專利名稱：一種分離培養人腦膜瘤細胞的方法
技術領域：
本發明屬于生物醫學領域，涉及細胞分離培養方法，具體涉及腦膜瘤細胞分離與培養的方法，尤其涉及一種從離體的人腦膜瘤組織分離和傳代培養腦膜瘤細胞的方法。
背景技術：
據報道，腦膜瘤 為常見的顱內腫瘤，約占顱內腫瘤總數的20%，其中，女性發病率更高。研究顯示，腦膜瘤多數為良性，其病程長，分布大致與蛛網膜粒的分布情況相似，通常以大腦半球矢狀竇旁為最多。手術切除是首選的臨床治療方法，治療實踐顯示，部分腦膜瘤切除之后5年復發率較高；而部分腫瘤因部位較深或鄰近重要腦部結構，術中很難做到手術全切，其中不能切除的、部分切除、或術后復發的常以放射治療為主。目前臨床不能做手術的和放射治療的病人，其他治療選擇余地很小，已成為神經外科醫師治療腦膜瘤的一大難題。腦膜瘤細胞的體外培養是研究其發病及藥物治療的基礎，但原代及傳代培養人腦膜瘤細胞要比其它腫瘤細胞困難得多，迄今尚未建立起穩定高效的腦膜瘤培養方法。然而，腦膜瘤的臨床前研究依賴于體外細胞模型和體內腫瘤模型的建立，體內模型的建立又依賴于高效率的體外細胞模型的建立，因此建立高效的腦膜瘤體外細胞模型成為研究腦膜瘤的必要手段。據研究報道，腦膜瘤組織細胞在體外很難長期傳代培養，國內外許多學者所進行的腦膜瘤細胞的研究大都以原代細胞為主。國外有研究建立了幾株腦膜瘤細胞株，但其中除了惡性者外，大都進行了基因干預才達到永生化，這樣勢必改變腫瘤細胞原有的特性，故而在這種細胞上研究所獲得的結論不能準確反應體內的信息。因此建立高效的腦膜瘤細胞原代培養和傳代培養體系，對研究其發病機制及開發新的藥物治療方法具有重要意義。目前，導致難以大量獲得腦膜瘤原代細胞和傳代培養細胞的因素有以下幾方面:
(I)腦膜瘤組織細胞間質包括基質/纖維多，采用機械分離或單一酶的方法難以消化腦膜瘤組織，硬性機械分離或酶長時間消化，導致細胞破碎，因此自組織中不能獲得大量活細胞；(2)由于腦膜瘤大多數為良性，細胞生長緩慢，不能爬行到離組織塊較遠的無細胞區生長，只能在組織塊周邊爬出生長。所以細胞很難長滿培養瓶底；(3)由于細胞生長速度較慢，單層細胞貼壁培養時，以常規細胞接種密度接種傳代培養，難以長期傳代下去；(4)未建立一種適合腦膜瘤細胞的培養系統，能促進腦膜瘤細胞增殖的生長因子或激素尚不清楚。本發明針對上述問題，建立了一套高效分離和傳代培養人腦膜瘤的方法，獲得了大量腦膜瘤細胞，經腦膜瘤特征性標志物波形蛋白(Vimentin)、上皮膜抗原(EMA)表達鑒定，證明所獲得的細胞均為腦膜瘤細胞。
發明內容
本發明的目的 是克服現有技術的缺陷和不足，提供一種腦膜瘤細胞分離與培養的方法，尤其是一種從人腦膜瘤組織高效分離培養腦膜瘤原代細胞的方法。本發明進一步目的是提供一種穩定傳代培養腦膜瘤細胞的方法。
本發明提供了腦膜瘤細胞原代大規模培養及傳代培養的方法，采用雞尾酒式組合酶將人腦膜瘤組織經分步消化法，獲得腦膜瘤細胞懸液，然后在特定的培養液中低氧培養，獲得大量的原代腦膜瘤細胞；這些原代腦膜瘤細胞能在特定培養液及低氧條件下，懸浮培養至15代以上。本發明中，所述的組合酶包括中性蛋白酶(dispase)、膠原酶(collagenase)、DNA酶(DNase)，所述的組合酶以雞尾酒式配方組成酶消化液；本發明中，所述的人腦膜瘤組織源于離體的病人腦膜瘤組織；本發明中，所述的分步消化法包括四步消化，每步消化后獨立收集消化的懸液進行離心收集細胞；本發明中，所述的特定培養液包括下述組分:DMEM-F12，按1: 50添加B27補劑，20ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，20ng/ml表皮生長因子(EGF)，10ng/ml白血病抑制因子(LIF)、5 μ g/ml 肝素(Heparin), 20nM 孕麗(Progesterone), IOOmM 雄稀二麗(Androstenedione)，50U/ml 青霉素-鏈霉素(penici 11 in-streptomycin)。