一株脈孢菌ny-2菌株及其應用的制作方法
【專利摘要】本項發明微生物農藥，具體講是一株四孢脈孢菌NY-2菌株及其應用。四孢脈孢菌NY-2（Neurospora?tetrasperma，中文名稱四孢脈孢菌）保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期：2013年7月16日，保藏號：CCTCC?M2013346。所述脈孢菌的發酵產物用于生物農藥殺蟲劑的制備。本項發明涉及菌株分離自山東安丘采集的牛蒡，通過PCR擴增18S-28SrDNA的ITS區段，測序結果與Genebank數據庫中已知菌株相應序列進行比對，與菌株Neurospora?tetrasperma（Accession?number:FJ176470.1）的相似度為100%。該菌株發酵產物可用于制備生物農藥殺蟲劑，具有生產工藝簡單、來源充足、周期短、成本低、綠色環保等特點，開發前景較好。
【專利說明】一株脈孢菌NY-2菌株及其應用
【技術領域】
[0001]本項發明微生物農藥，具體講是一株四孢脈孢菌NY-2菌株及其應用。
【背景技術】
[0002]現代農業發展與人類健康、生態環境保護和農業可持續發展緊密聯系，而高效生物農藥的研究則成為新型農藥研究的熱點。通過高效微生物菌株的發酵產生具有生物活性的代謝產物，并將其用于病蟲草害的控制是目前創制新型生物農藥的重要途徑，具有研發空間廣、毒性低、特異性強、高效低殘留、不易產生抗藥性、環境相容性好、生產工藝簡單等優點。
[0003]脈孢菌(Neurospora)是一類多細胞絲狀真菌,也是一類重要的真核模式生物。它的遺傳規律奇特，代謝途徑多樣，活性機制獨特，不僅是遺傳學、分子生物學的重要研究對象，也日漸成為生產中的工程菌。同時該菌宿主廣泛，生長所需營養要求簡單，生長周期短，次級代謝產物化學多樣性較豐富，開發利用該菌株制備新型生物農藥具有高效、無公害的優勢。
【發明內容】
[0004]本項發明目的在于提供一株四孢脈孢菌NY-2菌株及其應用。
[0005]為充分達到以上目的，本發明采用的技術方案為:一株脈孢菌NY-2菌株，四孢脈孢菌NY-2 (Neurospora tetrasperma)保藏于中國典型培養物保藏中心,保藏日期:2013年7月16日，保藏號:CCTCC M2013346。將所述脈孢菌于發酵培養基中靜置或搖床發酵培養15-30天，發酵產物待用。所述發酵培養基比例為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，酵母浸膏3g，蛋白胨5g，蒸餾水1000mL。所述脈孢菌經發酵培養基的培養的產物用于制備生物農藥殺蟲劑。
[0006]將所述脈孢菌于發酵培養基中靜置或搖床發酵培養15-30天，發酵產物待用。將發酵產物用有機溶劑提取，提取物經柱色譜分離后，其產物用于制備生物農藥殺蟲劑。所述有機溶劑為:石油醚、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇、乙醇或水中的一種或幾種。所述發酵產物進行柱層析分離，以石油醚:乙酸乙酯體系梯度洗脫。收集石油醚:乙酸乙酯體積比10:1和5:1的組分I和II可用于制備生物農藥殺蟲劑。所述層析柱可以采用硅膠柱、反相柱、凝膠柱或大孔樹脂中的一種或幾種。所述石油醚:乙酸乙酯體系洗脫梯度為100:1至1:1。
[0007]本發明所具有的優點:
[0008]本發明所述的脈孢菌NY-2菌株分離自山東安丘采集的牛蒡，通過PCR擴增18S-28SrDNA的ITS區段，測序結果與Genebank數據庫中已知菌株相應序列進行比對，與菌株 Neurospora tetrasperma (Accession number:FJ176470.1)的相似度為 100%。該菌株發酵產物可用于制備生物農藥殺蟲劑，具有生產工藝簡單、來源充足、周期短、成本低、綠色環保等特點，開發前景較好。【具體實施方式】
