一種利用激流式生物反應器制備豬流行性腹瀉病毒的方法
【專利摘要】本發明提供了一種利用激流式生物反應器培養豬流行性腹瀉病毒的方法，該方法充分發揮了激流式生物反應器的工藝優點，優選了適宜豬流行性腹瀉病毒在宿主細胞內增殖的環境條件，填補了利用激流式生物反應器培養豬流行性腹瀉病毒的技術空白。與現有技術相比，本發明的細胞培養過程逐日增大空氣流量，加快系統內氣體循環，有利于培養液內CO2的溢出，有利于細胞生長，進而利于病毒的增殖；同時本發明病毒的接種過程無需吸附，簡化操作，節省人力；此外本發明使用的濃縮營養液，可以倍增多種氨基酸含量，為病毒繁殖提供了充足的營養，有利于提高病毒產量。
【專利說明】一種利用激流式生物反應器制備豬流行性腹瀉病毒的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及病毒培養【技術領域】，具體涉及一種利用激流式生物反應器制備豬流行性腹瀉病毒的方法。
【背景技術】
[0002]病毒的培養增殖技術是生物【技術領域】的重要技術節點，廣泛應用于基因工程、疫苗工程等領域，具有重要的作用。現有技術中，豬流行性腹瀉病毒的培養主要通過搖瓶培養細胞、再接種病毒來實現，該方法細胞及病毒培養條件難以控制，導致病毒的產量、毒力不穩定，產品批間差異大，而且自動化程度低，勞動強度大，極大的限制了病毒的質量與產量。
[0003]采用規模化的生物反應器培養病毒可以克服以上缺陷，激流式生物反應器是一種很好的選擇，其培養量大、培養條件控制精確、可以實現連續式培養或流加培養。現有技術盡管已經有利用激流式生物反應器培養病毒的報道，但是利用激流式生物反應器培養針對豬流行性腹瀉病毒的相關技術尚未有報道。
[0004]中國專利CN201210545873.1公開了運用激流式生物反應器培養豬細小病毒的方法，但是由于不同病毒、不同宿主細胞的生長特點各有差異，因此在利用激流式生物反應器對不同種病毒進行培養的時候所選用的工藝條件會有所不同，因此該專利公布的技術方案僅限于豬細小病毒的培養，其對于利用激流式生物反應器培養其他病毒的方法并沒有借鑒意義。
[0005]科技文獻《激流-灌注式生物反應器大規模培養Vero細胞的工藝研究》(《工藝工程與設備》2011年6月第6輯)報道了一種利用激流式生物反應器培養VeiO細胞的方法，但是該方法的目的在于細胞量的積累，由于與培養病毒存在目的的不同，因此技術側重點不同、工藝條件也相應有所不同。
【發明內容】
[0006]為克服現有技術的技術缺陷，本發明提供一種利用激流式生物反應器制備豬流行性腹瀉病毒的方法。
[0007] 為實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案:
[0008]一種利用激流式生物反應器制備豬流行性腹瀉病毒的方法，包括以下步驟:
[0009]1)制備制苗用細胞:將Veix)-E6細胞種子懸液和細胞生長液利用蠕動泵加入到激流式生物反應器的灌注袋中，使細胞貼附在聚酯纖維紙片載體上，接種密度為每克載體接種6.0-6.5 X IO7個細胞，將設備參數設定為以下值，培養罐內液體環境溫度:37-38°C，培養罐加熱膜溫度:43-45°C，灌注袋加熱膜溫度:35-37°C，pH:7.2-7.8，溶氧:35%_65%，振蕩速度45-60r/min，初始空氣流量100ml/min-1000ml/min，每24小時空氣流量增加IOOml/min-1000ml/min,開始培養，當殘糖量低于2g/L時,流加補充細胞生長液,維持培養液殘糖量l_2g/L，培養一段時間得到制苗用細胞培養液；
[0010]2)病毒接種與培養:當步驟I)所述制苗用細胞培養液單日耗糖量較前一日差值小于5%時，排空反應器內液體，將豬流行性腹瀉病毒種毒與細胞維持液按照1:100-3:100 (v/v)的比例混合后通過蠕動泵泵入其中，將設備參數設定為以下值，培養罐內液體環境溫度:35-38°C，培養罐加熱膜溫度:37-40°C，灌注袋加熱膜溫度:34_38°C，pH:
7.2-7.8，溶氧:35%-65%，振蕩速度 45 ~60r/min，空氣流量 400ml/min-4000ml/min，開始培養，培養24h時后開始分別持續流加補充含2-4倍濃縮的DMEM培養基和200g/L葡萄糖溶液，維持培養液殘糖量l_2g/L,培養40-42h后,得到病毒培養液；
[0011]3)病毒液收獲:收獲激流式生物反應器培養罐與灌注袋內的病毒培養液，將灌注袋反復凍融2-3次后收獲上清液，混合后-20°C保存備用，即得到豬流行性腹瀉病毒。
[0012]上述技術方案中，所述細胞生長液是指含有94%(v/v)高糖DMEM培養基、6%(v/V)新生牛血清，pH為7.2的混合液；所述細胞維持液是指含有94%(v/v)高糖DMEM培養基、6%(v/v)新生牛血清，pH為7.3的混合液；步驟I)所述接種密度優選為每克載體接種
