一種誘導性多能干細胞定向誘導分化為血管內皮樣細胞的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及細胞工程領域，尤其是設及一種誘導性多能干細胞定向誘導分化為血 管內皮樣細胞的方法。
【背景技術】
[0002] 血管的發生和發育對胚胎形成各器官的發育分化，對成體的創傷修復和生殖功 能具有重要意義。血管內皮樣細胞是形成屯、血管封閉管道系統的形態基礎。體外多種細 胞可經誘導分化產生出內皮祖細胞（endothelial progenitor cells, EPCs)/內皮細胞 (endothelial cells, ECs)，由骨髓來源的單個核細胞、血液來源的祖細胞、間充質干細胞 定向誘導分化而成的內皮祖細胞等都已顯示出廣泛的治療前景。但是運些細胞用于替代治 療依然存在缺陷，如單個核細胞和間充質干細胞存在分化效率低、移植的長期效果不顯著 等問題，血液來源的EPCs分化能力有限，起始細胞的數量受限，難W滿足治療的需要量等。
[0003] 人類胚胎干細胞和誘導性多能性干細胞均具備自我更新和無限增殖的潛能，其 向ECs分化的可能性為屯、血管疾病和四肢缺血的治療提供了新途徑。目前普遍采用與小 鼠的基質細胞共培養、誘導形成擬胚體并添加（VEGF)-A、BMP-4、8化-cAMP、（VEGF)-C及 Angiopoietin-1等細胞因子或化學分子或與特殊的二維介質共培養等營造內皮發育微環 境進行誘導分化，整個過程需要在不同階段更換不同的培養基并加入相應作用的細胞因 子，誘導周期一般為15天左右，然后需要進一步利用內皮細胞表面標記CD31、KDR、vWF等進 行分離純化。
[0004] 目前已有多個研究小組從人類胚胎干細胞OiESCs)或人類誘導性多能干細胞 化iPSCs)中分化、分離到了 EPCs/ECs。研究結果顯示，hESCs來源的ECs能形成新的血管， 提高梗死屯、臟的功能，是細胞替代治療中新的細胞來源。美國魏爾康奈爾醫學院利用人體 胚胎干細胞誘導分化內皮細胞，把胚胎干細胞暴露在轉化生長因子-P (TGF-beta)的環境 中時，內皮細胞繁殖速度顯著增強。當把培育的內皮細胞置入老鼠體內時，細胞可W正常工 作，并迅速被老鼠的循環系統所同化，和正常血管細胞一起工作。此外，現有研究還發現可 W利用羊膜穿刺術（amniocentesis)取得的診斷性的產前羊水細胞，對其重編程為數量充 足和穩定的內皮細胞，而且所產生的內皮細胞能夠再生受損的血管和修復受損的器官。美 國威斯康星大學麥迪遜分校的研究人員首次將干細胞轉化成具有血腦屏障特性的內皮細 胞，制成了可保護大腦的屏障模塊。研究人員表示，此前科學家從未借助干細胞生產出特定 的血腦屏障內皮細胞，而其是采用了胚胎干細胞和誘導多能干細胞兩種干細胞來形成血腦 屏障的內皮細胞。
[0005] 由于W hESCs或hiPSCs為起始進行誘導分化的方式不同，導致誘導分化的效率存 在差異。例如，利用邸S添加內皮相關誘導因子進行誘導分化，可能會因為培養的邸S大小 不同，致使誘導分化效率不一；與基質細胞共培養又會帶來不同種屬之間的交叉污染等。
【發明內容】
[0006] 基于此，有必要提供一種能夠消除基質細胞污染，并可縮短誘導周期、提高分化效 率的誘導性多能干細胞定向誘導分化為血管內皮樣細胞的方法。
[0007] 一種誘導性多能干細胞定向誘導分化為血管內皮樣細胞的方法，包括如下步驟：
[0008] 步驟S1，提供或制備誘導性多能干細胞；
[0009] 步驟S2,將化II相關基因轉入所述誘導性多能干細胞中，篩選陽性克隆得到 FLIl-iPSC細胞系，其中所述化II相關基因表達的蛋白質氨基酸序列與SEQ ID NO. 2所示 的氨基酸序列的相似度不低于80% ;