[0009]為闡明對本項發明特征的理解，下面結合一些非限定性的實施實例對本發明做進一步闡述。本項發明所述的四孢脈孢菌NY_2(Neurospora tetrasperma),保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期:2013年7月16日，保藏號:CCTCC M2013346，保藏單位地址:武漢市武昌珞珈山。
[0010]實施例1:鹽堿植物來源脈孢菌(Neurospora tetrasperma) NY-2菌株分類。
[0011]I)菌種培養
[0012]按照微生物學實驗室常規培養方法，挑取少量保存于葡萄糖-瓊脂培養基的脈孢菌(Neurospora tetrasperma)NY-2,接種于PDA平板表面，25°C培養7天,初期菌落呈稀疏的網狀，后期形成橙色分生孢子。
[0013]2)菌種初步鑒定
[0014]按照文獻方法(東北農業大學學報，2007，38，(I): 101-106)，通過PCR擴增18S-28SrDNA的ITS區段，測序結果與Genebank數據庫中已知菌株相應序列進行比對，與菌株 Neurospora tetrasperma (Accession number:FJ176470.1)的相似度為 100%。序列信息如下:
[0015]GTCACCTTAGAAATGGGGGGTTTTACGGCAAGAACCCGCCGCACGACCATAGCGATGTAGAGTTACTACGCTCGGTGTGACTAGCGAGCCCGCCACTGATTTTGAGGGACCGCGGGCAGCCGCGGATCCCCAACGCAAGCAGAGCTTGATGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCTCGCCAGAATACTGGCGAGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGACTTATTTAAAAGTTTACTCAGAGAGACATAAAATATCAAGAGTTTAGTTTCGGCACTCCGGCGGGCAGCCTCCCGCGAGCGGGAGACCCGAGGATCCGGGAGGACCCGAGGGCCTTTCCGGACCGCCAGCGCCGAGGCAACCGTACGGGTAAGATTCGCGATGGTTTGTGGGAGTTTTGCAACTCTGTAATGATCCCTCCGCA。
[0016]實施例2:脈抱菌(Neurospora tetrasperma) NY-2菌株的發酵培養。
[0017]I)發酵培養
[0018]菌種培養:按照微生物學實驗室常規培養方法，挑取少量保存于葡萄糖-瓊脂培養基的脈抱菌(Neurosporatetrasperma) NY-2,接種于PDA平板表面，25°C培養7天,作為規模發酵培養的菌種，待用。
[0019]切取種子板上的脈孢菌(Neurospora tetrasperma) NY-2菌種適量,投入已滅菌、盛有液體培養基的IOOOmL錐形瓶中，室溫靜置培養22天，隨即以乙酸乙酯滅菌，待用。
[0020]所述液體培養基為馬鈴薯40g/瓶，葡萄糖4g/瓶，酵母浸膏0.6g/瓶，蛋白胨Ig/瓶，蒸餾水200mL/瓶。
[0021]2)發酵產物分離與純化
[0022]將上述脈孢菌液體培養基的發酵產物以乙酸乙酯提取3次，合并提取液，減壓蒸餾除去溶劑，得到浸膏。將所述發酵產物的浸提取物膏進行柱層析分離，以石油醚:乙酸乙酯體系梯度洗脫。收集石油醚:乙酸乙酯體積比10:1和5:1的組分I和II可用于制備生物農藥殺蟲劑。
[0023]實施例3:殺蟲活性試驗。
[0024]鹵蟲(brine shrimp)又名鹽水豐年蟲，分類學上屬節肢動物門、甲殼綱、無甲目、鹽水豐年蟲科、鹵蟲屬。在目前評價毒物毒性的生物，如單細胞藻類、輪蟲、水蚤中，鹵蟲有許多明顯的優勢:1適應能力強，分布廣；2保藏方便，孵出無節幼體方便(水產養殖，2008，4:38-40)。目前鹵蟲已廣泛作為毒物急性毒性評價的一種指示生物。肖永堂等(廈門大學學報，2005, 44 (6): 847-850 )采集自浙江和福建省紅樹林的共188株海洋真菌代謝產物的鹵蟲(brine shrimp)活性進行初步研究；胡志IE等(海洋通報，2000，19(4):36-40.)對從海域潮間帶分離的1240株放線菌進行殺鹵蟲活性菌株的篩選，快速篩選出了具有抗齒蟲活性的菌株；劉永等(生態毒理學報，2011, 6 (5): 557-560)把鹵蟲作為模式生物，測定了 7種除蟲菊酯對非靶性生物的安全性和生態毒理評價。因此鹵蟲作為毒物急性毒性的實驗方法簡單、操作方便、快捷、可行性強。(PlantMedica, 1991，45:31-34 ;農藥，2011，50(4):261-262, 275)。