本發明中，培養過程是采用1-5% O2, 5% CO2的低氧二氧化碳培養系統。具體而言，本發明的一種分離培養人腦膜瘤細胞的方法，其特征在于，其包括步驟:(I)人腦膜瘤原代細胞的分離:采用三種酶成分(dispase、collagenase、DNase)組成的雞尾酒式酶消化液結合機械吹打，分步消化腦膜瘤組織以收集腦膜瘤細胞；(2)人腦膜瘤原代細胞的接種培養:配制特定的腦膜瘤細胞培養液以5X IO5個/ml接種進行原代細胞懸浮培養；
所述的特定的腦膜瘤細胞培養液含:DMEM-F12，添加B27 (I: 50)，20ng/mlbFGF,20ng/ml EGF,10ng/ml LIF>5 μ g/ml Heparin,20nM Progesterone ,IOOmMAndrostenedione ；(3)人腦膜瘤原代細胞的條件性培養:當培養液變黃，更換新鮮培養液時，每次更換一半新鮮培養液，以對腦膜瘤細胞實施條件性培養，該一半新鮮培養液與一半舊的培養液組成的配方稱為條件性培養液；培養條件為37°C，5% CO2,1-5% O2 ；(4):人腦膜瘤細胞的傳代培養a.人腦膜瘤細胞的懸浮傳代培養:當細胞球直徑大于200 μ m時，用TrypLE Express ( 一種改良胰酶)消化為單細胞后1: 2傳代，培養液為條件性培養液，培養條件為 37°C，5% CO2,1-5% O2 ；b.人腦膜瘤細胞的貼壁傳代培養:當細胞球直徑大于200 μ m時，用TrypLE Express消化為單細胞后1: 2傳代，培養液為條件性培養液添加10% FBS，培養條件為37°C，5% CO2,1-5% O2 ;細胞消化傳代采用0.05%的Trypsin (胰酶)，消化后以1: 2傳代接種。(5):人腦膜瘤細胞的鑒定對腦膜瘤細胞進行體外特征鑒定，包括vimentin、EMA> nestin(巢蛋白)、β -tublin(微管蛋白)、GFAP(神經膠質纖維酸性蛋白)、⑶31、⑶34、⑶45免疫熒光染色等指標檢測；(6):人腦膜瘤細胞的凍存與復蘇
采用10% DMS0+90% FBS凍存人腦膜瘤細胞，采用常規復蘇方法復蘇腦膜瘤細胞。本發明所提供的雞尾酒式組合酶及分步消化法有利于保存細胞活力，使消化所得的細胞基本為活細胞，為腦膜瘤細胞原代培養提供了細胞來源。該方法提供的雞尾酒式組合酶、酶分步消化法、特定培養液體系及低氧培養系統有利于腦膜瘤細胞的分離及增殖，為進一步開展腦膜瘤機制及藥物篩選研究提供了細胞來源。本發明的方法具有如下優點，1、有助于獲取到大量可用于基礎研究的腦膜瘤細胞。在本發明中，采用數種酶的雞尾酒式配方消化液，有助于消化細胞間質及纖維；四步消化法有利于保存細胞活力，使消化所得的細胞基本為活細胞，為腦膜瘤細胞原代培養提供了細胞來源。2、提供了一種能促進人腦膜瘤細胞體外增殖的培養液。有證據表明約60% -90%的腦膜瘤表達孕酮受體，60%的腦膜瘤表達雄激素受體。為了促進腦膜瘤細胞的增殖，本發明所采用的培養液為 DMEM-F12，添加 B27 (I: 50)，20ng/mlbFGF, 20ng/ml EGF, 10ng/mlLIF>5 μ g/ml heparin, 50U/ml penicillin-streptomycin,以及 20nM Progesterone, IOOmMAndrostenedione 兩種激素。3、本發明還提供了一種相對高效的腦膜瘤體外培養系統，培養條件為37°C，5%CO2,1-5% O20
