一種大豆tps類酶及其編碼基因與應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于植物基因工程領域，涉及一種大豆TPS類酶及其編碼基因與應用。本發明大豆TPS類酶GmGES，具有SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列。該基因的開放閱讀框具有SEQ?ID?NO.1所示的DNA序列。本發明首次從大豆基因組中克隆得到一種大豆TPS類酶的編碼基因GmGES。并驗證了該基因的功能。利用植物表達載體，將本發明的GmGES基因導入植物細胞，可獲得抗蟲轉基因植株。過量表達本發明GmGES基因的煙草與空載煙草相比，其抗蟲性顯著提高，說明GmGES基因在提高植物抗蟲性方面起著重要作用。
【專利說明】—種大豆TPS類酶及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物基因工程領域，涉及一種大豆TPS類酶及其編碼基因與應用。
【背景技術】 [0002]在當今的農業生產中，蟲害是嚴重制約農作物優質、高產高效的重要原因之一。蟲害不單單影響作物的生長發育，甚至在作物收獲存儲運輸過程當中，都會遭遇到不同害蟲程度不同的傷害。大豆[Glycine max (L.)Merr.]作為一種重要的糧食及經濟作物，多種害蟲能夠嚴重影響其產量和品質。傳統防治方法就是使用化學藥劑農藥或者施用生物方面的殺蟲劑，在殺死害蟲的同時也會對有益動物以及害蟲的天敵產生傷害，嚴重時也會殺死它們，一定程度上對生態平衡造成了破壞，同時對人、畜、禽等也會有毒害。
[0003]目前，提高作物抗蟲性的重要方法之一是通過基因工程技術。研究表明揮發性的萜類化合物在植物與植食性昆蟲之間的關系中起著相當重要的作用，多數萜類化合物對植食性昆蟲具有驅避、拒食和毒殺作用(Schnee et al.2006)。職類合酶(terpene synthase,TPS)是萜類化合物合成途徑中的關鍵酶，催化萜類化合物合成的最后一步反應。單萜合酶隨后在擬南芥、水稻、番茄、金魚草、煙草等植物中克隆出來。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種大豆TPS類酶。
[0005]本發明的另一目的是提供編碼該大豆TPS類酶的基因。
[0006]本發明的又一目的是提供該TPS類酶的應用。
[0007]本發明的目的通過如下技術方案實現:
[0008]一種大豆TPS類酶GmGES，具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。
[0009]編碼所述的大豆TPS類酶GmGES的基因GmGES。
[0010]該基因的開放閱讀框具有SEQ ID N0.1所示的DNA序列。
[0011]含有所述的大豆TPS類酶GmGES編碼基因GmGES的表達載體。
[0012]所述的表達載體優選將SEQ ID N0.1所示的大豆TPS類酶GmGES編碼基因GmGES利用gateway技術插入植物表達載體pMDC83得到的植物過量表達載體pMDC83_GmGES。
[0013]使用GmGES構建植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或誘導型啟動子。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進彳丁加工，如加入可在植物中表達的選擇性標記基因(⑶S基因、蠻光素酶基因等)或抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物、潮霉素標記物等)的抗性基因。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。
[0014]含有所述大豆TPS類酶編碼基因GmGES的工程菌。
[0015]所述的工程菌優選將所述的大豆TPS類酶編碼基因GmGES轉入根癌農桿菌EHA105所得。
[0016]擴增所述大豆TPS類酶編碼基因GmGES的引物，正向引物序列為SEQ ID N0.3，反向引物序列為SEQ ID N0.4。
[0017]所述的大豆TPS類酶GmGES在培育抗蟲植物中的應用。
[0018]所述的大豆TPS類酶編碼基因GmGES在培育抗蟲植物中的應用。
[0019]有益效果
[0020]本發明首次從大豆基因組中克隆得到一種大豆TPS類酶的編碼基因GmGES。并驗證了該基因的功能。利用植物表達載體，將本發明的GmGES基因導入植物細胞，可獲得抗蟲轉基因植株。過量表達本發明GmGES基因的煙草與空載煙草相比，其抗蟲性顯著提高，說明GmGES基因在提高植物抗蟲性方面起著重要作用。本發明的GmGES對培育抗蟲農作物，減少蟲害對農作物產量的影響特別是對大豆產量的影響具有重要意義。
