枯草芽孢桿菌x3及其在降低水牛糞便硫化氫生成中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了枯草芽孢桿菌X3及其在降低水牛糞便硫化氫生成中的應用。枯草芽孢桿菌X3(Bacillus?subtilis?X3)，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2013年06月16日，編號為CCTCC?NO:M2013261，保藏地址：中國·武漢·武漢大學。以水牛養殖場內土壤等作為菌株分離來源，對枯草芽孢桿菌X3(Bacillus?subtilis?X3)于37℃下培養24小時后，按20%（W/W）的比例直接接種到裝有水牛糞便的密閉燒杯中，室溫下培養2～8天，使硫化氫降低。與添加等比例無菌水的對照組相比，枯草芽孢桿菌X3能降低水牛糞便中硫化氫生成19.59%～52.74%，具有效率高、營養要求低、操作簡單、安全性高優點。
【專利說明】枯草芽孢桿菌X3及其在降低水牛糞便硫化氫生成中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一株可降低水牛糞便中硫化氫氣體生成的新菌株枯草芽孢桿菌X3 (Bacillus subtilis X3)及其在降低糞便硫化氫生成中的應用。
【背景技術】
[0002]近年來，我國畜禽養殖業發展迅速，規模化養殖比例不斷增加，在滿足日漸提高的畜禽產品需求和改善人民生活水平的同時，也帶來了一系列的生態問題。家畜糞尿在產生、處理、存放和排放過程會產生大量的惡臭物質，這些惡臭物質成分復雜，主要含有氨、硫化物、胺類和揮發性脂肪酸等化學物質。惡臭是指一切刺激嗅覺器官引起人們不愉快和損壞生物環境的物質。惡臭作為7種典型公害之一(大氣污染、水質污染、惡臭、土壤污染、噪聲、振動、土地下沉)，其物質種類繁多，影響范圍大，并且嚴重危害人體健康，它對人體的毒害是多方面的:(1)危害神經系統。長期受到一種或幾種低濃度的惡臭物質刺激，首先使嗅覺脫失，繼而導致大腦皮層興奮與抑制過程的調節功能失調。有的惡臭物質，如硫化氫不僅有異臭作用，同時也對神經系統產生毒作用；(2)危害呼吸系統。當人們嗅到臭氣時，會反射性地抑制吸氣，妨礙正常呼吸功能；(3)危害循環系統。如氨等刺激性臭氣，會使血壓出現先下降后上升，脈搏先減慢后加快的變化。硫化氫還能阻礙氧的輸送，而造成體內缺氧；(4)危害消化系統。經常接觸惡臭物質，使人食欲不振與惡心，進而發展成為消化功能減退；(5)惡臭會使內分泌系統的分泌功能紊亂，而影響機體的代謝活動。此外氨和醛類對眼睛有刺激作用，常引起流淚、疼痛、結膜炎、角膜浮腫；(6)臭味還會阻礙人際關系的良好發展，影響個人、家庭或某一場所的外在形象。長期受到惡臭的持續作用會使人煩躁、憂郁、失眠、注意力不集中、記憶減退，從而使學習和工作效率降低。由于臭味對人體感觀和健康的影響，引起世界各國的普遍重視，有關除臭技術的研究已成為環境治理工程中的一個重要的環節。
[0003]目前，對于臭味的去除方法主要有:(I)化學除臭法(氧化法，吸收法，吸附法)包括燃燒法(熱力燃燒，催化燃燒)；(2)物理除臭法，如掩避法，稀釋擴散法等；(3)生物除臭法，主要是利用微生物除臭，通過微生物的生理代謝將具有臭味的物質加以轉化。對于大流量、低濃度的揮發性有機廢氣和惡臭氣體，使用物理和化學法處理存在投資大、操作復雜、運行成本高的問題。早在1957年，美國就報道了利用土壤脫臭法處理硫化氫的專利。生物除臭方法因其具有適用范圍廣、處理效率高、無二次污染、所需設備簡單、便于操作、運行成本低、環境負荷低和維護管理簡單方便的特點，可廣泛應用于污水處理廠、垃圾處理場、公園中的湖泊和水溝、畜牧養殖場等不同場所。在20世紀80年代末90年代初，生物除臭技術得到迅速發展，并逐漸發展成除臭技術的主流。它是一種利用微生物分解惡臭物質使其無臭化、無害化的處理方法，因此也叫微生物除臭法。生物除臭法按處理方式分有生物過濾法、生物洗滌法、生物滴濾法等；按填充材料分有土壤除臭法、珍珠巖棉除臭法、堆肥除臭法、活性污泥除臭法、泥炭土除臭法和鋸末除臭法等。由于來自畜禽養殖或糞尿處理場的臭氣中最主要成分是氨氣和硫化氫，生物除臭法也正是源于此目的而發展起來的，所以這些方法對于消除氨氣和硫化氫的臭味最為有效。目前各國對牛糞等的處理方法不外乎采用厭氧消化，即沼氣發酵。而目前真正用微生物直接除去牛糞中，尤其是水牛糞便中所產生的臭氣味的研究報道尚少。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一株可降低水牛糞便中硫化氫氣體生成的新菌株枯草芽孢桿菌X3 (Bacillus subtilis X3)及其在微生物降解硫化氫的應用。
[0005]本發明解決上述技術問題的技術方案是:
[0006]1.枯草芽孢桿菌X3 (Bacillus subtilis X3),保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2013年06月16日，編號為CCTCC N0:M2013261，保藏地址:中國?武漢?武漢大學。