4、本發明還檢測了人腦膜瘤細胞的生物學特征和功能，為所述腦膜瘤發病機制的研究和藥物篩選應用提供了可靠的數據，采用本發明獲得的人腦膜瘤細胞不需經過基因干預即能傳代培養至15代以上，為開展腦膜瘤發病機制提供了大量的細胞來源。
圖1.顯示了自腦膜瘤組織消化后接種的單細胞懸液，其中仍含有未完全消化的組織塊。圖2.顯示了原代長成的細胞球。圖3.顯示了原代細胞球消化傳代后長成的細胞球。圖4.顯示了原代細胞球消化傳代后呈單層培養的細胞。圖5.普通熒光顯微鏡顯示視野中的細胞均表達腦膜瘤細胞標志物vimentin。圖6.共聚焦顯微鏡顯示細胞表達腦膜瘤細胞標志物vimentin。圖7.共聚焦顯微鏡顯示了腦膜瘤細胞標志物vimentin與EMA共標記突光鑒定結果O圖8.共聚焦顯微鏡顯示了腦膜瘤細胞標志物vimentin與VEGF共標記突光鑒定結果。圖9.顯示了腦膜瘤細胞標志物western-blot鑒定結果。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明，應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。實施例1I材料與方法:
1.1試劑均為細胞培養級試劑，除另有說明外均為GIBCO產品。1.2材料來自復旦大學附屬華山醫院神經外科腦膜瘤患者手術切除的離體的腦膜瘤組織,共6例。1.3 方法(I)人腦膜瘤原代細胞的分離:a.無菌收集離體人腦膜瘤組織，將手術切除的腦膜瘤組織在冰預冷的HBSS中洗滌5次以上。b.用剪刀剪碎組織，將組織在含Dispase/Collegnase和0.04%的DNase的PBS中于37°C孵育30分鐘，巴斯德吸管吹吸十次以上，然后垂直靜止離心管5分鐘，收集上層消化懸液，離心收集消化下來的細胞；c.添加適量酶于下層未消化完全的組織，放入培養箱消化15分鐘，巴斯德吸管吹吸十次以上，然后垂直靜止離心管5分鐘，收集上層消化懸液，離心收集消化下來的細胞；d.重復步驟c兩次(2)人腦膜瘤原代細胞的接種培養:以5X IO5個/ml接種在培養瓶中，培養液為DMEM-F12，添加 B27(l: 50)，20ng/ml bFGF, 20ng/ml EGF, 10ng/ml LIF,5y g/ml Heparin,20nM Progesterone, IOOmM Androstenedione。培養條件為 371,5% CO2, 3% 02。(3)人腦膜瘤原代細胞的條件性培養:當培養液變黃，更換新鮮培養液時，每次更換一半新鮮培養液，以對腦膜瘤細胞實施條件性培養，該一半新鮮培養液與一半老的培養液組成的配方稱為條件性培養液。培養條件為37°C，5% CO2, 3% 02。
`
(4):人腦膜瘤細胞的傳代培養對所有離體人腦膜瘤組織的腦膜瘤細胞實施兩種傳代培養方式:a.人腦膜瘤細胞的條件性懸浮傳代培養:當細胞球直徑大于200μπι時，用TrypLE Express消化為單細胞后1: 2傳代。培養液為條件性培養液。培養條件為37°C，5% CO2, 3% O20b.人腦膜瘤細胞的貼壁傳代培養:當細胞球直徑大于200 μ m時，用TrypLETMEXpreSS消化為單細胞后1: 2傳代。培養液為條件性培養液添加10% FBS。培養條件為37°C，5% C02，3% 02。待細胞完全長滿后，0.05%的Trypsin消化后以1: 2傳代接種。(5):人腦膜瘤細胞的鑒定a.細胞免疫突光鑒定腦膜瘤標志物表達:檢測的標記物包括vimentin、EMA、nestin、β _tublin、GFAP、CD31、CD34、CD45免疫熒光染色等指標檢測。