利用大腸桿菌原核表達系統生產的小麥蛋白質二硫鍵異構酶及方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用大腸桿菌原核表達系統生產的小麥蛋白質二硫鍵異構酶及方法和應用。采用技術方案是：從小麥幼葉中提取小麥總RNA，經RT-PCR獲取wPDI基因。將目的基因連接到載體PET-30b中，構建重組質粒。將重組質粒轉入到大腸桿菌BL21感受態細胞中，在LB培養基中誘導表達，培養重組大腸桿菌，離心收集菌體細胞；用超聲法破碎菌體細胞后，離心后收集上清液；經一次Ni-sepharose親和層析，獲得wPDI。本發明通過大腸桿菌表達系統，實現了wPDI大量表達和簡便的純化工藝；獲得的wPDI在面粉的加工品質實驗中顯示了良好的改善小麥加工品質的作用，可用于面粉加工中。
【專利說明】利用大腸桿菌原核表達系統生產的小麥蛋白質二硫鍵異構酶及方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明設計利用大腸桿菌原核表達系統生產小麥蛋白質二硫鍵異構酶的方法及在面粉加工中的應用，屬于微生物、分子生物學、基因工程及谷物化學領域。
【背景技術】
[0002]小麥是重要的糧食作物，為全球近40%人口提供主要糧食，我國小麥產量占世界總產量的六分之一。小麥面粉既具有良好的營養功能，又能加工成不同需求、適口性好、夕卜形美觀的面制品。麥谷蛋白在面團中所形成的網絡結構賦予小麥面粉以加工品質，麥谷蛋白亞基間 硫鍵則是網絡結構形成的基礎，因此，面粉的加工品質與麥谷蛋白聚集體中 硫鍵的數量和質量密切相關。
[0003]與世界其它國家相比，我國小麥的加工品質較差，改良小麥加工品質是小麥育種領域和谷物化學領域一直致力于解決的關鍵問題之一，而且，隨著人們對食品加工品質的要求不斷提高，控制并提高加工品質已成為面制品加工產業的重要任務之一。二氧化氯、過氧化鈣等“化學”氧化還原劑能影響面筋網絡的形成和性質，改變面筋強度，是谷物加工領域較為普遍應用的面粉改良劑。由于“化學”面粉改良劑有可能帶來潛在的食品安全問題，天然、安全的面粉改良劑越來越受到面制品加工領域的青睞。
[0004]小麥面粉中內源酶之一-小麥蛋白質二硫鍵異構酶(Wheat Protein
Disulfide Isomerase,wPDI)能催化蛋白質二硫鍵的形成和正確配對。蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)是一種屬于硫氧還蛋白家族、存在于各種真核生物細胞內質網中的氧化還原酶，具有催化二硫鍵形成的氧化活性、促使錯誤配對的二硫鍵重排的異構酶活性及指導蛋白質正確折疊的分子伴侶活性，對維持蛋白質分子的穩定性和功能具有不可替代的作用。
[0005]在國際上，小麥roi (wPDI)應用于改善面粉加工特性有零星報道。Every等從小麥麩皮和胚芽等組織中分離wPDI，通過面包烘焙實驗證明PDI在微量抗壞血酸存在的條件下能改善面包的烘焙品質，但沒有添加抗壞血酸時則未見對面包品質有明顯的改進，而日本的高野克己等發現僅使用E.coli (大腸桿菌)重組wPDI對面包的烘焙品質仍然具有改進作用，而且，在黃素蛋白和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)協同下，可以大大提高wPDI改善面團加工品質的能力。一般認為，wPDI改善面粉加工品質是通過PDI氧化活性催化麥谷蛋白之間形成二硫鍵的交聯網狀結構實現的，而添加氧化還原劑(FAD、抗壞血酸)則可以有效地向wPDI提供氧化當量，提高PDI氧化二硫鍵形成的效率。
[0006]PDI在小麥中的含量較少，通過提取分離純化不僅得率低且工藝復雜，近年來，已有通過原核表達的方法獲得小麥roi的文獻報道，但原核表達的量依然很低，且要進行幾種組合的層析方式才能達到較高純度，且酶活損失嚴重。
【發明內容】
[0007]為了解決上述問題，本發明通過大腸桿菌表達系統，實現了大量表達wPDI，并通過一次柱層析獲得較高純度的酶，克服了原核表達量低，純化復雜的問題。
[0008]為了實現上述目的，本發明采取如下技術方案:
[0009]利用大腸桿菌原核表達系統生產小麥蛋白質二硫鍵異構酶的方法，包括如下步驟:
[0010](I)從小麥幼葉中提取小麥總RNA，通過RT-PCR獲取小麥蛋白質二硫鍵異構酶基因，將此基因連接到PMD-19T載體上，從T載體上克隆的目的基因經酶切后，插入到載體質粒PET-30b中，酶切位點分別為BamH I和Xho I，構建出表達蛋白質二硫鍵異構酶基因的質粒 PET30b-wPDI ；
[0011](2)將質粒PET30b_wPDI轉入大腸桿菌BL21感受態細胞中，得到重組大腸桿菌；將重組大腸桿菌接種于LB培養基中進行搖瓶培養，當菌液OD值達到0.6-0.8時，在低溫條件下用0.5mM IPTG誘導6_7小時后，4°C離心收集菌體細胞；
[0012](3)用超聲破碎法冰浴裂解細胞，除去不溶性細胞碎片，收集上清液；將上清液過N1-sepharose親和層析柱,經梯度洗脫得到帶有組氨酸標簽的蛋白質二硫鍵異構酶。
[0013]為了獲得高效并可溶的表達，目的基因的表達去掉信號肽部分，引物的設計在不改變氨基酸序列的情況下進行了三處堿基突變，并在目的片段C端和N端分別帶入His標簽；引物序列為 5’ -CGGATCCAGAGGAAGCCGCAGCCG-3’，5’ -CCTCGAGGAGCTCGTCCTTCAGAG-3’。
[0014]所述RT-PCR 中所用弓丨物序列為:5 ’ -ATGGCGATCTGCAAGGTCTGG-3 ’，5 ’ -TCAGAGCTCGTCCTTCAGAGGC-3，。
[0015]步驟(3)所述超聲破碎法冰浴裂解細胞的條件為:振幅20%，0.4s 一次，每5min停止一次，共進行兩次，10000rpm，4°C離心15min。
[0016]上述方法生產的蛋白質二硫鍵異構酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1。原始的氨基酸序列如下:EEAAAEEAAAAPEAVLTLHADNFDDAIAKHPFILVEFYAPWCGHCKSLAPEYEKAAQLLSKHDPAIVLAKVDANDEKNKPLAGKYEVQGFPTLKIFRNGGKNIQEYKGPREAEGIVEYLKKQVGPASKEIKAPEDATYLEDGKIHIVGVFTEFSGTEFTNFLELAEKLRSDYDFGHTVHANHLPRGDAAVERPLVRLFKPFDELVVDSKDFDVSALEKFIDASSTPKVVTFDKNPDNHPYLLKYFQSNAPKAMLFLNFSTGPFESFKSAYYGAVEEFSGKDVKFLI⑶IEASQGAFQYFGLKEDQAPLILIQDSDSKKFLKEQVEAGQIVAWLKDYFDGKLTPFRKSEPIPEANNEPVKVVVADNIHDVVFKSGKNVLIEFYAPWCGHCKKLAPILDEAAATLQSEEDVVIAKIDATANDVPGEFDVQGYPTLYFVTPSGKKVSYEGGRTADEIVDYIKKNKETAGQAAAAATEKAAEPAATEPLKDELLE
[0017]與現有技術相比，本發明具有如下有益效果:
[0018](I)本發明采用原核表達的方法，獲得了可溶性的具有生物活性的小麥roi，表達量占總表達蛋白的40-50%，表達量較高，且分離純化只需一次親和層析，簡便高效，易于大量表達，適合工業化生產。
[0019](2)本發明所得的wPDI,經N1-sepharose親和層析,可一步實現wPDI的純化，SDS-PAGE結果證明wPDI的純度超過95%。
[0020](3)獲得純化的wPDI經透析除鹽、濃縮后，按照一定添加量進行面團的揉混后，用質構儀測定wPDI對面粉加工品質的影響，結果顯示wPDI對面團的彈性、內聚力等均有積極的影響。
[0021](4)本發明在構建表達載體的過程中，所使用的引物將編碼基因在不改變氨基酸序列的情況下做了 3處喊基突變，并在C端和N端分別加入His標簽，提聞了目的蛋白的表達量和純化過程中的結合能力。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1用于構建重組wPDI的PET_30b質粒。