[0007]本發明所提供的硫化氫降解菌分離自廣西壯族自治區水牛研究所的水牛養殖場附近草地土壤，命名枯草芽孢桿菌X3 (Bacillus subtilis X3)，經形態特征及16SrRNA序列初步鑒定為_，目前尚無利用_降低水牛糞便中的硫化氫生成的報道。
[0008]菌株的形態:桿狀，在固體培養基37°C培養24小時后菌落成乳白色,圓形,邊緣光滑，濕潤，菌落中間較厚，向四周逐漸變薄。
[0009]本菌株的獲得:從廣西壯族自治區水牛研究所的水牛養殖場附近草地土壤中取樣，通過初步，復篩，獲得具有降低水牛糞便硫化氫生成的純培養物，對該培養物進行形態和16SrRNA鑒定，將其鑒定為 枯草芽孢桿菌X3 (Bacillus subtilis X3)。
[0010]本菌株的分離、篩選:將土壤樣品以10% (W/W)的比例接種于裝有新鮮水牛糞便的燒杯中，每種三個重復，用玻棒攪拌均勻，密閉，室溫下連續培養7天，每隔24h用感官法判定除臭效果。如有明顯除臭效果的處理，立即取樣稀釋進行微生物分離純化實驗，即采用多次平板劃線法從具有明顯除臭效果的樣品中分離單個菌株，所用培養基為牛肉膏蛋白胨培養基。
[0011]菌株的形態:桿狀，在固體培養基37°C培養24小時后菌落成乳白色,圓形，邊緣光滑，濕潤，菌落中間較厚，向四周逐漸變薄。
[0012]菌株的16SrRNA序列測定:采用機械破壁法將X3菌株的DNA提取出來，經純化后，選用引物 8f(5’ -CACGGATCCAGAGTTTGAT (C/T) (A/C) TGGCTCAG-3’)/1510r (5，-GTGAAGCTTACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3，)擴增細菌的16SrRNA序列并送檢測序，利用Blast將所測得的序列與GenBank數據庫中的16SrRNA基因序列進行同源性比較分析，其同源性與GenBank數據庫中許多枯草芽孢桿菌的同源性在99%以上，所以將菌株X3命名為枯草芽孢桿菌 X3 (Bacillus subtilis X3),其 16SrRNA 序列如下(5，一 3’):
[0013]I tctgtccacc ttcggcggct ggctcctaaa aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa
[0014]61 actctcgtgg tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc
[0015]121 tgatccgcga ttactagcga ttccagcttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa
[0016]181 ctgagaacag atttgtggga ttggcttaac ctcgcggttt cgctgccctt tgttctgtcc
[0017]241 attgtagcac gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc
[0018]301 ttcctccggt ttgtcaccgg cagtcacctt agagtgccca actgaatgct ggcaactaag[0019]361 atcaagggtt gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca
[0020]421 accatgcacc acctgtcact ctgcccccga aggggacgtc ctatctctag gattgtcaga
[0021]481 ggatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg
[0022]541 cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg
[0023]601 gagtgcttaa tgcgttagct gcagcactaa ggggcggaaa ccccctaaca cttagcactc
[0024]661 atcgtttacg gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt cgctccccac gctttcgctc
[0025]721 ctcagcgtca gttacagacc agagagtcgc cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta
[0026]781 cgcatttcac cgctacacgt ggaattccac tctcctcttc tgcactcaag ttccccagtt
[0027]841 tccaatgacc ctccccggtt gagccggggg ctttcacatc agacttaaga aaccgcctgc
