一種pcv2病毒樣顆粒及其制備方法和裂解及vlp組裝緩沖液的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種PCV2病毒樣顆粒及其制備方法和裂解及VLP組裝緩沖液。基于自主優化設計，并人工合成適合在原核表達系統中高效表達的PCV2核衣殼蛋白基因，通過大腸桿菌原核表達系統表達PCV2核衣殼蛋白的全長基因序列，并利用其可溶性核衣殼蛋白在特定條件下高效自體組裝成了病毒樣顆粒。本發明創新點主要在于采用不同于常規的真核表達系統獲取VLPs方法，而是利用原核表達系統獲取PCV2VLPs，本方法成本低廉、簡單高效，適合大規模產業化應用；其中還應用到獨創的既可以促進菌體裂解又能適合VLPs自體組裝的雙功能于一體的緩沖液配方；另外發明所獲得的PCV2病毒樣顆粒與野生型病毒外形相似度高，并且免疫原性好，可以用于研發具有應用潛力的豬圓環病毒的亞單位疫苗及藥物傳遞載體。
【專利說明】—種PCV2病毒樣顆粒及其制備方法和裂解及VLP組裝緩沖液
【技術領域】
[0001]本發明屬于豬圓環病毒疫苗研究【技術領域】，具體涉及一種PCV2病毒樣顆粒的制備方法、及該方法制備得到的病毒樣顆粒，還有方法中用到的裂解及VLP組裝緩沖液。
【背景技術】
[0002]豬圓環病毒二型(porcine circovirus type2, PCV2)屬于圓環病毒科，直徑約為17nm，無囊膜，二十面體對稱，共價閉合環狀單股DNA病毒。PVC2是引起仔豬斷奶后多系統衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的主要病原，還會導致育肥豬皮炎與腎病綜合征(porcine dermatis and nephropathy syndrome, F1DNS)、豬呼吸道綜合征(porcine respiratory disease complex, PRDC)、新生仔豬的腹?寫病等綜合征以及豬體內免疫抑制，很難進行有效的藥物治療，此外，PVC2常與諸多病原并發或繼發感染，無疑為PVC2感染的準確診斷及有效防控增加了難度。PVC2該病毒目前已經在世界主要養豬生產大國的豬群中廣泛傳播，并已造成巨大的經濟損失，建立高效預防方法對病毒的綜合防控具有重要意義。
[0003]豬圓環病毒疫苗的研制成功于2006年并開始在北美應用，給全球養豬業帶來了福音；2009年勃林格豬圓環病毒疫苗在中國首家注冊成功和2010年第一個上市，2010年下半年國產疫苗的陸續上市。目前的亞單位疫苗就是將PCV2基因組中編碼免疫原性蛋白的0RF2片段插入到昆蟲桿狀病毒中，通過培養昆蟲桿狀病毒而快速、大量獲得具備免疫原性的PCV2核衣殼蛋白，再將其制備成疫苗。如勃林格殷格翰動物保健(美國)有限公司的FLEX系列茵格發豬圓環病毒疫苗和英特威/先靈葆雅動物保健公司的PCV2疫苗。還有一種是嵌合病毒滅活苗，原理是用PCV2的0RF2片段置換為不致病的PCVl中的0RF2片段，即獲得了 PCV1-PCV2嵌合病毒，具有與PCV2類似的免疫原性。輝瑞/富道動物保健公司研制的PCV2疫苗即是采用了這種技術。全病毒PCV2滅活疫苗，由于PCV2難培養、生長慢及難滅活，培養成本高，生產周期長，所以多數動物保健公司采用成熟的分子生物技術生產亞單位疫苗。目前在國外只有梅里亞動物保健公司生產全病毒滅活疫苗，適用于母豬免疫。已經注冊的國產圓環病毒疫苗均為全病毒滅活疫苗。2010年分別由哈爾濱獸醫研究所用LG株、南京農業大學用SH株研制而成的“圓克清”。由哈爾濱維科生物技術開發公司、上海海利生物藥品有限公司生產出豬圓環病毒2型LG株全病毒滅活疫苗“圓畢凈”；由洛陽普萊柯生物工程有限公司、江蘇南農高科技股份有限公司生產出豬圓環病毒2型SH株全病毒滅活疫苗，2011北京大北農集團研發出“諸歡泰”。以上全病毒培養物在滅活前的病毒含量約105 5-6_°TCID5(l/mL。應用的滅活劑為甲醛溶液(福爾馬林)。在國際上應用PK-15傳代細胞培養PCV2的最高含量很難超過103_5TCID5(l/mL，而國內應用微載體細胞懸浮培養技術，使抗原效價提高了 100多倍。抗原蛋白純化是減少疫苗過敏反應的重要一環，國產疫苗亟待提高純化工藝，以達到無超量雜質蛋白。
[0004]中國豬圓環病毒疫苗市場情況匯總
[0005]
【權利要求】