[0023]圖2提取小麥總RNA的凝膠電泳圖，泳道I的條帶為樣本總RNA的三條帶，分別為28sRNA, 18sRNA 和 5sRNA。
[0024]圖3經RT-PCR獲得的小麥wPDI基因的凝膠電泳圖。
[0025]圖4構建的PET30b_wPDI重組質粒酶切鑒定凝膠電泳圖。
[0026]圖5重組wPDI經親和層析后的SDS-PAGE圖譜，1.標準蛋白分子量；2.發酵上清液；3.通過N1-sepharose純化后的樣品。
【具體實施方式】
[0027]下面結合具體實施例對本發明作進一步具體詳細描述，但本發明的實施方式不限于此，對于未特別注明的 工藝參數，可參照常規技術進行。本發明的實施例中使用的品種為“中優9507”的小麥種子購于糧食市場；限制性內切酶Bam I和Xho 1、PMD_19T載體均購自大連寶生物工程技術有限公司；大腸桿菌DH5 α和BL21 (DE3)、PET_30b購自Novagen公司；引物合成及序列測序工作由華大基因完成。
[0028]實施例1
[0029]利用大腸桿菌原核表達系統生產小麥蛋白質二硫鍵異構酶的方法，具體步驟如下:
[0030]—、小麥蛋白質二硫鍵異構酶(wPDI)表達載體的構建
[0031]LwPDI基因的獲得
[0032]取生長8-10天的小麥幼葉，液氮中研磨成粉末，用RNA提取試劑盒提取小麥總RNA(如圖1所示)，通過RT-PCR獲得小麥PDI的基因。根據NCBI上對植物PDI的序列分析表明PDI具有高度的保守性，因此根據其保守區設計引物，RT-PCR中所用引物序列為:5’ -ATGGCGATCTGCAAGGTCTGG-3 ’，5 ’ -TCAGAGCTCGTCCTTCAGAGGC-3，，獲得的小麥 PDI 基因切膠回收后，加A尾，連到PMD-19T中，送華大基因測序。
[0033]測序結果顯示，克隆得到的此PDI基因大小為1548bp (如圖2所示)上述來源于小麥“中優9507”的wPDI序列與NCBI上編號為AF262979.1來源于小麥Wyuna品種的具有99%的相似性，wPDI的基因序列如SEQ ID N02。
[0034]2.構建wPDI重組質粒
[0035]為了將連接到T載體上的去信號肽部分的wPDI基因插入到表達質粒中，并獲得高效的表達，在其前端添加保護堿基、酶切位點的同時，不改變氨基酸序列的情況下做了三處堿基突變，且除掉終止密碼子，使編碼基因在C端和N端分別帶一個His標簽，引物序列如:
[0036]5，-CGGATCCAGAGGAAGCCGCAGCCG-3，，
[0037]5’ -CCTCGAGGAGCTCGTCCTTCAGAG-3’由華大基因合成。通過亞克隆得到去信號肽且堿基突變的wPDI后，經限制性內切酶Bam I和Xho I處理wPDI基因片段和PET_30b載體，T4連接酶16°C反應30min，得到連接反應液。
[0038]3.轉化大腸桿菌BL21[0039]將連接反應液轉化到表達宿主大腸桿菌BL21感受態細胞中，化學方法轉化后將菌液涂布在含有Kan的LB平板上，37°C培養16h，篩選陽性克隆。
[0040]挑取陽性單克隆，進行菌落PCR和提質粒酶切鑒定，確定wPDI被插入到表達質粒中，再由華大基因測序確認。
[0041]實驗結果:經酶切及測序分析，成功構建了表達重組wPDI的原核表達載體，獲得了帶有重組質粒PET30b-wPDI的重組大腸桿菌(酶切鑒定結果如圖4所示)。
[0042]二、重組wPDI誘導表達及純化
[0043]1.重組wPDI的誘導表達
[0044]將重組大腸桿菌接種于含有Kan (50 μ g/ml)的5ml LB培養基中，搖菌過夜，次日按1%的接種量將培養好的菌液接種到含有Kan (50 μ g/ml)的IOOmlLB培養基中培養，當菌液吸光度在0.6-0.8時，0.5mM IPTG，16_22°C進行誘導，誘導時間6_7h。帶兩個His標簽的目的蛋白分子量大小約為60kDa，在SDS-PAGE上顯示的66kDa的位置基本相符(如圖5所示)。
[0045]2.重組wPDI的純化
[0046]誘導表達后的菌液經10000rpm，4°C離心15min，收集菌體細胞。將菌體細胞用