[0021]攜帶有本發明GmGES的植物表達載體可通過使用Ri質粒、Ti質粒、植物病毒載體、顯微注射、直接DNA轉化、農桿菌介導、電導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。被轉化的植物宿主既可以是玉米、水稻、小麥等單子葉植物，也可以是煙草、大豆、苜蓿、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草等雙子葉植物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖lpMDC83的質粒圖譜。
[0023]圖2含有GmGES的植物表達載體的部分結構示意圖。
[0024]圖3轉基因煙草PCR鑒定電泳圖。泳道1:CK，以轉入空載的煙草DNA為模板(陰性對照)；泳道2:P,以植物表達載體pMDC83-GmGES質粒為模板(陽性對照)；泳道3_16:1_14，以各個轉基因植株DNA為模板。
[0025]圖4轉基因煙草RT-PCR鑒定電泳圖。泳道1:CK，以轉入空載的煙草RNA為模板(陰性對照)；泳道2:P,以植物表達載體pMDC83-GmGES質粒為模板(陽性對照)；泳道3_10:1-8，以各個轉基因植株RNA為模板。
[0026]圖5轉GmGES煙草株系與空載煙草的葉片對斜紋夜蛾進行雙向選擇飼喂，12小時后評價其偏向性因子。A:雙向選擇飼喂12小時后的的葉面情況；B:斜紋夜蛾對轉GmGES煙草株系與空載煙草葉片的偏向性因子計算結果示意圖，*，P < 0.05 ;**，P < 0.01。
[0027]圖6轉GmGES煙草株系與空載煙草的葉片對斜紋夜蛾進行強迫飼喂試驗，24小時后計算其相對生長率。A:轉GmGES煙草株系與空載煙草喂養蟲子24小時之后的葉面情況；B --轉GmGES煙草株系與空載煙草的葉片分別飼喂24小時后斜紋夜蛾的相對生長率結果示意圖，*，P ≤ 0.05 ;**，P ≤ 0.01。
【具體實施方式】
[0028]在本發明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。
[0029]下面結合具體的制備實施例和應用實施例，并參照數據進一步詳細地描述本發明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。
[0030]在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。所用到的引物，均在首次出現時標明，其后所用相同引物，均以首次標明的內容相同。
[0031]下述實施例中所用方法如無特別說明，均為常規方法。[0032]實施例1大豆GmGES及其編碼基因GmGES的cDNA克隆與鑒定
[0033]實驗材料為栽培大豆品種“南農99-10”，由南京農業大學國家大豆改良中心種質資源研究室提供，材料種植于網室，常規田間管理。
[0034]參照苜蓿單萜合酶基因(GeneBank數據庫中的登錄號為AY766248)的序列信息和大豆基因組數據庫(http: //www.phytozome.net/soybean ),利用生物信息學的方法進行分析，設計引物，進行大豆單萜合酶基因GmGES的克隆，。具體方法如下:
[0035]GmGES 基因 ORF 正向引物 P1: ‘ 5-CAAGAAGCTGCTAGAGGAAGT-3 ’ (SEQ ID N0.3)
[0036]GmGES 基因 ORF 反向引物 P2: ‘5-ATAGTTCAAATGCCTAGTCTC-3’ (SEQ ID N0.4)；
[0037]取大豆材料“南農99-10”嫩葉片，置于液氮中研碎，RNA提取依據TIANGEN總RNA提取試劑盒RNA Plant Extraction kit DP417進行。cDNA第一鏈合成依據TaKaRa試劑公司 cDNA 第一鏈合成試劑盒 TaKaR a PrimeScript?lst strand cDNA Synthesis KitD6110A，具體詳見操作說明。以得到的cDNA片段為模板，用上述引物對進行PCR擴增反應。20 μ I PCR 反應體系為:0.8μ I cDNA第一鏈(0.05μ g)、L 6μ I 引物(SEQ ID N0.3 和 SEQID N0.4，5μ Μ)、2μ 110XPCR 緩沖液、1.6μ I Mg2\l.6 μ I dNTP 和 0.5U ExTaq DNA 聚合酶，用超純水補足20 μ I。反應在BIO-RAD PTC-200型PCR儀上進行，其程序為95°C變性5min;再 94°C 30sec,53°C 40sec,72°C 2min，共 30 個循環；然后 72°C延伸 IOmin ;4°C保存。PCR產物回收后經連接PMD19-T載體(TaKaRa)、轉化大腸桿菌DH5 α、藍白斑篩選、搖菌、測序、序列分析結果表明PCR產物具有SEQ ID N0.1所示的0RF，命名為GmGES，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0038]實施例2轉GmGES基因煙草的獲得
