一種分離培養家禽內皮祖細胞的方法
【專利摘要】本發明公開了一種分離培養家禽內皮祖細胞的方法，其特征在于包括以下步驟：采集外周血、分離收集得到單個核細胞、加入培養液進行細胞培養、用貼壁細胞和非貼壁細胞的混合物進行培養。根據本發明家禽內皮祖細胞的分離培養方法，可從家禽外周血中分離培養出大量EPCs。
【專利說明】一種分罔培養家禽內皮祖細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及家禽組織與細胞培養工程領域，特別是一種分離培養家禽內皮祖細胞的方法。
【背景技術】
[0002]內皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是一類具有分化為血管內皮細胞的前體細胞，不僅參與胚胎期血管發生，也參與出生后血管新生和血管內皮損傷后的修復過程。當血管內皮受損時，體循環中的EPCs在多種因子的作用下遷移到特定的位點進行分化增生，促進血管修復。EPCs的血管修復作用及定向遷移作用使其在心血管疾病治療領域及基因靶向治療領域顯示出了廣泛的應用前景，是生物醫學領域研究的熱點之一。
[0003]目前，家禽已成為生物醫學研究領域的一類重要試驗動物，相關研究為醫學研究提供了重要的比較醫學知識。目前已有從家禽骨髓細胞中分離培養EPCs的報道，但最新的科學研究表明，從骨髓細胞中分離培養的疑似EPCs的細胞并不是真正意義上的EPCs。
[0004]對哺乳動物的研究發現，通過培養外周血單個核細胞可獲得EPCs。目前常用的方法是:利用淋巴細胞分離液富集外周血單個核細胞，用含有胎牛血清和多種生長因子的EGM-2或EGM-2MV培養基稀釋細胞，在37°C、5% CO2條件下培養，24h后徹底去除未貼壁細胞，繼續培養后可獲得EPCs。也有研究表明培養非貼壁細胞可獲得EPCs。但經我們多次探索后發現，單純培養貼壁細胞或非貼壁細胞均難以成功獲得家禽EPCs，表明分離培養哺乳動物EPCs的方法并不適用于分離培養家禽EPCs。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供`一種分離培養家禽內皮祖細胞的方法。
[0006]一種分離培養家禽內皮祖細胞的方法，其特征在于包括以下步驟:
(1)選取20日齡健康肉雞，翅下靜脈采集外周血；
(2)用L-DMEM培養基按體積比1:1稀釋外周血后，再按體積比1:1緩慢滴加到雞淋巴細胞分離液中，2000 rpm離心15min后棄上清液,收集得到單個核細胞；
(3)將收集到的單個核細胞用L-DMEM培養基離心洗滌1-2次，收集細胞，用EGM-2培養基重懸細胞并計數；所述EGM-2培養基含有體積百分比為10%的胎牛血清、100 IU/mL雙抗以及血管內皮生長因子、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和胰島素樣生長因子-1 ;
(4)分別將單個核細胞按5X IO7個/孔、I X IO7個/孔和I X IO6個/孔的量種植于用50 u g/ml濃度的鼠尾膠原蛋白預先包被過的6孔細胞培養板中，置39°C、5% CO2培養箱中進行原代培養；每24h半量換液一次；5天后每24 h換液一次,7天后每48h換液一次直到傳代。
[0007]本發明對家禽內皮祖細胞的分離、培養、純化等過程，和培養液的成分進行了改進。根據本發明家禽內皮祖細胞的分離培養方法，用貼壁細胞和非貼壁細胞的混合物進行培養，可從家禽外周血中分離培養出大量EPCs。所建立的家禽內皮祖細胞模型可用于家禽血管修復機制、細胞的發育與代謝等相關研究，并為這些研究提供了便利。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0008]圖1是單個核細胞初始接種量對分離培養EPCs的影響示意圖。其中，A.5X IO7個 / 孔(200X); B.1XlO7 個 / 孔(100X) ; C.1XlO6 個 / 孔(200X)。
[0009]圖2是EPCs細胞形態學觀察圖。其中A.3d后細胞大部分貼壁并開始出現梭形細胞(100X) ; B.細胞呈克隆性生長(100X) ; C.7 d后出現大量梭狀細胞(100X) ; D.10 d后細胞呈現典型鋪路石樣外觀(100X)。
[0010]圖3是EPCs細胞雙熒光染色結果圖。A.陰性對照；B.Dil-ac-LDL陽性細胞；C.FITC-UEA-1 陽性細胞；D.Dil-ac-LDL 和 FITC-UEA-1 雙陽性細胞(B 和 C 疊加)。
[0011]圖4是EPCs表面標志物檢測結果圖。A: CD31、CD133和VEGFR-2 mRNA的表達；B: CD34 mRNA 的表達。
【具體實施方式】
[0012]下面結合實施例對本發明作進一步的描述。
[0013]實施例1 I材料與方法
1.1實驗動物
20日齡健康AA肉雞。
`[0014]細胞培養板的處理
實驗組培養板用50 y g/ml濃度的鼠尾膠原蛋白進行包被，對照組培養板不經過包被直接使用。