6.2X IO7個細胞；步驟I)所述培養罐內液體環境溫度優選為37.5°C;步驟I)所述的pH優選為7.3 ;步驟I)所述的溶氧優選為40-49% ;步驟I)所述震蕩速度優選為50r/min ;此外，該方法尤其適用于豬流行性腹瀉病毒疫苗的制備。
[0013]上述技術方案中，Veix)-E6細胞自市面購得；激流式生物反應器選自安普公司制造的AP20C型激流灌注式生物反應器或者AP200型激流灌注式生物反應器；所用到的試劑、材料自市面購得。
[0014]本發明提供的技術方案填補了利用激流式生物反應器培養豬流行性腹瀉病毒的技術空白。與現有技術相比，本發明的有益效果還包括:細胞培養過程中逐日增大空氣流量，加快系統內氣體循環，有利于培養液內CO2的溢出，有利于細胞生長，同時本發明中病毒的接種過程無需吸附，簡化操作，節省人力，此外本發明使用的濃縮營養液，可以倍增多種氨基酸含量，為病毒繁殖提供了充足的營養，有利于提高病毒產量。
【具體實施方式】
[0015]實施例1
[0016]選擇Veix)-E6細胞為制苗細胞系；選擇CV777作為種毒。上述細胞和種毒均自市
面夠得。
[0017]本實施例選用AP20C型激流灌注式生物反應器，灌注袋體積為8L，激流罐體積為13L，灌注袋內含有300g聚酯纖維紙片載體，理論有效培養體積為21L。
[0018]I)制備制苗用細胞:將Veix)-E6細胞種子懸液和細胞生長液利用蠕動泵加入到激流式生物反應器的灌注袋中，使細胞貼附在聚酯纖維紙片載體上，接種密度為每克載體接種6.0X IO7個細胞，將設備參數設定為以下值，培養罐內液體環境溫度:37.50C，培養罐加熱膜溫度:44°C，灌注袋加熱膜溫度:36.5°C，pH:7.3，溶氧:45%，振蕩速度45r/min，初始空氣流量100ml/min，每24小時空氣流量增加100ml/min，開始培養，每日取樣2次測殘糖量，計算單日耗糖量，細胞培養48h發現培養液殘糖量低于2g/L，開始流加補充細胞生長液，流加速度為llml/min、從而保證培養液殘糖量維持在1.2-1.8g/L，繼續培養得到制苗用細胞培養液；
[0019]2)病毒接種與培養:培養持續96小時時，發現所述制苗用細胞培養液單日耗糖量較前一日差值小于5%，排空反應器內液體，將含14L細胞維持液和0.42L種毒的種毒混合液通過蠕動泵泵入其中，將設備參數設定為以下值，培養罐內液體環境溫度:37°C，培養罐加熱膜溫度:39 °C，灌注袋加熱膜溫度:36°C，pH:7.5，溶氧:50%，振蕩速度45r/min，空氣流量400ml/min，開始培養，培養24h時后開始以3.14mL/min的速度持續流加補充含3倍濃縮DMEM培養基、以0.lmL/L的速度持續流加200g/L葡萄糖溶液，從而保證培養液殘糖量維持在1.2-1.88/1，培養4111后，得到病毒培養液；
[0020]3)病毒液收獲:收獲培養罐與灌注袋內的病毒培養液，將灌注袋反復凍融3次后收獲上清液，混合后共得20.9L病毒液，置于_20°C保存備用，即得到豬流行性腹瀉病毒。
[0021]用3%的甲醛溶液對以上制備的病毒液進行滅活，以其作為水相，再以疫苗佐劑作為油相，混合后利用均質機對其進行乳化，即得到豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗
[0022]實施例2
[0023]選擇Veix)-E6細胞為制苗細胞系；選擇CV777作為種毒。上述細胞和種毒均自市
面夠得。
[0024]本實施例選用AP200型激流灌注式生物反應器，灌注袋體積為80L，激流罐體積為130L，灌注袋內含有3000g聚酯纖維紙片載體，理論有效培養體積為210L。
[0025]I)制備制苗用細胞:將Vero-E6細胞種子懸液和細胞生長液利用蠕動泵加入到激流式生物反應器的灌注袋中，使細胞貼附在聚酯纖維紙片載體上，接種密度為每克載體接種6.1XlO7個細胞，將設備參數設定為以下值，培養罐內液體環境溫度:37.5°C，培養罐加熱膜溫度:43°C，灌注袋加熱膜溫度:36.5°C, pH:7.3，溶氧:55%，振蕩速度43r/min，初始空氣流量1000ml/min，每24小時空氣流量增加1000ml/min，開始培養，每日取樣2次測殘糖量，計算單日耗糖量，細胞培養48h發現培養液殘糖量低于2g/L，開始流加補充細胞生長液，流加速度為105ml/min、 從而保證培養液殘糖量維持在l_2g/L，繼續培養得到制苗用細胞培養液；