[0039]利用Invitrogen 公司的Gateway? Technology with Clonase?II 試劑盒，將實施例I克隆的GmGES正向插入到表達載體pMDC83(圖1)中，轉化大腸桿菌DH5 α，轉化液涂布于含50mg/L潮霉素+50mg/L卡那霉素`的LB固體培養基上篩選陽性克隆。經測序驗證后，提取質粒，得到pMDC83-GmGES植物過量表達載體(圖2)。用凍融法分別將pMDC83_GmMGES和空載質粒PMDC83轉入根癌農桿菌菌株EHA105 (Biovector C0.,LTD)中。pMDC83_GmGES和pMDC83分別通過農桿菌EHA105介導轉化煙草，提取轉基因煙草的基因組DNA作為模板，以空載作為陰性對照，pMDC83-GmGES質粒作為陽性對照，用目的基因內部引物進行PCR初步鑒定陽性轉基因煙草，方法如下:
[0040]設計目的基因內部引物P3:SEQ ID N0.5和P4:SEQ ID N0.6進行PCR擴增，10 μ IPCR反應體系為:5yL mix，上、下游引物(5pmol)各lyL，模板2yL (大約含0.03yg)，加CldH2Ol μ L0 其程序為 95°C變性 4min;再 94°C 40sec,56°C lmin,72°C lmin，共 30 個循環；然后72°C延伸IOmin ;4°C保存。PCR鑒定結果見圖3。
[0041]用目的基因內部引物上游引物+GFP下游引物進行RT-PCR對陽性轉基因煙草二次鑒定，方法如下:
[0042]用目的基因內部引物上游引物P3:SEQ ID N0.5和GFP下游引物P5:SEQ IDN0.7，以轉基因煙草RNA為模板進行RT-PCR擴增，10 μ I PCR反應體系為:5 μ L mix，引物(5pmol)各I μ L，模板2μ L(大約含0.03 μ g),加ddH201 μ L。其程序為95°C變性5min;再94°C 50sec,56°C 90sec,72°C lmin，共 30 個循環；然后 72°C延伸 IOmin ;4°C保存。RT-PCR鑒定結果見圖4。[0043]實施例3GmGES基因的功能驗證
[0044]剪取同一生長時期的轉基因和空載對照煙草植株的葉片，測定其面積后分別放于瓷盤兩端，然后將10頭斜紋夜蛾(購于江蘇省農科院)置于瓷盤中間區域，讓其自由選擇取食，12小時后，分別測對照和轉基因煙草葉片剩余面積并記錄蟲子的分布情況。計算對照葉片損失面積(C)和轉基因葉片損失面積(T)及偏向性因子(Preference indece, PI),PI=2T/ (T+C)。當PI=I時，蟲子對對照葉片和轉基因葉片的選擇無偏向性；當PI>1時，蟲子偏向于啃食轉基因葉片；iPI〈l時，蟲子偏向于啃食對照葉片，此時說明轉基因葉片與對照相比有較高抗性。圖5A顯示自由取食12小時后轉基因煙草和對照煙草的葉片損失情況；圖5B顯示不同實驗組中斜紋夜蛾的偏向性因子。
[0045]用陽性轉GmGES基因煙草株系和轉pMDC83的空載煙草的葉片同時飼喂斜紋夜蛾，將不同轉基因煙草株系葉片和轉空載的煙草葉片分別放在各個培養皿中，每個培養皿放5頭蟲子，喂養前稱取5頭蟲子的總重量為Wl, 24小時之后,再稱取5頭蟲子的重量為W2.計算蟲子的相對生長率RGR(Relative growth rate) = (W2_Wl)/Wl,結果見圖6B。轉GmGES煙草株系與空載煙草的葉片同時飼喂斜紋夜蛾24小時后葉片情況見圖6A。
[0046]結果可見: 轉基因煙草對斜紋夜蛾有明顯的趨避作用，用轉基因煙草葉片飼養的斜紋夜蛾生長率顯著低于用空載煙草葉片飼養斜紋夜蛾生長率，說明轉基因株系與空載煙草相比抗蟲性顯著提高，過量表達GmGES基因能提高轉基因煙草的抗蟲性。
【權利要求】
1.一種大豆TPS類酶GmGES，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.編碼權利要求1所述的大豆TPS類酶的基因GmGES。
3.根據權利要求2所述的基因GmGES，其特征在于該基因具有SEQID N0.1所示的DNA序列。
4.含有權利要求2或3所述基因GmGES的表達載體。
5.根據權利要求4所述的含有基因GmGES的表達載體，其特征在于所述的表達載體是將SEQ ID N0.1所示的大豆TPS類酶編碼基因GmGES開放閱讀框利用gateway技術插入植物表達載體PMDC83得到的植物過量表達載體pMDC83-GmGES。
6.含有權利要求2或3所述大豆TPS類酶GmGES編碼基因GmGES的工程菌。
7.根據權利要求6所述的工程菌，其特征在于所述的工程菌是將權利要求2或3所述的大豆TPS類酶GmGES編碼基因GmGES轉入根癌農桿菌EHA105所得。
8.擴增權利要求3所述基因的引物，其特征在于正向引物序列為SEQID N0.3，反向引物序列為SEQ ID N0.4。
9.權利要求1所述的大豆TPS類酶GmGES在培育抗蟲植物中的應用。
10.權利要求2或3所述的基因GmGES在培育抗蟲植物中的應用。
【文檔編號】C12N1/21GK103667229SQ201310307108
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年7月19日 優先權日:2013年7月19日
【發明者】喻德躍, 劉建雨, 王慧 申請人:南京農業大學