溶解度、不相容性、懸浮、泡沫形成、飄移、蒸 發、揮發、降解、粘附、滲透、表面張力和覆蓋范圍有關。將佐劑設計成實現特定的功能，包括 潤濕、分散（spread)、粘著、降低蒸發、降低揮發、緩沖、乳化、散布（disperse)、降低噴霧劑 飄移以及減少泡沫形成。沒有一種佐劑可以實現所有這些功能，然而常常可以將不同的相 容性佐劑進行組合來同時實現多種功能。這些化學品（也叫作潤濕劑和分散劑）從物理上 改變了噴霧劑液滴的表面張力。為了使殺蟲劑正確地發揮其功能，噴霧劑液滴必須能夠使 葉子潤濕并在葉上均勻散開。表面活性劑擴大了殺蟲劑覆蓋的范圍，從而增加了害蟲接觸 化學試劑的機會。將殺蟲劑施加于蠟質或具毛的葉時，表面活性劑尤為重要。不進行適當 的潤濕和分散，則噴霧劑液滴常常流失或者不能充分地覆蓋這些表面。然而，過多的表面活 性劑可導致過度的流失或沉淀損失，因此降低了殺蟲劑的功效。殺蟲劑配方常包含表面活 性劑以改進該殺蟲劑活性成分的懸浮。這尤其用于可乳化濃縮物（EC)配方。
[0208] 本文使用的術語"佐劑"指添加至殺蟲劑產品或殺蟲劑噴霧劑混合物以改進噴霧 箱中產品的混合和穩定性以及應用的任何非殺蟲劑材料。本文另外使用的術語"表面活性 劑"指改變表表面張力的化學試劑。表面活性劑可以影響液體的潤濕和分散，并且可以改變 殺蟲劑在水中的分散、懸浮或沉淀。存在非離子型表面活性劑（不帶電荷）、陰離子表面活 性劑（負電荷）和陽離子表面活性劑（正電荷）。
[0209] 在特別的實施方案中，所述噴霧劑中包含的所述宿主細胞是滅活的，例如通過熱 滅活或者機械破壞（如本文所詳細討論地）來實現。
[0210] 所述賦形劑的性質和所述組合物的物理形式可根據期望處理的基層的性質而變 化。例如，所述組合物可以是被刷至或噴灑至待處理的物品或基層上或者壓印至待處理的 物品或基層中的液體，抑或是應用于待處理的物品或基層的涂層或粉末。因此，在一個實施 方案中，所述組合物在適當的表面上采用涂層的形式，其粘附昆蟲并最終被接觸該涂層的 昆蟲所攝取。
[0211] 根據一個優選的實施方案，所述基層是意在針對昆蟲害蟲侵害而進行處理的植物 或作物。然后，所述組合物被昆蟲內化或攝食，在其中該組合物可以介導RNA干擾，從而防 治昆蟲。所述噴霧劑優選為加壓的/氣霧狀的噴霧劑或泵式噴霧劑。所述顆粒可以采取適 當的大小，從而其粘附于待處理的基層或者粘附于昆蟲，例如粘附于昆蟲和/或蛛形綱動 物的外骨骼，并可以從此處被吸收。
[0212] 在一個實施方案中，所述組合物采用餌劑的形式。設計所述餌劑使之引誘昆蟲與 所述組合物接觸。一旦接觸后，所述組合物被昆蟲內化（例如通過攝食）并介導RNAi從而 殺死昆蟲。所述餌劑可包含食物，如基于蛋白質的食物，例如魚粉。也可以使用硼酸作為餌 齊U。所述餌劑可取決于作為靶標的物種。還可以使用引誘劑。所述引誘劑可以是信息素， 例如雄性或雌性信息素。作為一個實例，本發明可使用《昆蟲信息素及其在害蟲管理中的 應用(Insect Pheremones and their use in Pest Management)》（Howse et a 1, Chapman and Hall, 1998)中提及的信息素。所述引誘劑將昆蟲引誘至所述餌劑，并可以靶向特定昆 蟲或可以引誘所有昆蟲。所述餌劑可采用任何適當的形式，如固體、糊劑、丸劑或粉劑形式。
[0213] 所述餌劑還可被昆蟲攜帶回群體。然后，該餌劑可以作為群體中其它成員的食物 來源，因而對大量昆蟲并且可能對整個昆蟲害蟲群體實現有效控制。使用雙鏈RNA或表達 本發明的dsRNA的細菌是有利的，因為RNAi介導的對害蟲影響的延遲作用使餌劑被攜帶回 群體，從而實現了在接觸昆蟲方面的最大影響。
[0214] 另外，與所述昆蟲接觸的組合物可殘留在該昆蟲的角質層上。當清潔（一只昆蟲 清潔其自身或昆蟲相互清潔）時，所述組合物可以被攝取，并可以因此介導其在昆蟲中的 作用。這需要所述組合物足夠穩定，從而即使暴露于外界環境條件一段時間（例如，可以是 幾天）后，所述dsRNA或表達dsRNA的宿主細胞仍保持完好并能夠介導RNAi。
[0215] 所述餌劑可以以適當的"外罩"或"陷阱"來提供。這樣的外罩和陷阱是市售的， 并且現有的陷阱可適于包含本發明的組合物。本發明的范圍包括可吸引昆蟲進入的任何 外罩或陷阱。所述外罩或陷阱可以例如是盒形的，并且可以例如以預成型狀態提供或者可 以由可折疊紙板形成。用于外罩或陷阱的適當的材料包括塑料和紙板，尤其是瓦楞紙板 (corrugated cardboard)。這樣的外罩或陷講的合適尺寸為例如7_15cm寬，15_20cm長以 及l-5cm高。所述陷阱的內表面可覆蓋粘性物質，使得昆蟲一旦進入該陷阱則被限制移動。 所述外罩或陷阱可包含適當的槽，所述槽的內部可以在適當的位置裝有所述餌劑。陷阱不 同于外罩是因為昆蟲在進入后不能輕易地逃離陷阱，而外罩作為"飼喂處"，其向昆蟲蛛形 綱動物提供較佳的環境，在其中它們可以進食并且感覺遠離捕食者的安全感。
[0216] 因此，本發明的另一方面提供了針對昆蟲的外罩或陷阱，其包含本發明的組合物， 該組合物可以合并本文所述組合物的任何特征。
[0217] 本發明的"組合物"可以是"組合試劑盒（kit-of-parts) "，其包含一個容器中的 所述雙鏈RNA以及一個單獨容器中的針對含有RNA的實體（如dsRNA或dsRNA構建體、DNA 構建體、表達構建體）的適當稀釋劑、賦形劑或載體；或者包含一個容器中的宿主細胞以及 一個單獨容器中的針對該宿主細胞的適當稀釋劑、賦形劑、載體或防腐劑。本發明還涉及提 供單獨的雙鏈RNA或宿主細胞，而沒有任何其它組分。在這些實施方案中，所述dsRNA或宿 主細胞可以以濃縮形式來提供，如濃縮的水溶液。它甚至可以以冷凍形式或者以凍干形式 來提供。后者對于長期保藏來說可能更穩定，并且可以在臨使用前被解凍和/或用適當的 稀釋劑復原。
[0218] 本發明還包括在基層上控制害蟲生物的生長和/或防止敏感生物被害蟲生物侵 害的方法，其包括向所述基層應用本文所述的有效量的任何組合物和/或噴霧劑。
[0219] 本發明還包括用于治療和/或預防由靶生物導致的疾病或病癥的方法，其包括向 有此治療和/或預防需要的對象施用本文所述的組合物或噴霧劑，其中由所述組合物或噴 霧劑造成的所述靶生物中靶基因的表達下調對于治療和/或預防由靶生物導致的疾病是 有效的。優選的靶生物是害蟲，尤其是本文詳細描述的昆蟲。
[0220] 本發明還涉及本文所述的任何雙鏈RNA、雙鏈RNA構建體、核苷酸序列、重組DNA構 建體或組合物的醫學用途。
[0221] 昆蟲和另一些節肢動物可通過其叮咬或螫刺而導致損傷甚至死亡。在美國，每年 由于蜜蜂和黃蜂螫傷而死亡的人比被蛇咬傷而死亡的人更多。許多昆蟲可以傳播導致疾病 的細菌和其它病原體。在每次國家間大規模戰爭期間，由于昆蟲傳播的疾病而受傷或死去 的人比由于子彈和炸彈而受傷或死去的人更多。叮咬人和家畜的昆蟲大多是具有如半翅目 和某些雙翅目昆蟲中所見的刺吸式口器的昆蟲。叮咬引起的主要不適是由昆蟲注入對象的 酶所致。蜱和恙螨是不同種類的螨（蛛形綱），其以動物血液為食。蜱還可以傳播導致疾 病的病毒和另一些病原體，所述疾病包括萊姆病和落肌山斑疫熱。另一些種類的螨可引起 人、犬、貓和其它動物的獸擠癬。半翅目包括床風、接吻蟲（kissing bug)和獵蝽（assassin bug)，所有這些昆蟲具有用于刺入其宿主的喙。所有昆蟲中最疼痛的叮咬是獵蝽的叮咬。 在中美州和南美洲，接吻蟲參與導致查加斯病。某些蛾的毛蟲可以"螫刺"。雙翅目是影響 人類的最重要的昆蟲目。叮咬飛蟲（biting flies)包括多種蚊、蚋、biting gnats、蛇等。 這些叮咬飛蟲中有許多是疾病的傳播者，如傳播非洲睡眠病的舌蠅。具有舐吸式口器的蠅 (如家蠅）也傳播導致傷寒熱及另一些疾病的細菌和其它病原體。蛆是這兩種侵入動物活 組織的飛蟲的幼蟲。蚊子傳播導致瘧疾、黃熱病、腦炎和另一些疾病的病原體。瘧疾由原生 動物寄生物導致，所述原生動物寄生物的部分生活周期生活在按蚊屬蚊中，部分生活周期 生活在人中。鼠疫也叫作腺鼠疫或黑死病，由感染大鼠及另一些嚙齒動物的細菌導致。該 疾病針對人的主要轉播者是東方具帶病蚤（Oriental rat flea)(蚤目）。許多蜜蜂、黃蜂 和螞蟻（膜翅目）可通過其螫刺導致疼痛甚至死亡。死亡通常是對毒物的變態反應的結 果。其它重要的螫刺動物包括大黃蜂（hornets)、小黃蜂（yellow jackets)和胡蜂（paper wasps)。非洲化蜜蜂（Africanized honey bee)或"殺人蜂"（"killer"bee)是人類馴化 的蜜蜂品系。這兩種品系在外觀上幾乎相同。然而，非洲化蜜蜂品系更具攻擊性，并且以更 大的數目進行攻擊。
[0222] 在一個具體的實施方案中，所述組合物是分別用于治療或預防人類或動物的昆蟲 疾病或感染的藥物組合物或獸用藥組合物。這樣的組合物包含至少一種雙鏈RNA或RNA構 建體，或者編碼所述雙鏈RNA或RNA構建體的核苷酸序列或重組DNA構建體（其中所述雙 鏈RNA包含退火的互補鏈，其中一條退火互補鏈包含與導致所述疾病或感染的昆蟲靶基因 的靶核苷酸序列互補的核苷酸序列）以及適用于藥物用途的至少一種載體、賦形劑或稀釋 劑。
[0223] 所述組合物可以是適于局部使用的組合物，如應用在動物或人的皮膚上，例如應 用于皮膚的液體組合物（滴劑、凝膠劑、氣霧劑），或者通過刷、或噴霧劑、乳劑、軟膏等用于 局部應用，或者作為透皮貼劑。
[0224] 或者，所述昆蟲dsRNA由細菌（例如，乳桿菌屬）或真菌（例如酵母屬 (Sacharomyces)物種）產生，其可以包含在食物中并作為抗御昆蟲感染的口服疫苗。
[0225] 也可以制備成其它常規的藥物劑型，包括片劑、膠囊、陰道栓劑、透皮貼劑、栓劑 等。所選形式取決于靶昆蟲的性質以及期望治療的疾病的性質。
[0226] 在一個具體的實施方案中，所述組合物可以是涂層、糊劑或粉劑，其可以應用于基 層從而保護所述基層免受昆蟲和/或蛛形綱動物的侵害。在該實施方案中，可使用所述 組合物保護對昆蟲侵害或昆蟲造成的破壞敏感的任何基層或物品，例如食物及其它易腐 物品，以及基層（如木材）。白蟻、粉蠹甲蟲和木匠蟻可破壞房屋及其它木制品。散白蟻 (subterranean termite)和臺灣乳白蟻（Formosan termite)是美國南部和熱帶地區最嚴 重的房屋害蟲。昆蟲可以襲擊任何收獲的植物或動物產品。面象蟲、谷類象鼻蟲、谷螟及其 它儲藏品害蟲以儲藏的糧食、谷類、寵物食品、巧克力粉以及廚房食品柜中未得到保護的幾 乎所有其它食物為食。衣服蛀蟲的幼蟲蛀蝕由動物產品（如毛皮、絲和羊毛）制成的衣服。 地毯甲蟲的幼蟲蛀蝕動物和植物產品，包括皮革、毛皮、棉花、儲存的糧食甚至博物館標本。 書虱和蠹蟲是圖書館的害蟲。這些昆蟲蛀蝕書裝訂處的淀粉膠。侵入房屋的其它昆蟲包括 蟑螂，其攝食幾乎任何東西。蟑螂不被認為是疾病的特定傳播者，但是它們污染食物并帶有 令人不悅的氣味。它們非常令人討厭，許多害蟲防治公司致力于嘗試對它們進行防治。在 房屋、食品商店和飯店中的最常見的蟑螂包括德國小蠊、美洲大蠊、東方蜚蠊和長須蜚蠊。