[0026]2)病毒接種與培養:培養持續96小時時，發現所述制苗用細胞培養液單日耗糖量較前一日差值小于5%，排空反應器內液體，將將含140L細胞維持液和2.8L種毒的種毒混合液通過蠕動泵泵入其中，將設備參數設定為以下值，培養罐內液體環境溫度:36°C，培養罐加熱膜溫度:38 °C，灌注袋加熱膜溫度:37°C，pH:7.7，溶氧:45%，振蕩速度45r/min，空氣流量4000ml/min，開始培養，培養24h時后開始以32mL/min的速度持續流加補充含3倍濃縮DMEM培養基、以lmL/L的速度持續流加200g/L葡萄糖溶液，從而保證培養液殘糖量維持在l-2g/L，培養40h后，得到病毒培養液；
[0027]3)病毒液收獲:收獲培養罐與灌注袋內的病毒培養液，將灌注袋反復凍融3次后收獲上清液，混合后共得208L病毒液，置于_20°C保存備用，即得到豬流行性腹瀉病毒。
[0028]以上對本發明的實施例進行了詳細說明，但所述內容僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明。凡在本發明的申請范圍內所做的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種利用激流式生物反應器制備豬流行性腹瀉病毒的方法，其特征在于包括以下步驟:1)制備制苗用細胞:將Vero-E6細胞種子懸液和細胞生長液利用蠕動泵加入到激流式生物反應器的灌注袋中，使細胞貼附在聚酯纖維紙片載體上，接種密度為每克載體接種6.0-6.5 X IO7個細胞，將設備參數設定為以下值，培養罐內液體環境溫度:37-38°C，培養罐加熱膜溫度:43-45 °C，灌注袋加熱膜溫度:35-37 °C, pH:7.2-7.8，溶氧:35%_65%，振蕩速度45-60r/min，初始空氣流量100ml/min-1000ml/min，每24小時空氣流量增加IOOml/min-1000ml/min,開始培養,當殘糖量低于2g/L時,流加補充細胞生長液,維持培養液殘糖量l_2g/L，培養一段時間得到制苗用細胞培養液； 2)病毒接種與培養:當步驟I)所述制苗用細胞培養液單日耗糖量較前一日差值小于5%時，排空反應器內液體，將豬流行性腹瀉病毒種毒與細胞維持液按照1:100-3:100 (v/v)的比例混合后通過蠕動泵泵入其中，將設備參數設定為以下值，培養罐內液體環境溫度:35-38°C，培養罐加熱膜溫度:37-40°C，灌注袋加熱膜溫度:34-38°C, pH:7.2-7.8，溶氧:35%-65%，振蕩速度45~60r/min，空氣流量400ml/min-4000ml/min，開始培養，培養24h時后開始分別持續流加補充含2-4倍濃縮的DMEM培養基和200g/L葡萄糖溶液，維持培養液殘糖量l_2g/L,培養40-42h后,得到病毒培養液； 3)病毒液收獲:收獲激流式生物反應器培養罐與灌注袋內的病毒培養液，將灌注袋反復凍融2-3次后收獲上清液，混合后_20°C保存備用，即得到豬流行性腹瀉病毒。
2.根據權利要求1所述的一種利用激流式生物反應器制備豬流行性腹瀉病毒的方法，其特征在于步驟I)所述接種密度為每克載體接種6.2X IO7個細胞。
3.根據權利要求1所述的一種利用激流式生物反應器制備豬流行性腹瀉病毒的方法，其特征在于步驟I)所述培養罐內液體環境溫度為37.5°C。
4.根據權利要求1所述的一種利用激流式生物反應器制備豬流行性腹瀉病毒的方法，其特征在于步驟I)所述的pH為7.3。
5.根據權利要求1所述的一種利用激流式生物反應器制備豬流行性腹瀉病毒的方法，其特征在于步驟I)所述的溶氧為40-49%。
6.根據權利要求1所述的一種利用激流式生物反應器制備豬流行性腹瀉病毒的方法，其特征在于步驟I)所述震蕩速度為50r/min。
7.根據權利要求1所述的一種利用激流式生物反應器制備豬流行性腹瀉病毒的方法，其特征在于尤其適用于豬流行性腹瀉病毒疫苗的制備。
8.根據權利要求1所述的一種利用激流式生物反應器制備豬流行性腹瀉病毒的方法，其特征在于所述細胞生長液是指含有94%(v/v)高糖DMEM培養基、6%(v/v)新生牛血清，pH為7.2的混合液。
9. 根據權利要求1所述的一種利用激流式生物反應器制備豬流行性腹瀉病毒的方法，其特征在于所述細胞維持液是指含有94%(v/v)高糖DMEM培養基、6%(v/v)新生牛血清，pH為7.3的混合液。
【文檔編號】C12N7/02GK103468648SQ201310438027
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月23日 優先權日:2013年9月23日
【發明者】夏廣欣, 吳全忠, 呂茂杰, 何召慶, 楊保收, 梁武, 李守軍 申請人:天津瑞普生物技術股份有限公司