[0010] 步驟S3,將所述化Il-iPSC細胞系置于無飼養層細胞的培養容器中進行培養，使 細胞克隆增殖長大；
[0011] 步驟S4,啟動所述化II相關基因的過表達，并加入蛋白激酶C的誘導劑，將所述 FLIl-iPSC細胞定向誘導分化成血管內皮樣細胞。
[0012] 在其中一個實施例中，所述步驟S1中，采用病毒感染、質粒轉染、mRNA導入、miRNA 導入或化學分子添加方式將誘導因子導入人類細胞中，誘導所述人類細胞分化為誘導性多 能干細胞。
[0013] 在其中一個實施例中，所述誘導因子包括0CT4、S0X2、NAN0G及Lin28。
[0014] 在其中一個實施例中，所述步驟S2中，是利用誘導表達調控系統將所述化II相關 基因轉入所述誘導性多能干細胞中。
[0015] 在其中一個實施例中，所述誘導表達調控系統為四環素誘導表達調控系統、光誘 導表達調控系統或甲氧節氨喀晚誘導表達調控系統。
[0016] 在其中一個實施例中，所述步驟S2中，所述篩選陽性克隆是使用所述表達調控系 統中相應的真核細胞篩選因子進行篩選，并在篩選后挑選單克隆構建得到所述化Il-iPSC 細胞系。
[0017] 在其中一個實施例中，所述真核細胞篩選因子為遺傳霉素G418。
[0018] 在其中一個實施例中，所述遺傳霉素G418的濃度為50~1000 y g/mL。
[0019] 在其中一個實施例中，所述步驟S3中，是將所述化11-iPSC細胞系接種在鋪設有 基質膠的培養皿中，使用mTeSR培養基培養使細胞克隆增殖長大。
[0020] 在其中一個實施例中，所述步驟S4中，是使用向培養容器中加入強力霉素D0X啟 動化II相關基因的過表達。
[0021] 在其中一個實施例中，所述強力霉素D0X的濃度為0. 1~4 y g/mL。
[0022] 在其中一個實施例中，所述蛋白激酶C的誘導劑包括但不限于丙二醇甲酸醋酸 醋。
[0023] 在其中一個實施例中，所述丙二醇甲酸醋酸醋的濃度為0. 1~10 yM。 W24] 上述誘導性多能干細胞定向誘導分化為血管內皮樣細胞的方法采用無 feeder (飼養層細胞）的培養體系，僅通過過表達化II相關基因和激活蛋白激酶C(PKC)通 路就能獲得血管內皮樣細胞，且經過檢測，純度較高。通過使用上述誘導性多能干細胞定向 誘導分化為血管內皮樣細胞的方法，誘導周期短、效率高，且得到的血管內皮樣細胞性能穩 定，不存在基質細胞污染的問題。
【附圖說明】
[00巧]圖1為本發明實施例hiPS誘導形成過程中細胞形態變化示意圖，其中，A :人胚胎 成纖維細胞，B :病毒感染后D4天細胞形態，C :感染2周左右天形成的非ES樣克隆，D-F : 人feeder上傳代培養的典型的iPS克隆，F:iPSCs周邊自發分化的克隆，A-D和F標尺為 200 y m，E 標尺為 50 y m;
[00%] 圖2為本發明實施例hiPSCs中的全能型相關基因表達檢測示意圖；
[0027] 圖3為本發明實施例hiPSCs與hESCs來源的邸不同分化時間點內、中、外立胚層 代表基因表達示意圖，其中，S0X17 :內胚層，RUNX1 :中胚層，PAX6 :外胚層；
[0028] 圖4為本發明實施例hiPSCs中端粒酶水平檢測示意圖；
[0029] 圖5為本發明實施例hiPSCs的免疫組化分析示意圖，其中，A :AKP染色，B: SSEA-3, C :SSEA-4, D :TRA-1-60, E :TRA-1-81，F :0CT4, A 標尺為 200 ym，B-F 標尺為 100 ym；
[0030] 圖6為本發明實施例hiPSCs體外S胚層分化檢測示意圖，其中，A :B-tubulin/ DAPI，B :SMA/DAPI，C :AFP/DAPI，崎胎瘤組織切片顯示S胚層來源的細胞D :軟骨（中胚