[0227] 所述組合物的賦形劑和物理形式的性質可取決于期望處理的基層的性質而有所 變化。例如，所述組合物可以是被刷或噴灑至待處理的物品或基層上的液體，或者壓印至待 處理的物品或基層中的液體，或者是應用至待處理的物品或基層的涂層。
[0228] 本發明還包括用于處理和/或防治昆蟲對基層侵害的方法，其包括向所述基層應 用有效量的任何本文所述的組合物或噴霧劑。
[0229] 本發明還包括用于治療和/或預防昆蟲疾病或病癥的方法，其包括向有此治療和 /或預防需要的對象施用本文所述的任何組合物或噴霧劑，所述組合物或噴霧劑包含至少 一種雙鏈RNA或雙鏈RNA構建體，其包含退火的互補鏈，其中一條退火互補鏈包含與導致所 述昆蟲疾病或病癥的昆蟲的昆蟲靶基因核苷酸序列之至少一部分互補的核苷酸序列。根據 一個更具體的實施方案，所述待施用的組合物或噴霧劑包含和/或表達至少一種細菌細胞 或酵母細胞，所述細菌細胞或酵母細胞表達本文所述的至少一種雙鏈RNA或雙鏈RNA構建 體；或者包含和/或表達本文所述的至少一種核苷酸序列或重組DNA構建體，所述RNA或核 苷酸序列與導致所述昆蟲疾病或病癥的昆蟲的昆蟲靶基因之至少一部分核苷酸序列是互 補的。
[0230] 在本發明的另一實施方案中，所述組合物用作植物或者植物的增殖或繁殖材料 (如種子）的殺蟲劑。舉例來說，所述組合物可通過向植物組織噴灑或應用或者在幼苗出苗 前后向土壤噴灑或混合而用作殺蟲劑。
[0231] 在另一實施方案中，本發明提供了用于處理和/或阻止昆蟲生長和/或昆蟲侵害 植物或者植物的增殖或繁殖材料的方法，其包括向植物或者向植物的增殖或繁殖材料應用 有效量的任何本文所述的組合物或噴霧劑。
[0232] 在另一實施方案中，本發明涉及任何雙鏈RNA或RNA構建體、或者編碼所述雙鏈 RNA或RNA構建體的核苷酸序列或重組DNA構建體、或者表達本發明的dsRNA的至少一種宿 主細胞（例如，細菌或酵母）、或者編碼本文所述的dsRNA的病毒、或者包含上述的任何組合 物或噴霧劑的用途，其用于控制昆蟲生長，用于防治昆蟲侵害對昆蟲感染敏感的植物，或用 于處理植物的昆蟲感染。針對特定昆蟲導致的昆蟲感染而進行處理的特定植物如前所述， 并包含在所述用途中。
[0233] 在一個更具體的實施方案中，本發明涉及包含至少一種宿主細胞，或表達本發明 的dsRNA的至少一種宿主細胞（例如，細菌或酵母），或編碼本文所述的dsRNA的病毒，或者 涉及包含上述的任何組合物的噴霧劑的用途，該噴霧劑用于控制昆蟲生長，用于防治昆蟲 侵害對昆蟲感染敏感的植物，或用于治療植物的昆蟲感染。優選地，所述宿主細胞包含如下 表示的任意序列之至少一種：SEQ ID 勵1，3,5,7,9，11，13，15，17，19,21，23,49至158，159， 160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,240 至 247,249， 251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,508 至 513,515,517， 519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773， 778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892， 894,896,908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075,1077,1079， 1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109， 1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622， 1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688， 1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060， 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339， 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476， 2481或2486,或其至少17個連續核苷酸的片段。
[0234] 另一方面，本發明還提供了用于防止或保護植物免受害蟲侵害的方法組合和組合 物。例如，一種方法提供了使用轉基因方法與使用雙鏈RNA分子以及與一種或多種對靶標 害蟲具有毒性的Bt殺蟲蛋白或化學的（有機的）化合物的組合物的方法組合。另一方法 提供了使用轉基因方法與使用在細菌或酵母中表達雙鏈RNA分子以及在同樣的細菌或酵 母中或者在不同的細菌或酵母中表達所述Bt殺蟲蛋白的方法的組合。例如根據這些方法， 可以使用基于RNAi的方法或技術來靶向或殺死一種昆蟲，而使用Bt殺蟲劑或化學的（有 機的）殺蟲劑可以靶向或殺死另一種昆蟲。
[0235] 因此，本發明還涉及本文所述的用于處理植物的任何組合物、噴霧劑或方法，其中 所述組合物包含表達所述RNA分子的細菌細胞或酵母,并且還包含殺蟲劑或者包含含有或 表達殺蟲劑的細菌細胞或酵母細胞（可以與上面提及的是同一細菌或酵母細胞或者不同 的細菌或酵母細胞），所述殺蟲劑選自化學的（有機的）殺蟲劑、馬鈴薯糖蛋白、蘇云金芽孢 桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌殺蟲蛋白、光桿狀菌殺蟲蛋白、側抱芽抱桿菌殺蟲蛋白和球形芽抱 桿菌殺蟲蛋白。優選地，所述蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白選自：Cryl、Cry3、TIC851、CryET170、 Cry22、二元殺蟲蛋白CryET33和CryET34、二元殺蟲蛋白CryET80和CryET76、二元殺蟲蛋 白TIC100和TIC101以及二元殺蟲蛋白PS149B1。
[0236] 所述噴霧劑可用于溫室中或農田上。對于水基噴霧劑來說，包含細菌的生物殺蟲 劑（例如，作為可乳化的混懸液）的通常應用率為25-100升/公頃（10-40升/英畝）：每 公頃包含約2. 5-5升的配制產品（可乳化的混懸液），其中所述配制產品包含約25% (體 積/體積）的'細菌細胞'加75% (體積/體積）的'其它成分，。細菌細胞的量以單位來 計，例如一個單位定義為lml中109個細菌細胞。取決于每公頃的作物密度和每株植物的葉 面積，1升的配制產品包含〇. 001?10000個單位的細菌，優選地至少〇. 〇〇l、〇. 003、0. 005、 0· 007、0· 01、0· 03、0· 05、0· 07、0· 1、0· 3、0· 5、0· 7,更優選至少 1、3、5、7、10、30、50、70、100、 300、500、700，或者更優選至少1000、3000、5000、7000或者10000個單位的細菌。
[0237] 例如，馬鈴薯作物植物的通常植物密度約為每平方米4. 5株植物或者每公頃 45, 000株植物（成排種植，排與排之間距離為75cm，每排的植物之間距離為30cm)。因此，本 發明涉及噴霧劑，其包含至少 〇· 〇〇1、〇· 003、0· 005、0· 007、0· 01、0· 03、0· 05、0· 07、0· 1、0· 3、 〇· 5、0· 7,更優選至少 1、3、5、7、10、30、50、70、100、300、500、700,或者更優選至少 1000、 3000、5000、7000或者10000個單位的細菌，所述細菌表達本文所述的至少一種dsRNA分子 或dsRNA構建體。
[0238] 本發明還涉及用于處理植物中昆蟲感染的試劑盒，其包含先前所述的至少一種雙 鏈RNA、或雙鏈RNA構建體、或核苷酸序列、或重組DNA構建體、或宿主細胞、或組合物或噴霧 齊U。所述試劑盒可以與適當的使用說明書一起提供。該說明書可印刷在提供其它組分的合 適的包裝上，或者可作為單獨的實體來提供，例如可以采用紙頁或小冊子的形式。該說明書 可以卷起或折疊（例如在儲存狀態時），然后可以將其展開從而指導所述試劑盒其余組分 的用途。
[0239] 參考以下非限制性實施例將進一步理解本發明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0240] 圖1-LD :使用以dsRNA處理的人工飼料喂食的馬鈴薯葉甲的存活。使用以50 μ 1 局部應用的dsRNA(靶標或gfp對照）溶液處理的飼料喂食第二幼蟲階段的昆蟲。7天后， 將飼料替換為包含局部應用的dsRNA的新鮮飼料。在第2、5、7、8、9和13天評估存活昆蟲 數。相對于第〇天（測定開始時）來計算存活幼蟲的百分比。靶標LD006:(SEQ ID N0178); 靶標 LD007(SEQ ID N0183);靶標 LD010(SEQ ID N0188);靶標 LD011(SEQ ID N0193);靶標 LD014(SEQ ID N0198) ;gfp dsRNA(SEQ ID N0235)。
[0241] 圖2-LD :使用以dsRNA處理的人工飼料喂食的馬鈴薯葉甲的存活。使用以50 μ 1 局部應用的dsRNA(靶標或gfp對照）溶液處理的飼料喂食第二幼蟲階段的昆蟲。7天后， 將飼料替換成僅為新鮮飼料。在第2、5、6、7、8、9、12和14天評估存活昆蟲數。相對于第0 天（測定開始時）來計算存活幼蟲的百分比。靶標LD001(SEQ ID N0163);靶標LD002(SEQ ID N0168);靶標 LD003(SEQ ID N0173);靶標 LD015(SEQ ID N0215);靶標 LD016(SEQ ID N0220) ;gfp dsRNA(SEQ ID N0235)。
[0242] 圖3-LD :使用用dsRNA處理的馬鈴薯葉盤喂食的馬鈴薯葉甲幼蟲的平均重量。使 用以20 μ 1局部應用的dsRNA (靶標LD002或gfp)溶液（10ng/ μ 1)處理的葉盤喂食第二 幼蟲階段的昆蟲。2天后，每天將昆蟲轉移至未經處理的葉子上。
[0243] 圖4-LD :使用以較短形式的靶標LD014dsRNA和多聯體dsRNA處理的人工飼料喂 食的馬鈴薯葉甲的存活。使用以50 μ 1局部應用的dsRNA (gfp或靶標）溶液處理的飼料喂 食第二幼蟲階段的昆蟲。在第3、4、5、6和7天評估存活昆蟲數。相對于第0天（測定開始 時）來計算存活幼蟲的百分比。
[0244] 圖5-LD :使用以不同濃度的dsRNA (靶標LD002 (a)、靶標LD007 (b)、靶標 LD010(c)、靶標 LDOll(d)、靶標 LD014(e)、靶標 LD015(f)、LD016(g)和靶標 LD027(h))處 理的人工飼料喂食的馬鈴薯葉甲幼蟲的存活。使用以50 μ 1局部應用的dsRNA溶液處理的 飼料喂食第二幼蟲階段的昆蟲。7天后，將飼料替換為包含局部應用的dsRNA的新鮮飼料。 以固定的時間間隔評估存活昆蟲數。相對于第〇天（測定開始時）來計算存活幼蟲的百分 比。