[0015]外周血單個核細胞的分離
于肉雞翅下靜脈采集外周血20ml，EDTA抗凝，用L-DMEM培養基按體積比1:1稀釋后，再按1:1體積比緩慢疊加到雞淋巴細胞分離液上層。2000 rpm離心15min后,收集單個核細胞。
[0016]誘導生長及初始種植細胞濃度對EPCs生長的影響
將收集到的單個核細胞用L-DMEM培養基離心洗滌1-2次(1500rpm、每次5min)。收集細胞，用含有10% (v/v)胎牛血清、100 IU/mL雙抗(100 IU/mL青霉素、100 IU/mL鏈霉素)以及血管內皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和胰島素樣生長因子-KIGF-1)的EGM-2培養基(EGM-2 BulletKit ;生產廠家:美國Lonza公司，產品貨號:CC-3162)重懸細胞并計數。
[0017]分別將單個核細胞按5 X IO7個/孔、I X IO7個/孔和I X IO6個/孔的量種植于預先處理好的6孔細胞培養板中，置39°C、5% CO2培養箱中進行原代培養。每24h半量換液一次，換液時從培養箱中取出培養板，靜置3~5min后,用移液器小心移除培養基上層1/2的液體，以保留未貼壁細胞。5d后每24 h換液一次，7d后每48h換液一次直到傳代。
[0018]鑒定
1.5.1形態學觀察分別于培養后第3、7、10和14d，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。
[0019]和FITC-UEA-1 攝取試驗
EPCs 具有攝取 Dil acetylated low density lipoprotein (Dil-ac-LDL)和 FlTOOxytropislectin I (FITC-UEA-1)的能力，根據這一特性可鑒定EPCs。取第2代細胞經0.25%胰酶消化后重新種植于24孔板，待細胞貼壁后棄掉培養基，加入10 u g/ml Dil-ac-LDL于39°C下孵育4h。棄掉液體，用PBS洗3次，加入4%多聚甲醛固定15min。棄掉液體，用PBS洗3次，加入IOii g/ml FITC-UEA-1常溫下孵育lh，熒光顯微鏡下觀察染色情況并拍照。
[0020]表面標志物檢測
目前認為，CD34、CD133和血管內皮細胞生長因子受體_2 (VEGFR-2)可作為鑒定EPCs的表面標志。CD31是內皮細胞的特異性表面標志，這一標志也常用于鑒定EPCs。本實驗觀察了培養細胞是否表達上述表面標志。收集第2代細胞，采用Trizol試劑提取總RNA，用反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈，以cDNA為模板擴增CD31、CD34、CD133和VEGFR-2基因(引物序列見表1)。PCR反應總體積為20iU，反應體系為:10XPCR Buffer 2W、dNTP Mix(IOmM) 0.5耵、MgCl (25mM) 1.2耵、ddH20 13.叫1、上下游引物各 0.5耵、cDNA 模板 1耵、0.5UM Taq 酶 0.4W。反應條件:94°C預變性 5min ;94°C變性 30s ;55~58°C退火 30s ；72°C延伸30s ；35個循環；72°C延伸5min ;4°C保存。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用Tanon凝膠成像系統觀察并拍照。
[0021]表1.PCR引物序列
【權利要求】
1.一種分離培養家禽內皮祖細胞的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)選取20日齡健康肉雞，翅下靜脈采集外周血； (2)用L-DMEM培養基按體積比1:1稀釋外周血后，再按體積比1:1緩慢滴加到雞淋巴細胞分離液中，2000 rpm離心15min后棄上清液,收集得到單個核細胞； (3)將收集到的單個核細胞用L-DMEM培養基離心洗滌1-2次，收集細胞，用EGM-2培養基重懸細胞并計數；所述EGM-2培養基含有體積百分比為10%的胎牛血清、100 IU/mL雙抗以及血管內皮生長因子、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和胰島素樣生長因子-1 ; (4)分別將單個核細胞按5 X IO7個/孔、I X IO7個/孔和I X IO6個/孔的量種植于用，50 u g/ml濃度的鼠尾膠原蛋白預先包被過的6孔細胞培養板中，置39°C、5% CO2培養箱中進行原代培養；每24h半量換液一次；5天后每24 h換液一次,7天后每48h換液一次直到傳代。
【文檔編號】C12N5/071GK103484423SQ201310308919
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年7月18日 優先權日:2013年7月18日
【發明者】譚勛, 畢師誠 申請人:浙江大學