1.一種PCV2病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，依次包括以下步驟: 1)選取利用密碼子的兼并性，人工合成的適合于原核表達的編碼PCV2核衣殼蛋白全長基因； 2)將基因序列與表達質粒載體重組得到的重組質粒轉化大腸桿菌，然后加入IPTG，使得體系中其濃度為0.1-lmM，并在25-37°C進行誘導表達； 3)將誘導表達PCV2核衣殼蛋白時獲取的細菌沉淀用以下配方的裂解及VLP組裝緩沖液重懸，超聲處理，離心收集上清，樹脂吸附目的蛋白，然后從樹脂上洗脫目的蛋白；所述的裂解及 VLP 組裝緩沖液配方為:0.1M NaH2PO4.2H20、0.1M Na2HPO4,20mM Imidazole、1mM Tris-base>300mM NaCl、50mM KCl> 2mM MgCl2、0.1M Ammonium citrate>2%Glycerine>0.5%Triton X_100、5mMβ-Me、0.1mM PMSF、lU/mL Leupeptin Protease inhibitor ;其中Triton X-100、β-Me、PMSF、Leupeptin Protease inhibitor 現用現加，緩沖液 pH8.0,余量為純水。
2.根據權利要求1所述的PCV2病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，所述的利用密碼子的兼并性，人工合成的適合于原核表達的編碼PCV2核衣殼蛋白全長基因見SEQ N0.1所示。
3.根據權利要求1所述的PCV2病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，步驟2)所述的表達質粒載體為pET100_D/T0P0。
4.根據權利要求1所述的PCV2病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，步驟2)中IPTG在體系中的濃度為ImM。
5.根據權利要求1所述的PCV2病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，步驟2)的誘導表達溫度為30°C。
6.根據權利要求1所述的PCV2病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，步驟3)按照I升大腸桿菌培養物用10mL裂解及組裝緩沖液的比例重懸，冰上靜置至少5分鐘；然后將重懸液樣品在冰上進行超聲裂解至少10分鐘；將超聲裂解所獲得的裂解樣品進行離心，大于12000轉/分鐘，4°C離心10-30分鐘收集上清。
7.根據權利要求1所述的PCV2病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，將離心所獲得的上清液與N1-NTA His.Bind樹脂結合，上清和樹脂填料的體積比為20:1 ;4°C輕微震蕩結合至少60分鐘；以10倍柱體積洗滌液漂洗；最后用洗脫液洗脫目的蛋白。
8.根據權利要求1所述的PCV2病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，將洗脫的目的蛋白放入裂解及組裝緩沖液中進行隔夜透析。
9.一種PCV2病毒樣顆粒，其特征在于，是由權利要求1-8任一項所述的方法制備獲得。
10.一種PCV2病毒樣顆粒所用的裂解及VLP組裝緩沖液，其特征在于，配方為:0.1MNaH2PO4.2Η20、0.1M Na2HPO4,20mM ImidazoleUOmM Tris_base、300mM NaCl、50mM KCU2mM MgCl2、0.1M Ammonium citrate、2%Glycerine、0.5%Triton X_100、5mMβ _Me、0.1mMPMSF、lU/mL Leupeptin Protease inhibitor ;其中 Triton X-100、β _Me、PMSF、LeupeptinProtease inhibitor現用現加，緩沖液pH8.0，余量為純水。
【文檔編號】C12N7/04GK104073473SQ201410145870
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年4月11日 優先權日:2014年4月11日
【發明者】楊毅, 雷昕諾, 王乃東, 鄧治邦, 湛陽, 王愛兵, 薛立群, 張顏 申請人:美國普賽生物高科技有限責任公司, 湖南農業大學