[0245] 圖6-LD.表達dsRNA (靶標LD010)的大腸桿菌菌株對馬鈴薯葉甲幼蟲存活的隨時 間的影響。在基于人工飼料的分別的生物測定中檢測兩株細菌菌株：（a)AB301-105(DE3)， PGBNJ003和pGN29的數據點表示來自5個不同細菌克隆的平均死亡率值，（b)BL21 (DE3)， PGBNJ003和pGN29的數據點分別表示來自5個不同的細菌克隆以及一個單獨的細菌克隆的 平均死亡率值。誤差條線代表標準差。
[0246] 圖7-LD.表達dsRNA (靶標LD010)的大腸桿菌菌株的不同克隆（a) ΑΒ301-105ΦΕ3)和（b)BL21(DE3)在侵害后12天對馬鈴薯葉甲幼蟲存活的影響。數據點 是PGN29和pGBNJ003的每個克隆的平均死亡率值。在該時間點，包含質粒pGBNJ003的 ΑΒ301-105ΦΕ3)克隆1顯示出CPB100%死亡率。誤差條線代表標準差。
[0247] 圖8-LD.表達dsRNA (靶標LD010)的大腸桿菌菌株的不同克隆（a) ΑΒ301-105ΦΕ3)和（b)BL21(DE3)在侵害后7天對存活的馬鈴薯葉甲幼蟲的生長和發育的 影響。基于表10的數據，數據點是每個克隆（一個PGN29克隆和5個pGBNJ003克隆）的 幼蟲平均重量值的百分數。只用飼料處理代表100%的正常幼蟲重量。
[0248] 圖9-LD.喂食馬鈴薯植物的馬鈴薯葉甲幼蟲在侵害后7天的存活，所述馬鈴薯植 物用產生雙鏈RNA的細菌噴灑。計算存活幼蟲數并表示為死亡率百分數。所使用的細菌宿 主菌株是RNA聚合酶III缺陷型菌株AB301-105 (DE3)。昆蟲基因靶標是LD010。
[0249] 圖10-LD.喂食馬鈴薯植物的存活的馬鈴薯葉甲幼蟲在侵害后11天的生長/發 育延遲，所述馬鈴薯植物用產生dsRNA的細菌噴灑。所使用的細菌宿主菌株是RNA聚合酶 III缺陷型菌株ΑΒ301-105ΦΕ3)。數據圖表示正常幼蟲重量的百分比，只用飼料的處理代 表100%的正常幼蟲重量。昆蟲基因靶標是LD010。誤差條線代表標準差。
[0250] 圖11-LD.在侵害后7天，產生雙鏈RNA的細菌對馬鈴薯葉甲幼蟲導致的馬鈴薯損 傷的抗性。左圖，用含有PGN29質粒的7個單位的細菌ΑΒ301-105ΦΕ3)噴灑植物；右圖，用 含有PGBNJ003質粒的7個單位的細菌ΑΒ301-105ΦΕ3)噴灑植物。一個單位定義為在600nm 0D值為1的lml細菌懸液的等價物。昆蟲基因靶標為LD010。
[0251] 圖12-LD.使用以dsRNA處理的馬鈴薯葉盤喂食的馬鈴薯葉甲成蟲的存活。開 始兩天使用以雙鏈RNA處理的葉盤喂食年幼成蟲，然后將其置于未經處理的馬鈴薯葉上。 定期評估存活昆蟲數；活的并且看起來運動正常的昆蟲記錄為可動的昆蟲；活的但似乎有 病且運動緩慢的昆蟲記錄為瀕死的昆蟲--一旦將其背部朝下，這些昆蟲不能翻身。靶 標 LD002(SEQ ID N0168);靶標 LD010(SEQ ID N0188);靶標 LD014(SEQ ID N0198);靶標 LD016(SEQ ID N0220) ;gfp dsRNA(SEQ ID N0235)。
[0252] 圖13-LD.細菌產生的靶標雙鏈RNA對馬鈴薯葉甲幼蟲的影響。將0D為1的經熱 處理的表達dsRNA(SEQ ID N0188)的50μ1細菌ΑΒ301-105ΦΕ3)懸液局部應用于48孔板 每個孔中的固體人工飼料上。將L2階段的CPB幼蟲置于每個孔中。在第7天，對包含（a) 含有表達靶標10雙鏈RNA的細菌的飼料，（b)含有空載體pGN29的細菌的飼料，以及（c)只 有飼料的平板中的CPB幼蟲進行拍照。
[0253] 圖14-LD.在昆蟲侵害前，將不同量的含有質粒pGBNJ003的滅活大腸桿菌 ΑΒ301-105ΦΕ3)菌株局部應用于馬鈴薯葉對CPB幼蟲存活和生長的影響。用經處理的馬鈴 薯喂食10只L1幼蟲7天。噴灑在植物上的細菌懸液的量為：0. 25U、0. 08U、0. 025U、0. 008U 的靶標10以及0. 25U的pGN29 (陰性對照；還包含Milli-Q水）。一個單位（U)定義為與在 600nm吸光度值為1的lml培養物中等量的細菌量。將1. 6ml總體積噴灑至每株植物上。 昆蟲基因靶標為LD010。
[0254] 圖15-LD在侵害后7天，含有質粒pGBNJ003的滅活大腸桿菌ΑΒ301-105ΦΕ3) 菌株對CPB幼蟲導致的馬鈴薯損傷的抗性。（a)水，（b)包含pGN29的0. 25U大腸桿 菌 AB301-105 (DE3)，（c)含有 pGBNJ003 的 0· 025U 大腸桿菌 AB301-105 (DE3)，（d)含有 PGBNJ003的0. 008U大腸桿菌AB301-105 (DE3)。一個單位（U)定義為與在600nm吸光度值 為1的lml培養物等量的細菌量。將1. 6ml總體積噴灑至每株植物上。昆蟲基因靶標為 LD010。
[0255] 圖1-PC :喂食靶標dsRNA對辣根猿葉甲幼蟲的存活和生長的影響。使用以25 μ 1 局部應用的〇. 1 μ g/ μ ldSRNA(靶標或gfp對照）溶液處理的油菜葉盤喂食新生幼蟲。2天 后，將所述昆蟲移至新鮮的經dsRNA處理的葉盤上。在第4天，針對每種處理收集來自一次 重復實驗的幼蟲，并置于含有未經處理的新鮮油菜葉的培養皿中。在第2、4、7、9和11天評 估所述昆蟲。（a)使用以dsRNA處理的油菜葉盤喂食的墨西哥豆瓢蟲幼蟲的存活。相對于 第〇天（測定開始時）來計算存活幼蟲百分比，（b)使用以dsRNA處理的油菜葉盤喂食的辣 根猿葉甲幼蟲的平均重量。一起稱重來自每次重復的昆蟲并確定每只幼蟲的平均重量。誤 差條線代表標準差。靶標1 :SEQ ID473 ;靶標3 :SEQ ID N0478 ;靶標5 :SEQ ID N0483 ;靶 標 10 :SEQ ID N0488 ;靶標 14 :SEQ ID493 ;靶標 16 :SEQ ID N0498 ;靶標27 :SEQ ID N0503 ; gfp dsRNA ：SEQ ID N0235〇
[0256] 圖2-PC :使用以不同濃度dsRNA(a)靶標PC010和（b)靶標PC027處理的油菜葉 盤喂食辣根猿葉甲的存活。將初生幼蟲置于用25 μ 1局部應用的dsRNA溶液處理的油菜葉 盤上。在第2天，將昆蟲移至經處理的新鮮葉盤上。在第4天（針對靶標PC010)和第5天 (針對靶標PC027)，將昆蟲移至未經處理的葉子。在第2、4、7、8、9和11天（針對PC010) 和第2、5、8、9和12天（針對PC027)評估昆蟲的存活數。相對于第0天（測定開始時）來 計算存活幼蟲的百分比。
[0257] 圖3-PC :表達dsRNA (靶標PC010)的大腸桿菌AB301-105 (DE3)菌株對辣根猿葉 甲幼蟲存活的隨時間的影響。每種處理的數據點表示來自3次不同重復實驗的平均死亡率 值。誤差條線表示標準差。靶標10 :SEQ ID N0488。
[0258] 圖1-EV :使用以dsRNA處理的豆葉盤喂食的墨西哥豆瓢蟲的存活。使用以25 μ 1 局部應用的1 μ g/ μ 1 dsRNA (靶標或gfp對照）溶液處理的豆葉盤喂食初生幼蟲。2天后， 將所述昆蟲移至經dsRNA處理的新鮮葉盤上。在第4天，收集來自一種處理的幼蟲，并置于 含有未經處理的新鮮豆葉的塑料盒中。在第2、4、6、8和10天評估昆蟲的死亡率。相對于 第〇天（測定開始時）來計算存活幼蟲的百分比。靶標5 :SEQ ID N0576 ;靶標10 :SEQ ID N0586 ;靶標 15 :SEQ ID N0591 ;靶標 16 :SEQ ID N0596 ;gfp dsRNA :SEQ ID N0235。
[0259] 圖2-EV :喂食靶標dsRNA對墨西哥豆瓢蟲成蟲的存活的影響，以及對食莢菜豆葉 的昆蟲侵害的抗性。（a)使用以dsRNA處理的豆葉盤喂食的墨西哥豆瓢蟲成蟲的存活。使 用以75 μ 1局部應用的0. 1 μ g/μ 1 dsRNA (靶標或gfp對照）溶液處理的豆葉盤喂食成蟲。 24小時后，將昆蟲移至經dsRNA處理的新鮮葉盤上。再過24小時后，收集來自一種處理的 成蟲，并置于包含未經處理的新鮮的盆栽整株豆植物的塑料盒中。在第4、5、6、7、8和11天 評估昆蟲的死亡率。相對于第0天（測定開始時）來計算存活幼蟲的百分比。靶標10 :SEQ ID N0586 ;靶標 15 :SEQ ID N0591 ;靶標 16 :SEQ ID N0596 ;gfp dsRNA :SEQ ID N0235。（b) dsRNA對墨西哥豆瓢蟲成蟲所造成豆葉損傷的抗性。在第9天，目測檢查包含來自一種處理 (參見（a))的昆蟲的整株植物的葉損傷。⑴祀標10 ; (ii)祀標15 ; (iii)祀標16 ; (iv) gfp dsRNA ;(v)未處理。
[0260] 圖1-TC :使用以dsRNA(靶標14)處理的人工飼料喂食的赤擬谷盜的存活。基于含 有lmg dsRNA (靶標14)的面粉/奶混合物喂食初生幼蟲。飼料中的水（不含dsRNA)是對 照。針對每種處理，進行4次重復實驗，每次重復實驗使用10只1齡幼蟲。在第6、17、31、 45和60天評估昆蟲的存活的平均數百分比。相對于第0天（測定開始時）來計算存活幼 蟲的百分比。誤差條線代表標準差。靶標TC014:SEQ ID N0878。
[0261] 圖1-MP :攝取dsRNA(靶標27)對桃蚜若蟲存活的影響。將1齡昆蟲置于包含50μ 1 液態飼料（含有2 μ g/ μ 1 dsRNA (靶標27或gfp dsRNA對照））的喂料室中。針對每種處 理，建立5個喂料室，其中每個喂料室包括10只齡蟲。在生物測定開始后的第8天評估存 活數。誤差條線代表標準差。靶標 MP027:SEQ ID N01061;gfp dsRNA:SEQ ID N0235。
[0262] 圖1-NL :使用以dsRNA處理的液體人工飼料喂食的褐飛虱的存活。在分別的生 物測定中用補充有2mg/ml dsRNA靶標的溶液的飼料喂食第一至第二幼蟲階段的若蟲：(a) NL002、NL003、NL005、NL010 ;(b)NL009、NL016 ;(c)NL014、NL018 ;(d)NL013、NL015、NL021。 昆蟲針對靶標的存活與喂食相同濃度的只有飼料和含有gfp dsRNA對照的飼料進行比較。 每兩天將飼料替換為含有dsRNA的新鮮飼料。每天評估存活昆蟲數。
[0263] 圖2-NL :使用以不同濃度的靶標dsRNA(NL002)處理的液體人工飼料喂食的褐飛 虱的存活。用補充有l、〇. 2、0. 08和0. 04mg/ml (終濃度）NL002的飼料喂食第一至第二幼 蟲階段的若蟲。每兩天將飼料替換為含有dsRNA的新鮮飼料。每天評估存活昆蟲數。

【具體實施方式】
[0264] 實施例
[0265] 實施例1 :在高通量篩詵中沉默秀麗隱桿線蟲中的靶某閔
[0266] 在pGN9A載體（W001/88121)中相同的兩個T7啟動子和終止子之間制備秀麗隱桿 線蟲基因組范圍的文庫，其在T7聚合酶表達的情況下通過IPTG誘導而驅動有義和反義方 向的表達。
[0267] 以96孔板的形式，將此文庫轉化入ΑΒ301-105ΦΕ3)細菌菌株。為了在基因組范 圍進行篩選，用這些細菌細胞喂食核酸酶缺陷型秀麗隱桿線蟲nuc-1 (el392)株。