[0025]I)鹵蟲的孵化
[0026]實驗前48h將200mg鹵蟲卵置于500ml陳化海水中通氣孵化，溫度維持在260C -28°C,自然光照射。整個實驗過程不對鹵蟲進行飼喂。24h后除去卵殼和未孵化的卵，繼續孵化24h，待用。
[0027]2)待測樣品制備
[0028]將上述實施例分離純化的脈孢菌發酵產物組分I和II分別加入少量DMSO溶解，配制成 12、10、9、8、7.5、7、5、4、3、2、1、0.5mg/ml 的濃度梯度，待用。
[0029]3)實驗方法
[0030]參照Solis 方法(Bioorg.Med.Chem.Lett.2010, 20:5677-5680)，取鹵蟲幼蟲懸浮液200yL，加入到96孔板中，每孔含有鹵蟲14-16條。空白對照組和各濃度梯度組分別設三個平行。空白組包括海水對 照和助溶劑對照。24°C恒溫培養24h后，在雙目解剖鏡下統計鹵蟲死亡個數。
[0031]鹵蟲致死活性以校正死亡率表示，公式表示如下:
[0032]校正死亡率(％)=(處理死亡率-對照死亡率)/ ( 100-對照死亡率)X 100，并計算出半致死率LD5tlt5
[0033]實驗結果顯示組分I和II的LD5tl分別為0.145mg/ml0.067mg/ml，具有較好的殺蟲活性。
[0034]上述實驗結果證明本發明所涉及的四孢脈孢菌的發酵產物具有較好的殺蟲活性，可以用于生物農藥殺蟲劑的制備。
【權利要求】
1.一株脈孢菌菌株，其特征在于:其為四孢脈孢菌(Neurospora tetrasperma)保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號=CCTCC M2013346。
2.如權利要求1所述的脈孢菌菌株的發酵產物，其特征在于:將所述脈孢菌在發酵培養基中靜置或搖床發酵培養15-30天。
3.如權利要求2所述的脈孢菌菌株的發酵產物，其特征在于培養基包括:馬鈴薯200g，葡萄糖20g,酵母浸膏3g,蛋白胨5g,和蒸懼水1000g。
4.一種權利要求1所述的脈孢菌作為生物農藥殺蟲劑中的應用。
5.如權利要求4所述的脈孢菌作為生物農藥殺蟲劑中的應用，其特征在于:所述脈孢菌置于發酵培養基中靜置或搖床發酵培養15-30天，得到發酵產物。
6.如權利要求5所述的脈孢菌作為生物農藥殺蟲劑中的應用，其特征在于:將發酵產物用有機溶劑提取，提取物經柱色譜分離后，其產物用于制備生物農藥殺蟲劑。
7.如權利要求6所述的脈孢菌作為生物農藥殺蟲劑中的應用，其特征在于:所述溶劑為:石油醚、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇、乙醇或水中的一種或幾種。
8.如權利 要求6所述的脈孢菌作為生物農藥殺蟲劑中的應用，其特征在于:所述發酵產物進行柱層析分離，以石油醚:乙酸乙酯體系梯度洗脫。收集石油醚:乙酸乙酯體積比10:1和5:1的組分I和II用于制備生物農藥殺蟲劑。
9.如權利要求8所述的脈孢菌作為生物農藥殺蟲劑中的應用，其特征在于:所述層析柱為硅膠、反相、凝膠或大孔樹脂中的一種或幾種。
10.如權利要求8所述的脈孢菌作為生物農藥殺蟲劑中的應用，其特征在于:所述石油醚:乙酸乙酯體系洗脫梯度為100:1至1:1。
【文檔編號】C12N1/14GK103468590SQ201310433380
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月22日 優先權日:2013年9月22日
【發明者】李昉 申請人:青島科技大學