細胞經PBS清洗，室溫下4%多聚甲醛中固定10分鐘。于含0.2% Triton X-100的PBS中室溫下孵育5分鐘后，經PBS清洗兩次，細胞于含4% BSA、10% FBS的PBS中室溫下封閉60分鐘。所用的一抗、二抗均以含4% BSAUO % FBS的PBS稀釋。一抗孵育過夜，經PBS洗滌三次后，加入相應的二抗于室溫孵育3小時，PBS洗滌三次。用含DAPI的抗熒光淬滅劑復染后，封片觀察。b.western-blot鑒定腦膜瘤標志物表達:檢測的蛋白包括vimentin、EMA>nestin、β-tublin、GFAP、⑶31、⑶34、⑶45免疫熒光染色等指標檢測。離心收集細胞后，用蛋白裂解液裂解細胞，蛋白定量后，上樣電泳、轉膜。然后經一抗、二抗依次孵育標記，化學發光，顯影，定影，觀察拍照。
(6):人腦膜瘤細胞的凍存與復蘇500g離心收集細胞，吸去上清，加入細胞凍存液(10% DMS0+90% FBS)，分裝于細胞凍存管，每管500μ 1，放入凍存盒于-80°c冰箱中過夜。第二天轉移入液氮中長期保存。將細胞在37°C水浴中解凍，然后300g離心去除冷凍液，加入人腦膜瘤細胞培養液，放入37°C，5% CO2, 3% O2進行培養。2.結果顯示2.1.細胞分離與傳代培養概況采用三種酶的雞尾酒式配方消化液消化腦膜瘤組織，結合機械吹打的方法，自每位患者的腦膜瘤組織均獲得了大量的單細胞(如圖1所示)。這些細胞在特定的培養液(DMEM-F12，添加 B27(l: 50)，20ng/ml bFGF, 20ng/ml EGF，10ng/mlLIF、5 μ g/ml heparin,50U/ml penicillin-streptomycin,20nM Progesterone,IOOmMAndrostenedione0 )中，37°C,5% CO2, 3% O2低氧培養系統中能形成細胞球生長。細胞球消化后可繼續呈細胞球或單層細胞生長(如圖2、3所示)，但細胞增殖較慢，一般需8-9天可傳代一次；本發明中的條件性特定培養液能促進腦膜瘤細胞呈細胞球或單層細胞增殖，傳代達15代以上。細胞在10% DMS0,90% FBS中凍存后，可復蘇繼續培養增殖。2.2.免疫熒光鑒定腦膜瘤細胞標志物
免疫熒光分析結果顯示6位患者的離體腦膜瘤組織培養的腦膜瘤細胞均表達vimentin,圖5顯示在普通突光顯微鏡下(低倍)，視野中的細胞均表達vimentin,證明所獲得的細胞均為腦膜瘤細胞；熒光共聚焦顯微鏡進一步顯示vimentin的表達特征(呈絲狀微觀分布，如圖6所示)、以及其與EMA的共表達(如圖7所示)；鑒定結果還發現腦膜瘤細胞表達VEGF(如圖8所示)，提示腦膜瘤細胞具備潛在的血管生成能力；鑒定結果顯示所獲得的細胞均不表達神經細胞的標志物nestin、β -tubI in,GFAP,以及⑶31、⑶34、⑶45等膜抗原；所有結果證實，本發明獲得的細胞為腦膜瘤組織來源的腦膜瘤細胞。2.3.western-blot鑒定腦膜瘤細胞蛋白表達western-blot結果顯示6位患者的離體腦膜瘤組織培養的腦膜瘤細胞均表達vimentin、EMA，VEGF(如圖 8 所示)，不表達 nestin、β _tublin、GFAP、CD31、CD34、CD45，結果證明獲得的細胞均為腦膜瘤細胞。
權利要求
1.一種分離培養人腦膜瘤細胞的方法，其特征在于，采用雞尾酒式組合酶將離體的人腦膜瘤組織進行分步消化，獲得腦膜瘤細胞懸液，在特定的培養液中低氧培養，獲得原代腦膜瘤細胞；獲得原代腦膜瘤細胞在特定的培養液及低氧條件下，懸浮培養至15代以上。