[0268] 遵循下述步驟，在96孔板中用所述AB301-105(DE3)細菌菌株中產生的dsRNA喂 食秀麗隱桿線蟲nuc-1 (el392):將nuc-1卵移至不同的板中，并使其在20°C同時孵化從而 使L1代同步化。將包含IPTG的100 μ L液體生長培養基以及含有秀麗隱桿線蟲dsRNA文 庫的〇D_l的10μ L ΑΒ301-105ΦΕ3)細菌細胞培養物加至96孔板中，所述文庫中每個載 體包含用于表達所述dsRNA的秀麗隱桿線蟲基因組片段。將4只同步化的L1線蟲加至每 個孔中，在25°C孵育至少4至5天。這些實驗一式四份進行。在所述篩選中使用了 6種對 昭. >、?、 ·
[0269] -pGN29 =陰性對照，野生型
[0270] -pGZl = unc-22 =顫搐表型
[0271] _pGZ18 =幾丁質合酶=胚胎致死
[0272] _pGZ25 = pos-Ι =胚胎致死
[0273] -PGZ59 = bli_4D =急性致死
[0274] -ACC =乙酰輔酶A羧化酶=急性致死
[0275] 5天后，將用產生dsRNA的細菌喂食的秀麗隱桿線蟲nuc-1 (el392)與用空載體 (PGN29)及其它對照喂食的線蟲的表型進行比較。針對親代（P0)的（急性的或幼蟲的）致 死性、子一代（F1)的（胚胎）致死性或者針對P0的生長阻滯對使用所述dsRNA喂食的線 蟲講行篩詵，具體如下：（i)P0的急件致死：L1不發育且死亡，該表型不產生后代，所述孔看 h去相當宇：（ii)P0的（幼蟲）致死：P0在比L1更晚的階段死亡，該表型也不產生后代。 在孔中發現死亡的幼蟲或死亡的成蟲；(iii)Fl致死：L1發育至成蟲階段并仍然存活。該表 型不產生后代。這可能是由于不育、胚胎致死（孔底部有死亡的卵）、胚胎停滯或幼蟲停滯 (最終致死）；(iv)牛長停滯及牛長阻滯/延遲：與包含ιΗ常發育和ιΗ常后代數的孔講行比 較。
[0276] 對于表1A中所示的靶序列來說，所得結論為：在線蟲（如秀麗隱桿線蟲）中由 dsRNA介導的秀麗隱桿線蟲靶基因沉默對線蟲的生長和存活具有重要影響。
[0277] 在上述dsRNA沉默實驗之后，在24孔板中以高通量形式對秀麗隱桿線蟲進行更細 致的表型實驗。按照如下步驟，用如上所述ΑΒ301-105ΦΕ3)細菌菌株中得到的dsRNA文庫 喂食24孔板中的秀麗隱桿線蟲nuc-1 (el392)，具體如下：將nuc-Ι卵移至不同的板中，并 使其在20°C同時孵化從而使L1代同步化。然后，將100只同步化的L1線蟲浸泡于500yL S完全喂食培養基（含有5 μ g/mL膽固醇、4 μ L/mL PEG和ImM IPTG)和包含秀麗隱桿線蟲 dsRNA文庫的0D_為1的500μ L ΑΒ301-105ΦΕ3)細菌細胞培養物的混合物中，所述文庫 中每個載體包含用于表達所述dsRNA的秀麗隱桿線蟲基因組片段。將被浸泡的L1線蟲在 25°C滾動孵育2小時。
[0278] 在離心并除去950 μ L上清液后，將所剩5 μ L經重懸的沉淀（包含約10至15只 線蟲）移至24孔板每個孔的中部，加入一層瓊脂LB液體培養基。將所接種的板在25°C孵 育2天。在成蟲階段，挑出單只成蟲并在25°C孵育2天用于檢查其后代。在最初的24孔板 上原位檢查其它線蟲成蟲。一式四份地進行這些實驗。
[0279] 用另一批線蟲重復上述細致的表型篩選，唯一的區別在于第二批線蟲在20°C孵育 3天。
[0280] 對用秀麗隱桿線蟲dsRNA喂食的線蟲之表型以及用所述空載體喂食的秀麗隱桿 線蟲nuc-1 (el392)之表型進行比較。
[0281] 基于該實驗，所得結論為：如表1A中所示秀麗隱桿線蟲靶基因的沉默對于線蟲的 生長和存活具有重要影響，所述靶基因對于線蟲的存活是必需的。因此，這些基因是利用 dsRNA介導的基因沉默來防治（殺死或阻止其生長）線蟲的理想靶基因。因此，本發明包括 上述秀麗隱桿線蟲靶基因的線蟲直向同源物用于防治線蟲侵害（例如線蟲對植物的侵害） 的用途。
[0282] 實施例2 :鑒定黑腹果蠅的官系同源物
[0283] 如實施例1中所述，鑒定了許多秀麗隱桿線蟲的致死序列，并且所述致死序列 可用于鑒定其它種屬中的直向同源物。例如，所述秀麗隱桿線蟲致死序列可用于鑒定黑 腹果蠅的直向同源序列。也就是說，可使用每種秀麗隱桿線蟲序列在公共數據庫（例如 GenBank)中檢索黑腹果蠅的直向同源物。選擇具有高度序列同源性的（E值優選小于或等 于1E-30)可能的黑腹果蠅直向同源物，所述序列是相blast的最佳命中結果，后者指來自 不同生物（例如秀麗隱桿線蟲和黑腹果蠅）的序列相互為最佳blast命中結果。例如，使 用BLAST將來自秀麗隱桿線蟲的序列C與黑腹果蠅的序列D進行比對。如果黑腹果蠅序列 D是序列C的最佳命中結果，并且與秀麗隱桿線蟲的所有序列進行比對時序列C也是D的最 佳命中結果，那么D和C是相互最佳命中結果。該標準常用于定義直系同源物，意指不同物 種中具有相似功能的相似序列。所鑒定的黑腹果蠅序列示于表1A。
[0284] 實施例 3 :馬鈴葉葉甲(Colorado potato beetle, CPB)
[0285] A.克隆來自馬鈴薯葉甲的部分基因序列
[0286] 按照制造商的說明，使用 TRIzol 試劑（Cat. Nr. 15596-026/15596-018， Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)從4個不同幼蟲階段的馬鈴薯葉甲（科羅拉 多甲蟲；來源：Jeroen van Schaik, Entocare CV Biologische Gewasbescherming, Postbusl62,6700AD Wageningen，the Netherlands)分離高質量的完整 RNA。按照制造 商的說明，通過DNA酶（Cat.Nr. 1700, Promega)處理除去該RNA制備物中的基因組DNA。 按照制造商的說明，使用市售試劑盒（Superscript? III逆轉錄酶，Cat. Nr. 18080044， Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)得到 cDNA。
[0287] 為了分離包含 LD001、LD002、LD003、LD006、LD007、LD010、LD011、LD014、LD015、 LD016、LC018和LD027基因一部分的cDNA序列，使用簡并引物并按照制造商的說明使用 Amplitaq Gold (Cat. Nr. N8080240, Applied Biosystems)進行一系列 PCR 反應。
[0288] 表2-LD中給出了用于擴增每種基因的簡并引物序列，其顯示了包括引物序列和 所得cDNA序列的馬鈴薯葉甲靶基因。使用這些引物進行各自的PCR反應，其使用以下條件： 95°C 10分鐘，然后是40個循環的95°C 30秒、55°C 1分鐘和72°C 1分鐘，然后是72°C 10分 鐘。在瓊脂糖凝膠上分析所得PCR片段，對其進行純化（QIAquick Gel Extraction kit, Cat. Nr. 28706, Qiagen)，將其克隆入 pCR8/GW/topo 載體（Cat. Nr. K250020, Invitrogen)并 測序。表2-LD中給出了用各自SEQ ID NO表示的所得PCR產物的序列，并且其為部分序列。 表3-LD中給出了用各自SEQ ID N0表示的相應部分氨基酸序列，其中讀碼框的起點在括號 中指明。
[0289] B.產生馬鈴薯葉甲基因的dsRNA
[0290] 使用市售試劑盒 T7Ribomax? Express RNAi System (Cat. Nr. P1700, Promega)合 成毫克級的dsRNA。在兩個單獨的PCR反應中得到最初兩種獨立的單個5'T7RNA聚合酶啟 動子模板，每個反應包含與T7啟動子方向不同的靶序列。
[0291] 對于每種靶基因來說，使用特異性T7正向引物和特異性反向引物得到有義T7模 板。表8-LD中給出了用于擴增每種靶序列有義模板的各引物的序列。所述PCR反應的條件 如下：95°C4分鐘，然后是35個循環的95°C30秒、55°C30秒和72°C 1分鐘，然后是72°C 10 分鐘。在使用與上述相同條件的PCR反應中使用特異性正向引物和特異性T7反向引物得 到反義T7模板。表8-LD中給出了用于擴增每種靶基因反義模板的各引物的序列。在瓊脂 糖凝膠上分析所得的PCR產物，并通過PCR純化試劑盒（Qiaquick PCR Purification Kit, Cat. Nr. 28106, Qiagen)以及NaC104沉淀進行純化。按照制造商的說明，將所得到的T7正 向和反向模板混合從而進行轉錄，將所得RNA鏈退火、進行DNA酶和RNA酶處理并利用醋酸 鈉進行純化。表8-LD中給出了每種靶基因所得dsRNA的有義鏈。表8-LD顯示了用于制備 馬鈴薯葉甲靶序列的dsRNA片段的序列和多聯體序列，其包括引物序列。
[0292] C.針對馬鈴薯葉甲的活性，使用人工飼料對dsRNA靶標進行篩選
[0293] 如下制備馬鈴薯葉甲的人工飼料（修改自Gelman et al. ,2001，J. Ins. Sc.， vol. 1，no. 7,1-10):對水和瓊脂進行高壓滅菌，當溫度降至55°C時加入其余的成分（如下 文表A中所示）。在此溫度下，均勻混合所述成分，然后將所述飼料以每孔lml的量等分至 24孔板（Nunc)。使所述人工飼料在室溫下冷卻而固化。飼料在4°C最多保存3周。
[0294] 表A :人工飼料的成分
[0295]

【權利要求】