[0028]901 gagcccttta cgcccaataa ttccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc
[0029]961 tggcacgtag ttagccgtgg ctttctggtt aggtaccgtc aaggtaccgc cctattcgaa
[0030]1021 cggtacttgt tcttccctaa caacagagct ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc
[0031]1081 ggcgttgctc cgtcagactt tcgtccattg cggaagattc cctactgctg cctcccgtag
[0032]1141 gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat
[0033]1201 cgtcgccttg gtgagccgtt acctcaccaa ctagctaatg cgccgcgggt ccatctgtaa
[0034]1261 gtggtagccg aagccacctt ttatgtttga accatgcggt tcaaacaacc atccggtatt
[0035]1321 agccccggtt tcccggagtt atcccagtct tacaggcagg ttacccacgt gttactcacc
[0036]1381 cgtccgccgc taacatcagg gagcaagctc ccatctgtcc gctcgacttg catgtattag
[0037]1441 gcacgcc
[0038]菌株的培養:取配制好的枯草芽孢桿菌X3 (Bacillus subtilis X3)菌懸液2ml接種于牛肉膏蛋白胨培養基中，在37°C培養箱中培養24小時。
[0039]菌株的保藏:與已滅菌40%甘油混勻后，于_20°C冰箱中保存。
[0040]本發明所述的枯草芽孢桿菌X3 (Bacillus subtilis X3)在微生物降低硫化氫中的應用。
[0041]將50g牛糞加入1000ml塑料大燒杯中，按20%接種量接種菌株枯草芽孢桿菌X3培養液，以等量無菌水作為對照；在一個大燒杯放入盛有20ml鋅銨絡鹽溶液的小燒杯，用以吸收硫化氫(測定方法見附錄I)。大燒杯用兩層塑料膜和一層保鮮膜密封，做兩個重復，室溫下培養；每隔2天，取小燒杯檢測硫化氫的釋放量，連續8天。實驗證明，枯草芽孢桿菌 X3(Bacillus subtilis X3)(編號為 CCTCC N0:M2013261)能夠有效地降低 19.59% ~52.74%水牛糞便中的硫化氫氣體生成。
[0042]與現有技術相比，本發明的有益效果主要體現在:針對水牛糞便特點，本菌株具有高效降低硫化氫氣體生成的特點，且操作簡便，應用前景廣闊。
【具體實施方式】
[0043]下面結合實施例對本發明 作進一步描述，但本發明的保護范圍并不限于此。
[0044]實施例1
[0045]枯草芽孢桿菌X3 (Bacillus subtilis X3，編號為 CCTCC N0:M2013261)的分離。
[0046]枯草芽孢桿菌X3 (Bacillus subtilis X3 編號為 CCTCC N0:M2013261)的分離包括樣品初篩和菌株分離兩部分:[0047]1.含高效除臭微生物的樣品來源初篩:
[0048](I)分別稱量牛場外下水道淤泥、魚塘水、牛場內下水道淤泥、魚塘邊淤泥、草地干牛糞10g，放入離心管(注意:應留出一小截空間不裝滿，避免冷凍后體積增大脹出)，-200C保存，每種樣品存放3管。
[0049](2)稱量20g新鮮牛糞加入培養皿。
[0050](3)稱量牛場外下水道淤泥、魚塘水、牛場內下水道淤泥、魚塘邊淤泥、草地干牛糞、無菌水按10%(w/w)接種入裝有新鮮牛糞的培養皿，每種三個重復。玻棒攪拌均勻。
[0051](4)蓋好培養皿，室溫下培養。
[0052](5)計時觀察，每隔24h用感官法判定除臭效果(感官法判定除臭效果標準見表
I),連續7天。
[0053](6)如有明顯除臭效果的培養基，標記。并立即取樣稀釋進行微生物分離純化實驗。
[0054]表1感官法判定除臭效果標準
【權利要求】
1.枯草芽孢桿菌X3(Bacillus subtilis X3),保藏于中國典型培養物保藏中心,保藏日期為2013年06月16日，編號為CCTCC N0:M2013261，保藏地址:中國.武漢.武漢大學。
2.如權利要求1所述的枯草芽孢桿菌X3(Bacillus subtilis X3)_,其特征在于,所述的枯草芽孢桿菌X3 (Bacillus subtilis X3)特征為:桿狀，在固體培養基37°C培養24小時后菌落成乳白色，圓形，邊緣光滑，濕潤，菌落中間較厚，向四周逐漸變薄。
3.如權利要求1所述的枯草芽孢桿菌X3(Bacillus subtilis X3)，其特征在于枯草芽抱桿菌 X3 (Bacillus subtilis X3)的 16SrRNA 序列如下(5，—3，):1 tctgtccacc ttcggcggct ggctcctaaa aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa
61 actctcgtgg tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc
121 tgatccgcga ttactagcga ttccagcttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa
181 ctgagaacag atttgtggga ttggcttaac ctcgcggttt cgctgccctt tgttctgtcc
241 attgtagcac gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc
301 ttcctccggt ttgtcaccgg cagtcacctt agagtgccca actgaatgct ggcaactaag
361 atcaagggtt gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca
421 accatgcacc acctgtcact ctgcccccga aggggacgtc ctatctctag gattgtcaga
481 ggatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg
541 cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg
601 gagtgcttaa tgcgttagct gcagcactaa ggggcggaaa ccccctaaca cttagcactc
661 atcgtttacg gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt cgctccccac gctttcgctc
721 ctcagcgtca gttacagacc agagagtcgc cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta
781 cgcatttcac cgctacacgt ggaattccac tctcctcttc tgcactcaag ttccccagtt
841 tccaatgacc ctccccggtt gagccggggg ctttcacatc agacttaaga aaccgcctgc
901 gagcccttta cgcccaataa ttccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc
961 tggcacgtag ttagccgtgg ctttctggtt aggtaccgtc aaggtaccgc cctattcgaa
1021 cggtacttgt tct tccctaa caacagagct ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc
1081 ggcgttgctc cgtcagactt tcgtccattg cggaagattc cctactgctg cctcccgtag
1141 gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat
1201 cgtcgccttg gtgagccgtt acctcaccaa ctagctaatg cgccgcgggt ccatctgtaa
1261 gtggtagccg aagccacctt ttatgtttga accatgcggt tcaaacaacc atccggtatt
1321 agccccggtt tcccggagtt atcccagtct tacaggcagg ttacccacgt gttactcacc
1381 cgtccgccgc taacatcagg gagcaagctc ccatctgtcc gctcgacttg catgtattag
1441 gcacgcc 。
4.如權利要求1所述的枯草芽孢桿菌X3(Bacillus subtilis X3)在微生物降解糞便中硫化氫的應用。
5.如權利要求1所述的枯草芽孢桿菌X3(Bacillus subtilis X3)在降低水牛糞便硫化氫生成中的應用，其特征在于:對枯草芽孢桿菌X3 (Bacillus subtilis X3)進行擴大培養，然后接種于糞便中，使糞便中的硫化氫降低。
【文檔編號】C12R1/125GK103484402SQ201310403129
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月6日 優先權日:2013年9月6日
【發明者】楊承劍, 李婉, 梁辛, 梁賢威, 韋升菊, 李舒露, 楊炳壯, 鄒彩霞, 李麗莉 申請人:廣西壯族自治區水牛研究所