2.按權利要求書I所述的方法，其特征在于，該方法包括步驟: (1)分離人腦膜瘤原代細胞:采用組合酶組成的雞尾酒式酶消化液結合機械吹打，分步消化離體的腦膜瘤組織以收集腦膜瘤細胞； (2)接種培養人腦膜瘤原代細胞:配制腦膜瘤細胞特定培養液以5X IO5個/ml接種進行原代細胞懸浮培養， (3)條件性培養人腦膜瘤原代細胞:當培養液變黃，更換一半新鮮培養液，該一半新鮮培養液與另一半舊的培養液組成條件性培養液，培養條件為37°C，5% CO2,1-5% O2 ； (4):傳代培養人腦膜瘤細胞 a.人腦膜瘤細胞的懸浮傳代培養:當細胞球直徑大于200μ m時,用TrypLE Express改良胰酶消化為單細胞后1: 2傳代，培養液為條件性培養液，培養條件為37°C，5% C02，1-5% O2 ； b.人腦膜瘤細胞的貼壁傳代培養:當細胞球直徑大于200μ m時,用TrypLE Express消化為單細胞后1: 2傳代，培養液為條件性培養液添加10% FBS，培養條件為37°C，5%CO2,1-5% O2 ;細胞消化傳代采用0.05%的胰酶(Trypsin)，消化后以1: 2傳代接種。
(5):人腦膜瘤細胞的鑒定 采用vimentin、EMA、巢蛋白(nestin)、微管蛋白(β-tublin)、神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、⑶31、⑶34和⑶45指標檢測腦膜瘤細胞體外特征。`
3.按權利要求書I或2所述的方法，其特征在于，所述的組合酶包括中性蛋白酶、膠原酶和DNA酶。
4.按權利要求書I或2所述的方法，其特征在于，所述的分步消化包括四步消化，每步消化后獨立收集消化的懸液進行離心收集細胞。
5.按權利要求書I或2所述的方法，其特征在于，所述的特定培養液包括下述組分:DMEM-Fl2,按I: 50添力口 B27補劑，20ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，20ng/ml表皮生長因子(EGF), 10ng/ml白血病抑制因子(LIF)、5 μ g/ml肝素(Heparin), 20nM孕酮(Progesterone), IOOmM 雄烯二酮(Androstenedione), 50U/ml 青霉素-鏈霉素(penici11 in-streptomycin)。
6.按權利要求書I或2所述的方法，其特征在于，所述培養過程中采用1-5%O2, 5%CO2的低氧二氧化碳培養系統。
7.按權利要求書2所述的方法，其特征在于，所述的懸浮培養是指細胞在特定培養液及低氧系統中呈細胞球生長。
8.按權利要求書2所述的方法，其特征在于，所述的貼壁培養是指細胞在特定培養液添加10%血清及低氧系統中呈單層細胞貼壁培養。
全文摘要
本發明屬于生物醫學領域，涉及腦膜瘤細胞分離與培養的方法，尤其涉及一種從離體的人腦膜瘤組織分離和傳代培養腦膜瘤細胞的方法。本發明方法采用雞尾酒式組合酶將離體的人腦膜瘤組織進行分步消化，獲得腦膜瘤細胞懸液，在特定的培養液中低氧培養，獲得原代腦膜瘤細胞；獲得的原代腦膜瘤細胞在特定的培養液及低氧條件下，懸浮培養至15代以上。本發明的雞尾酒式組合酶及分步消化法有利于保存細胞活力，使消化所得的細胞基本為活細胞，為腦膜瘤細胞原代培養提供了細胞來源。該方法有利于腦膜瘤細胞的分離及增殖，為進一步開展腦膜瘤機制及藥物篩選研究提供了細胞來源。
文檔編號C12N5/09GK103103162SQ20111036212
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月15日 優先權日2011年11月15日
發明者宮曄, 沙紅英, 湯海亮, 謝清, 鄭名哲, 汪戴軍, 陳銜城, 毛穎, 周良輔 申請人:復旦大學附屬華山醫院