1.分離的核苷酸序列，其包含選自以下的核酸序列： (i) 如下表示的任意序列：SEQ ID N01，3,5,7,9，ll，13，15，17，19,21，23,49 至 158， 159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,240 至 247， 249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,508 至 513,515， 517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768， 773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890， 892,894,896,908tol040,1041，1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075,1077， 1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107， 1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617， 1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686， 1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055， 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338， 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471， 2476,2481或2486,或其互補序列， (ii) 與如下表示的任意序列具有至少70%，優選至少75%、80%、85%、90%，更優選 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N01，3,5,7,9,11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178， 183.188.193.198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 240 至 247, 249, 251，253, 255, 257, 259, 275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,508 至 513,515,517,519,521，533 至 575,576， 581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795， 797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040,1041， 1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089， 1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572， 1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647， 1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698， 1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085， 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364， 23613, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476, 2481 或 2486,或其互補序列， 以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17個連續核苷酸的序列： SEQ ID N01，3,5,7,9,11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178， 183.188.193.198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 240 至 247, 249, 251，253, 255, 257, 259, 275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,508 至 513,515,517,519,521，533 至 575,576， 581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795， 797, 799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040,1041， 1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089， 1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572， 1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647， 1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698， 1700,1702,1704,1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085， 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364， 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476, 2481 或 2486,或其互補序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17個連續核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N049至 158、275至472、533至575、621 至767、813至862、908至 1040、 1161 至 1571U730 至 2039、2120 至 2338、2384 至 2460,或其互補序列。
2. 權利要求1的多核苷酸序列表達產生的雙鏈核糖核苷酸序列，其中植物昆蟲害蟲攝 取所述核糖核苷酸序列抑制所述昆蟲害蟲的生長。
3. 權利要求2的核糖核苷酸序列，其中攝取所述序列抑制與所述序列基本上互補的核 苷酸序列的表達。
4. 包含根據權利要求2或3的核糖核苷酸序列的組合物，其還包含至少一種佐劑以及 任選地至少一種表面活性劑。
5. 包含至少一種雙鏈RNA的組合物，其中一條鏈包含與選自權利要求1中所限定序列 的核苷酸序列之至少一部分互補的核苷酸序列，其還任選地包含至少一種適當的載體、賦 形劑或稀釋劑。
6. 用包含權利要求1中所限定核酸序列的多核苷酸轉化的細胞，所述核酸序列任選地 與調節序列有效連接。
7. 權利要求6的細胞，其中所述細胞是原核細胞，例如革蘭氏陽性細胞或革蘭氏陰性 細菌細胞；或者其中所述細胞是真核細胞，例如酵母細胞或藻類細胞。
8. 權利要求7的細胞，其中所述細胞是細菌細胞。
9. 權利要求7的細胞，其中所述細胞是酵母細胞。
10. 包含至少一種細菌細胞或酵母細胞的組合物，所述細菌細胞或酵母細胞包含權利 要求1中所限定的至少一種多核苷酸。
11. 權利要求10的組合物，其中所述細菌或酵母細胞被滅活或被殺死，例如通過熱處 理或機械處理。
12. 包含表達至少一種雙鏈RNA的至少一種細菌或酵母細胞的組合物，其中所述雙鏈 RNA的一條鏈包含與選自權利要求1中所限定序列的核苷酸序列之至少一部分互補的核苷 酸序列，該組合物中還任選地包含至少一種適當的載體、賦形劑或稀釋劑。
13. 權利要求5或10至12中任一項的組合物，所述組合物還包含至少一種選自以下的 殺蟲劑：化學殺蟲劑、馬鈴薯糖蛋白、蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌殺蟲蛋白、光桿狀 菌殺蟲蛋白、側孢芽孢桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白，所述殺蟲劑具有對抗與權 利要求2中所限定的同樣的植物昆蟲害蟲的活性，或者其中所述殺蟲劑具有對抗一種或多 種其它植物昆蟲害蟲的活性。
14. 權利要求10至12中任一項的組合物，其中所述至少一種細菌或酵母細胞還包含 或還表達至少一種選自以下的殺蟲劑：化學殺蟲劑、馬鈴薯糖蛋白、蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋 白、致病桿菌殺蟲蛋白、光桿狀菌殺蟲蛋白、側抱芽抱桿菌殺蟲蛋白和球形芽抱桿菌殺蟲蛋 白，所述殺蟲劑具有對抗與權利要求2中所限定的同樣的植物昆蟲害蟲的活性，或者其中 所述殺蟲劑具有對抗一種或多種其它植物昆蟲害蟲的活性。
15. 權利要求5或10至12中任一項的組合物，其還包含至少一種其它細菌或酵母細 胞，所述細胞包含或表達至少一種選自以下的殺蟲劑：化學殺蟲劑、馬鈴薯糖蛋白、蘇云金 芽抱桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌殺蟲蛋白、光桿狀菌殺蟲蛋白、側抱芽抱桿菌殺蟲蛋白和球形 芽孢桿菌殺蟲蛋白，所述殺蟲劑具有對抗與權利要求2中所限定的同樣的植物昆蟲害蟲的 活性，或者其中所述殺蟲劑具有對抗一種或多種特定植物昆蟲害蟲的活性。
16. 權利要求13至15中任一項的組合物，其中所述蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白選自： Cryl、Cry3、TIC851、CryET170、Cry22、二元殺蟲蛋白 CryET33 和 CryET34、二元殺蟲蛋白 CryET80和CryET76、二元殺蟲蛋白TIC100和TIC101以及二元殺蟲蛋白PS14981。
17. 權利要求13至16中任一項的組合物，其作為殺昆蟲試劑。
18. 權利要求13至16中任一項的組合物，其用作預防或治療人或動物機體免受昆蟲侵 害的藥物。
19. 包含權利要求10至18中任一項的至少一種組合物的噴霧劑，其還任選地包含至少 一種佐劑和至少一種表面活性劑。
20. 包含權利要求10至18中任一項所限定組合物的用于害蟲的外罩、陷阱或誘餌。
21. 權利要求10至18中任一項的組合物、權利要求19的噴霧劑或者權利要求20的 外罩、陷阱或誘餌用于殺死昆蟲或抑制昆蟲生長的用途，所述昆蟲選自：馬鈴薯葉甲屬物種 (Leptinotarsa spp.)(例如，馬鈴薯葉甲（L.decemlineata)、偽馬鈴薯葉甲（L.juncta)或 胡頹子葉爺葉甲（L. texana))，并且 -其中所述組合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述組合物中的細菌或酵母細胞包含或表達多核苷酸， 所述多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列： SEQ ID N01，3,5,7,9，ll，13，15，17，19,21，23,49 至 158，159，160 至 163，168，173， 178.183.188.193.198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 240 至 246,或 2486,或其互補序列， (ii) 與如下表示的任意序列具有至少70%，優選至少75%、80%、85%、90%，更優選 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N01，3,5,7,9，ll，13，15，17，19,21，23,49 至 158，159，160 至 163，168，173， 178.183.188.193.198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 240 至 246,或 2486,或其互補序列，以 及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17個連續核苷酸的序列： SEQ ID N01，3,5,7,9，ll，13，15，17，19,21，23,49 至 158，159，160 至 163，168，173， 178.183.188.193.198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 240 至 246,或 2486,或其互補序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17個連續核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N049至158,或其互補序列。