0.02M PBS重懸(每IOOml菌液菌體加5ml緩沖液)。
[0047]超聲法破碎菌體細胞，振幅:20%，周期0.4s，每5min間隔停一次觀察破碎情況。處理后，IOOOOrpm離心15min，去除不溶性細胞碎片，收集上清液。
[0048]將上清液低速上樣于N1-`S印harose親和層析柱中，平衡緩沖液(0.02M PBS, 0.5MNaCl, ρΗ8.0)平衡至基線，洗脫緩沖液(0.02Μ PBS, 0.5Μ NaCl, 0.5Μ咪唑，ρΗ8.0)梯度洗脫，收集洗脫峰，濃縮除鹽，SDS-PAGE分析純度(如圖5所示)。
[0049]實驗結果:經SDS-PAGE、Western-blot驗證,成功表達并純化出重組wPDI。
[0050]實施例3
[0051]重組wPDI對面粉加工品質功能的影響
[0052]每8g面粉加8.9ml水/BSA溶液/蛋白質溶液(蛋白質加入量為:Img蛋白/g面粉，加入BSA的實驗組均為對照)進行揉混，揉混時間5min，制備成邊長約1cm，高度約1.3cm的長方體，放置于質構儀上進行測定，每組實驗做5個樣品，測量的5個數據取平均值。質構儀探頭為P/36R，測前速度1.0mm/s，測試速度2.0mm/s，測后速度2.0mm/s,壓縮比50%，2次間隔時間10s。
[0053]實驗結果:比較在和面過程中分別為空白/BSA/wPDI的質構數據(參見表I )，和面過程中加入wDPI的實驗組，在面團的硬度、彈性、內聚力、膠黏性、咀嚼性及回彈性上具有不同程度的增加，從總體趨勢看來，wPDI對小麥面粉的加工品質有積極的影響作用。
[0054]表I
[0055]
【權利要求】
1.利用大腸桿菌原核表達系統生產小麥蛋白質二硫鍵異構酶的方法，其特征在于，包括如下步驟: (O從小麥幼葉中提取小麥總RNA，通過RT-PCR獲取小麥蛋白質二硫鍵異構酶基因，將此基因連接到PMD-19T載體上，從T載體上克隆的目的基因經酶切后，插入到載體質粒PET-30b中，酶切位點分別為BamH I和Xho I，構建出表達蛋白質二硫鍵異構酶基因的質粒PET30b-wPDI； (2)將質粒PET30b-wPDI轉入大腸桿菌BL21感受態細胞中，得到重組大腸桿菌；將重組大腸桿菌接種于LB培養基中進行搖瓶培養，當菌液OD值達到0.6-0.8時，在低溫條件下用0.5mM IPTG誘導6-7小時后，4°C離心收集菌體細胞； (3)用超聲破碎法冰浴裂解細胞，除去不溶性細胞碎片，收集上清液；將上清液過N1-sepharose親和層析柱,經梯度洗脫得到帶有組氨酸標簽的蛋白質二硫鍵異構酶。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(I)將目的基因插入到PET-30b所用的引物序列為 5’ -CGGATCCAGAGGAAGCCGCAGCCG-3’，5’ -CCTCGAGGAGCTCGTCCTTCAGAG-3’。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，
所述 RT-PCR 中所用弓 I 物序列為:5 ’ -ATGGCGATCTGCAAGGTCTGG-3 ’，5 ’ -TCAGAGCTCGTCCTTCAGAGGC-3，。
4.根據權利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述超聲破碎法冰浴裂解細胞的條件為:振幅20%, 0.4s—次,每5min停止一次,共進行兩次，IOOOOrpm, 4°C離心15min。
5.權利要求1或2或3或4所述方法生產的蛋白質二硫鍵異構酶。
6.根據權利要求5所述的蛋白質二硫鍵異構酶，其特征在于，所述蛋白質二硫鍵異構酶的氨基酸序列為SEQ ID NO:1。
7.權利要求5所述蛋白質二硫鍵異構酶在面粉加工中的應用。
【文檔編號】C12R1/19GK103436516SQ201310373089
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月23日 優先權日:2013年8月23日
【發明者】胡松青, 張婷婷, 侯軼, 劉光毅, 李琳 申請人:華南理工大學