22. 權利要求10至18中任一項的組合物、權利要求19的噴霧劑或者權利要求20 的外罩、陷阱或誘餌用于殺死昆蟲或抑制昆蟲生長的用途，所述昆蟲選自：猿葉甲屬物種 (Phaedon spp.)(例如，辣根猿葉甲（P.cochleariae))并且 -其中所述組合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述組合物中的細菌或酵母細胞包含或表達多核苷酸， 所述多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列：SEQ ID N0247, 249, 251，253, 255, 257, 259, 275 至 472,473， 478,483,488,493,498, 503, 508 至 512,或其互補序列， (ii) 與如下表示的任意序列具有至少70%，優選至少75%、80%、85%、90%，更優選 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N0247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498， 503, 508至512,或其互補序列，以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17個連續核苷酸的序列： SEQ ID N0247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498， 503, 508至512,或其互補序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17個連續核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N0275至472,或其互補序列。
23. 權利要求10至18中任一項的組合物、權利要求19的噴霧劑或者權利要求20 的外罩、陷阱或誘餌用于殺死昆蟲或抑制昆蟲生長的用途，所述昆蟲選自：食植瓢蟲屬 (Epilachna spp.)(例如，墨西哥豆瓢蟲（E.varivetis))，并且 -其中所述組合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述組合物中的細菌或酵母細胞包含或表達多核苷酸， 所述多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列： SEQ ID N0513, 515, 517, 519, 521，533 至 575, 576, 581，586, 591 或 596,或其互補序列， (ii) 與如下表示的任意序列具有至少70%，優選至少75%、80%、85%、90%，更優選 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N0513, 515, 517, 519, 521，533 至 575, 576, 581，586, 591 或 596,或其互補序列， 以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17個連續核苷酸的序列： SEQ ID N0513, 515, 517, 519, 521，533 至 575, 576, 581，586, 591 或 596,或其互補序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17個連續核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N0533至575,或其互補序列。
24. 權利要求10至18中任一項的組合物、權利要求19的噴霧劑或者權利要求20 的外罩、陷阱或誘餌用于殺死昆蟲或抑制昆蟲生長的用途，所述昆蟲選自：花象屬物種 (Anthonomus spp.)(例如，墨西哥棉鈴象（A. grandis))，并且 -其中所述組合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述組合物中的細菌或酵母細胞包含或表達多核苷酸， 所述多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列： SEQ ID N0601，603,605,607,609,621 至 767, 768, 773, 778, 783 或 788,或其互補序列， (ii) 與如下表示的任意序列具有至少70%，優選至少75%、80%、85%、90%，更優選 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N0601，603,605,607,609,621 至 767, 768, 773, 778, 783 或 788,或其互補序列， 以及 (iii)包含如下表示的任意序列之至少17個連續核苷酸的序列： SEQ ID N0601，603,605,607,609,621 至 767, 768, 773, 778, 783 或 788,或其互補序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17個連續核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N0621至767,或其互補序列。
25. 權利要求10至18中任一項的組合物、權利要求19的噴霧劑或者權利要求20 的外罩、陷阱或誘餌用于殺死昆蟲或抑制昆蟲生長的用途，所述昆蟲選自：擬谷盜屬物種 (Tribolium spp.)(例如，赤擬谷盜（T.castaneum))，并且 -其中所述組合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述組合物中的細菌或酵母細胞包含或表達多核苷酸， 所述多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列： SEQ ID N0793, 795, 797, 799,801，813 至 862,863,868,873,878 或 883,或其互補序列， (ii) 與如下表示的任意序列具有至少70%，優選至少75%、80%、85%、90%，更優選 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N0793, 795, 797, 799,801，813 至 862,863,868,873,878 或 883,或其互補序列， 以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17個連續核苷酸的序列： SEQ ID N0793, 795, 797, 799,801，813 至 862,863,868,873,878 或 883,或其互補序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17個連續核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N0813至862,或其互補序列。
26. 權利要求10至18中任一項的組合物、權利要求19的噴霧劑或者權利要求20的 外罩、陷阱或誘餌用于殺死昆蟲或抑制昆蟲生長的用途，所述昆蟲選自：瘤蚜屬物種（Myzus spp.)(例如，桃姆（Μ· persicae))，并且 -其中所述組合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述組合物中的細菌或酵母細胞包含或表達多核苷酸， 所述多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列：SEQ ID 勵888,890,892,894,896,908 至 1040，1041，1046， 1051，1056,1061，或 1066 至 1070,或其互補序列， (ii) 與如下表示的任意序列具有至少70%，優選至少75%、80%、85%、90%，更優選 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N0888,890,892,894,896,908至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，或 1066 至 1070,或其互補序列，以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17個連續核苷酸的序列： SEQ ID N0888,890,892,894,896,908至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，或 1066 至 1070,或其互補序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17個連續核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N0908至1040,或其互補序列。
27. 權利要求10至18中任一項的組合物、權利要求19的噴霧劑或者權利要求20 的外罩、陷阱或誘餌用于殺死昆蟲或抑制昆蟲生長的用途，所述昆蟲選自：褐飛虱屬物種 (Nilaparvata spp.)(例如，褐飛風（N. lugens))，并且 -其中所述組合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述組合物中的細菌或酵母細胞包含或表達多核苷酸， 所述多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列： SEQ ID N01071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093， 1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582， 1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1822,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657， 1662,1667,1672或1677,或其互補序列， (ii) 與如下表示的任意序列具有至少70%，優選至少75%、80%、85%、90%，更優選 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N01071,1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093, 1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582， 1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657， 1662,1667,1672或1677,或其互補序列，以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17個連續核苷酸的序列： SEQ ID N01071,1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093, 1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582， 1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657， 1662,1667,1672或1677,或其互補序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17個連續核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N01161至1571，或其互補序列。
28.權利要求10至18中任一項的組合物、權利要求19的噴霧劑或者權利要求20 的外罩、陷阱或誘餌用于殺死昆蟲或抑制昆蟲生長的用途，所述昆蟲選自：禾草螟屬物種 (Chilo spp.)(例如，二化螟（C.suppressalis)、臺灣稻螟（C.auricilius)或稻多麗螟 (C. polychrysus))，并且 -其中所述組合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述組合物中的細菌或酵母細胞包含或表達多核苷酸， 所述多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列：SEQ ID N01682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696， 1698,1700,1702,1704,1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080， 2085, 2090或2095,或其互補序列， (ii) 與如下表示的任意序列具有至少70%，優選至少75%、80%、85%、90%，更優選 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N01682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090 或 2095,或其互補 序列，以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17個連續核苷酸的序列： SEQ ID N01682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090 或 2095,或其互補 序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17個連續核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N01730至2039,或其互補序列。
29. 權利要求10至18中任一項的組合物、權利要求19的噴霧劑或者權利要求20的外 罩、陷阱或誘餌用于殺死昆蟲或抑制昆蟲生長的用途，所述昆蟲選自：Plutella屬物種（例 如，菜蛾），并且 -其中所述組合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述組合物中的細菌或酵母細胞包含或表達多核苷酸， 所述多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列：SEQ ID N02100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339， 2344, 2349, 2354或2359,或其互補序列， (ii) 與如下表示的任意序列具有至少70%，優選至少75%、80%、85%、90%，更優選 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N02100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339,2344, 2349, 2354 或 2359， 或其互補序列，以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17個連續核苷酸的序列： SEQ ID N02100,2102,2104,2106,2108,2120 至 2338,2339,2344,2349,2354 或2359,或其互補序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17個連續核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N02120至2338,或其互補序列。
30. 權利要求10至18中任一項的組合物、權利要求19的噴霧劑或者權利要求20的 外罩、陷阱或誘餌用于殺死昆蟲或抑制昆蟲生長的用途，所述昆蟲選自：Acheta屬物種（例 如，居屋艾幡（A. domesticus))，并且 -其中所述組合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述組合物中的細菌或酵母細胞包含或表達多核苷酸， 所述多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列： (i) 以下任意序列： SEQ ID N02364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460,2461，2466,2471，2476 或 2481， 或其互補序列， (ii) 與如下表示的任意序列具有至少70%，優選至少75%、80%、85%、90%，更優選 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N02364,2366,2368,2370,2372,2364 至 2460,2461，2466,2471，2476 或 2481， 或其互補序列，以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17個連續核苷酸的序列： SEQ ID N02364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460,2461，2466,2471，2476 或 2481， 或其互補序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17個連續核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N02384至2460,或其互補序列。
31. 權利要求10至18中任一項的組合物、權利要求19的噴霧劑或者權利要求20的外 罩、陷阱或誘餌在藥物或獸醫應用中的用途。
32. 用于防止昆蟲在植物上生長或者防止昆蟲侵害植物的方法，其包括將權利要求10 至18中任一項的組合物或者權利要求19的噴霧劑應用到所述植物。
33. 提高產量的方法，其包括將有效量的權利要求10至18中任一項的組合物或權利要 求19的噴霧劑應用到植物。
34. 權利要求32或33的方法，其中所述植物選自：苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、蘆筍、鱷梨、 香蕉、大麥、豆、甜菜、黑莓、藍莓、嫩莖花椰菜、抱子甘藍、卷心菜、蓖麻、胡蘿卜、木薯、花椰 菜、谷類、芹菜、櫻桃、柑桔、克萊門氏小柑橘、咖啡、玉米、棉花、黃瓜、茄子、菊苣、桉樹、無花 果、葡萄、葡萄柚、落花生、醋栗、獼猴桃、萵苣、韭、檸檬、萊姆酸橙、松樹、玉米、芒果、甜瓜、 小米、蘑菇、燕麥、菜秋葵、洋蔥、橙、觀賞性植物或花或樹、番木瓜、歐芹、豌豆、桃、花生、豌 豆、胡椒、柿子、菠蘿、車前草、李子、石榴、馬鈴薯、南瓜、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、 高粱、黃豆、大豆、菠菜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、紅薯、橘子、茶樹、煙草、番茄、藤本植 物、西瓜、小麥、山藥以及西葫蘆。
35. 根據權利要求32至34中任一項的方法，其中所述昆蟲選自：馬鈴薯葉甲屬（例 如，馬鈴薯葉甲、偽馬鈴薯葉甲或胡頹子葉茄葉甲）、合爪負泥蟲屬物種（Lema spp.) (例如，三條負泥蟲（L. trilineata))、爺跳甲屬物種（Epitrix spp.)(例如，美國馬鈴 薯跳甲（E.cucumeris)、煙草跳甲（E.hirtipennis)或塊莖跳甲（E.tuberis))、豆芫菁 屬物種（Epicauta spp.)(例如，北美豆芫菁（E. vittata))、食植瓢蟲屬物種（例如， 墨西哥豆瓢蟲）、猿葉甲屬物種（例如，辣根猿葉甲）、褐飛虱屬物種（例如，褐飛虱）、 灰飛風屬物種（Laodelphax spp.)(例如，灰飛風（L.striatellus))、黑尾葉蝶屬物種 (Nephotettix spp.)(例如，二點黑尾葉蝶（N. virescens)，或黑尾葉蝶（N. cincticeps), 或二條黑尾葉蝶（N.nigropictus))、白背飛風屬物種（Sogatella spp.)(例如，白背飛 風（5.：1；\11'(^€6四)）、4(3116七3屬物種（例如，居屋艾幡）、桿長蝽屬物種（131188118 8口口·） (例如，美洲谷桿長蝽（B. leucopterus leucopterus))、黑蝽屬物種（Scotinophora spp.)(例如，稻黑蝽（S. vermidulate))、綠蝽屬物種（Acrosternum spp.)(例如，擬 綠蝽（A. hilare))、稻弄蝶屬物種（Parnara spp.)(例如，直紋稻弄蝶（P. guttata))、 禾草螟屬物種（例如，二化螟、臺灣稻螟或稻多麗螟（C. polychrysus))、禾草螟屬物種 (Chilotraea spp.)(例如，稻桿螟（C.polychrysa))Ji^夜蛾屬物種（Sesamia spp.) (例如，稻駐莖夜蛾（S. inf erens))、駐禾螟屬物種（Tryporyza spp.)(例如，白稻螟 (T.innotata)或三化螟（T.incertulas))、縱卷葉野螟屬物種（Cnaphalocrocis spp.) (例如，稻縱卷葉野螟（C. medinal i s))、潛蠅屬物種（Agromyza spp.)(例如，日本稻 潛蠅（A.oryzae)或玉米斑潛蠅（A.parvicornis))、桿草螟屬物種（Diatraea spp.) (例如，小鹿螟（D. saccharalis)或西南玉米桿草螟（D. grandiosella))、Narnaga屬 物種（例如，綠稻毛蟲（N. aenescens))、黃夜蛾屬物種（Xanthodes spp.)(例如，犁 紋黃夜蛾（X. transversa))、灰翅夜蛾屬物種（Spodoptera spp.)(例如，草地貪夜蛾 (S.frugiperda)、甜菜夜蛾（S.exigua)、海灰翅夜蛾（S.littoralis)或西部黃條夜蛾 (S. praefica))、秘夜蛾屬物種（Mythimna spp.)(例如，粘蟲（Mythmna(Pseudaletia) seperata))、鈴夜蛾屬物種（Helicoverpa spp.)(例如，谷實夜蛾（H.zea))、Colaspis 屬 物種（Colaspis spp.)(例如，葡萄肖葉甲（C.brunnea))、稻水象屬物種（Lissorhoptrus spp.)(例如，稻水象甲（L.oryzophilus))、稻象屬物種（Echinocnemus spp.)(例如，稻 象（E. squamos))、稻鐵甲屬物種（Diclodispa spp.)(例如，水稻鐵甲（D. armigera))、 禾谷負泥蟲屬物種（Oulema spp.)(例如，水稻負泥蟲（0. oryzae))、米象屬物種 (Sitophilus spp.)(例如，米象（S. oryzae))、Pachydiplosis 屬物種（例如，稻癭蚊 (P.oryzae))、毛眼水蠅屬物種（Hydrellia spp.)(例如，麥葉毛眼水蠅（H.griseola)或 日稻毛眼水蠅（H. sasakii))、Chlorops屬物種（例如，稻桿潛蠅（C. oryzae))、根螢葉甲 屬物種（Diabrotica spp.)(例如，玉米根葉甲（D.virgifera virgifera)、北美玉米根 葉甲（D. barberi)、黃瓜十一星葉甲食根亞種（D. undecimpunctata howardi)、墨西哥玉 米根葉甲（D.virgifera zeae)、條紋黃瓜葉甲（D.balteata))、桿野螟屬物種（Ostrinia spp.)(例如，玉米螟（0. nubilalis))、地虎屬物種（Agrotis spp.)(例如，小地老虎 (A. ipsilon))、Elasmopalpus屬物種（例如，南美玉米苗斑螟（E. lignosellus))、梳爪叩 頭蟲屬（Melanotus spp.)(線蟲）、圓頭犀金龜屬（Cyclocephala spp.)(例如，北部偽裝 金龜（C. borealis)或南部偽裝金龜（C. immaculata))、弧麗金龜屬物種（Popillia spp.) (例如，日本弧麗金龜（P. japonica))、跳甲屬物種（Chaetocnema spp.)(例如，玉米銅色跳 甲（C.pulicaria))、龍頸象屬物種（Sphenophorus spp.)(例如，玉米長_象（S.maidis))、 溢管姆屬物種（Rhopalosiphum spp.)(例如，玉米姆（R.maidis))、圓尾姆屬（Anuraphis spp.)(例如，玉米根姆（A.maidiradicis))、黑幢屬物種（Melanoplus spp.)(例如，紅足 黑蟲皇（M.femurrubrum))、特異黑幢（M.differentialis)或遷飛黑幢（M.sanguinipes))、 種蠅屬物種（Hylemya spp.)(例如，種蠅（H. platura))、呆薊馬屬物種（Anaphothrips spp.)(例如，黃呆薊馬（A. obscrurus))、火蟻屬物種（Solenopsis spp.)(例如，盜 蟻（S. milesta))、葉螨屬物種（Tetranychus spp.)(例如，二點葉螨（T. urticae)、朱 砂葉螨（T. cinnabarinus)、鈴夜蛾屬物種（例如，谷實夜蛾或棉鈴蟲（H. armigera))、 Pectinophora屬物種（例如，紅鈴麥蛾（P.gossypiella))、金剛鉆屬物種（Earias spp.) (例如，翠紋鉆夜蛾（E. vittella))、實夜蛾屬物種（Heliothis spp.)(例如，煙芽夜蛾 (H.virescens))、花象屬物種（Anthonomus spp.)(例如，墨西哥棉鈴象（A.grandis))、 Pseudatomoscelis屬物種（例如，棉偽斑腿盲蝽（P. seriatus))、結翅粉風屬物種 (Trialeurodes spp.)(例如，結翅粉風（T. abutiloneus)、溫室粉風（T. vaporariorum))、 小粉風屬物種（Bemisia spp.)(例如，銀葉粉風（B. argentifolii))、姆屬物種（Aphis spp.)(例如，棉姆（A. gossypii))、草盲蝽屬物種（Lygus spp.)(例如，美國牧草盲蝽 (L· lineolaris)或美洲牧草盲蝽（L. hesperus))、美洲蝽屬物種（Euschistus spp.) (例如，斑點美洲蝽（Ε· conspersus))、Chlorochroa屬物種（例如，賽氏蝽（C. sayi))、 綠蝽屬物種（Nezara spp.)(例如，稻綠蝽（N.viridula))、薊馬屬物種（Thrips spp.) (例如，煙薊馬（T.tabaci))、花薊馬屬物種（Frankliniella spp.)(例如，煙褐薊馬 (F.fusca)或西方花薊馬（F.occidentalis))、綠小葉蝶屬物種（Empoasca spp.)(例如， 蠶豆小綠葉蝶（E.fabae))、瘤姆屬物種（Myzus spp.)(例如，桃姆（M.persicae))、薯個 木風屬物種（Paratrioza spp.)(例如，馬鈴薯木風（P. cockerelli))、寬胸金針蟲屬物 種（Conoderus spp.)(例如，南部馬鈴薯線蟲（C.falli)或煙草線蟲（C.vespertinus))、 麥蛾屬物種（Phthorimaea spp.)(例如，馬鈴薯麥蛾（P. operculella))、長管姆屬物種 (Macrosiphum spp.)(例如，大戟長管姆（M. euphorbiae))、Thyanta 屬物種（例如，紅 肩蝽象（1'.?&111(1〇^1^1^))、麥蛾屬物種（例如，馬鈴薯麥蛾）、鈴夜蛾屬物種（例如，谷 實夜蛾）、Keiferia屬物種（例如，番爺蠹蛾）、金針蟲屬物種（Limonius spp.)(線蟲）、 Manduca屬物種（例如，煙草天蛾（M. sexta)或番爺天蛾（M. quinquemaculata))、斑潛蠅 屬物種（Liriomyza spp.)(例如，蔬菜斑潛蠅（L. sativae)、三葉草斑潛蠅（L. trifolli) 或南美斑潛蠅（L.huidobrensis))、果蠅屬物種（Drosophilla spp.)(例如，黑腹果蠅 (D. melanogaster)、D. yakuba、擬暗果妮（D. pseudoobscura)或擬果妮（D. simulans))、 步甲屬物種（Carabus spp.)(例如，粒步甲（C.granulatus))、搖蚊屬物種（Chironomus spp.)(例如，搖蚊（C. tentanus))、柿首蚤屬物種（Ctenocephalides spp.)(例如，貓柿首 蚤（C.felis))、非耳_象屬物種（Diaprepes spp.)(例如，根象鼻蟲（D.abbreviatus))、 齒小蠹屬物種（Ips spp.)(例如，美松齒小蠹（I.pini))、擬谷盜屬物種（Tribolium spp.)(例如，赤擬谷盜（Τ· castaneum))、舌蠅屬物種（Glossina spp.)(例如，刺舌蠅 (G.morsitans))、按蚊屬物種（Anopheles spp.)(例如，甘比亞按蚊（A.gambiae))、鈴夜蛾 屬物種（例如，棉鈴蟲（H. armigera))、Acyrthosiphon屬物種（例如，豌豆蟲牙（A. pisum))、 蜜蜂屬物種（Apis spp.)(例如，意大利蜜蜂（A.melifera))、Homalodisca屬物種（例如， 琉璃葉蝶（H. coagulate))、伊蚊屬物種（Aedes spp.)(例如，埃及斑紋（Ae. aegypti))、蠶 蛾屬物種（Bombyx spp.)(例如，家蠶（B.mori))、飛幢屬物種（Locusta spp.)(例如，飛 幢（L.migratoria))、牛蝶屬物種（Boophilus spp.)(例如，微小牛蝶（B.microplus))、 Acanthoscurria屬物種（例如，紅毛巧克力捕鳥蛛（A. gomesiana))、甲蠊屬物種 (Diploptera spp.)(例如，太平洋折翅蠊（D.punctata))、袖蝶屬物種（Heliconius spp.) (例如，瓦氏袖蝶（H.erato)或詩神袖蝶（H.melpomene))、象蟲屬物種（Curculio spp.) (例如，歐洲櫟象（C. glandium))、Plutella屬物種（例如，菜蛾（P. xylostella))、花 蝶屬物種（Amblyomma spp.)(例如，彩飾花蝶（A.variegatum))、作蠶屬物種（Anteraea spp.)(例如，天蠶（A. yamamai))和阿蚊屬物種（Armigeres spp.)(例如，騷擾阿蚊 (A. subalbatus)) 〇
36. 用于防止昆蟲在基層上生長的方法，其包括將權利要求10至18中任一項的組合物 或權利要求19的噴霧劑應用到所述基層。
37. 用于治療和/或預防由靶生物導致的疾病或病癥的方法，其包括將權利要求10至 18中任一項的組合物或權利要求19的噴霧劑施用于有此治療和/或預防需要的對象。
【文檔編號】C12N15/113GK104087577SQ201410305513
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2007年1月12日 優先權日:2006年1月12日
【發明者】羅曼·雷馬克斯, 勞倫特·庫布勒, 格特·普萊廷克, 埃爾絲·萬布勒, 蒂埃里·博蓋爾特 申請人:德福根有限公司