一種利用雙基因聚合效應選育奶山羊產奶性狀的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用雙基因聚合效應選育奶山羊產奶性狀的方法，以奶山羊基因組DNA為模板，利用2對引物分別擴增催乳素受體（PRLR）基因的外顯子9和乳蛋白轉錄因子（ELF5）基因內含子1，以濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳對各擴增產物進行大小判定，采用DNA測序技術篩查2對引物擴增產物的位點突變，然后利用濃度為3.5%的瓊脂糖凝膠電泳對PRLR和ELF5基因的2個位點的SNPs進行基因分型和基因頻率分析，分析不同基因型組合與產奶性狀之間的關系，篩選最佳基因型組合。
【專利說明】一種利用雙基因聚合效應選育奶山羊產奶性狀的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子遺傳育種學領域，具體涉及一種利用雙基因聚合效應選育奶山羊產奶性狀的方法，該方法應用PCR-RFLP和DNA測序技術檢測被檢個體催乳素受體(PRLR)基因外顯子9和乳蛋白轉錄因子(ELF5)基因內含子I的單鏈DNA堿基突變多態性，通過分析不同基因型組合與奶山羊奶羔數之間的關系，篩選出最佳基因型組合，分析含有最佳基因型組合的高產個體的選配方式，再應用這些選配方式選育奶山羊的多基因聚合良種核心群。
【背景技術】
[0002]產奶性狀是奶山羊的主要經濟性狀，包括產奶量、乳脂率和乳蛋白率等。目前，許多學者認為這些數量性狀的表現不僅受微效多基因或QTL控制，而且也與主效基因調控密切相關。因此，尋找這些性狀的主效基因或與之相連鎖的分子標記，研究功能基因的調控機理，是開展奶山羊分子育種工作的前提。以分子標記輔助選擇為核心的多基因聚合育種技術能直接在DNA水平上對產奶性狀的基因型進行選擇，克服了傳統育種方法準確性低的問題，可顯著加快遺傳進展，提高育種效率。因此，將分子標記輔助育種技術與傳統育種技術有效結合，集成創新新的育種技術體系是奶山羊育種發展的必然趨勢。基因聚合(Genepyramiding)是通過基因工程手段，將分散在不同品種或品系中的優良基因通過雜交、回交、復合雜交等手段聚合到同一個品種中。畜禽的大部分經濟性狀具有加性效應，基因表達呈累加作用，即集中到一個品種中的同效基因越多表達越充分。目前，國內外關于羊分子育種的研究主要集中在羊的分子標記檢測及其與性狀的相關性方面，對于基因聚合育種技術大多數仍然僅停留于概念上，對其理論的研究相對滯后。
[0003]單核苷酸多態性(Single nucleotide polynorphisms, SNPs)是指在染色體基因組水平上單個核苷酸的變異導致的DNA序列的多態性，其中最少一種等位基因在群體中出現的頻率不小于1%。SNP是 繼RFLP、SSR后的第三代分子標記。研究發現，在人類基因組中，CG序列是最易發生突變的位點，SNP在CG序列中出現的頻率最多，約占總SNP的25%，而且多是C突變為T。根據基因組中SNPs所處的位置不同，可以將SNP位點分成幾類，即存在于基因啟動子、內含子和外顯子中的SNP位點叫做gene-based SNPs ;對基因的功能沒有影響的SNP位點叫做anonymous SNPs0其中，存在于編碼蛋白質序列中的SNP位點稱為codingSNPs (cSNPs),在cSNPs中，如果氨基酸序列發生了改變，則稱為non-synonymous SNPs ;反之，貝1J這樣的單核苷酸多態性稱為synonymous SNPs0目前對SNP進行檢測與分析的常用技術主要為 PCR-RFLP、變形梯度凝膠電泳(Denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)、單鏈構象多態性(Single-strand conformation polymorphism, SSCP)、變性的高效液相色譜(Denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)等。
[0004]隨著人類基因組測序工作的完成，研究者們已將焦點轉為SNP的篩選及檢測方面，與遺傳表型相關的DNA序列變異成為遺傳學研究的主題之一。人類和動物中基因序列的變異大多數是單核苷酸的突變，而且不同的人群和動物種群其SNP的頻率分布存在差異，這些差異反映出人或動物種群間的遺傳差異。研究發現，SNP在人類基因組中是普遍存在的，而且平均每500-1000個堿基對中就出現一個SNP，估計有300多萬個單核苷酸多態位點存在于人類的整個基因組中，其中的單核苷酸位點約有三分之二位于不編碼基因的DNA序列，它們對個體的表現型意義不大，但對于群體而言，這些SNPs在群體遺傳和生物進化的研究中作為遺傳標記使用意義重大。剩余的三分之一則位于基因內，而且，單核苷酸多態性的分布在同一條染色體上不是均勻存在的。因此，對SNPs的研究有助于解釋個體間的表型差異，利用一系列相關基因的SNP可以鑒定候選基因并進行相關的研究。
[0005]催乳素是一種垂體前葉肽類激素，已報道的催乳素作用有300多種，主要表現在參與動物生長發育、繁殖、泌乳、代謝、免疫調節和電解質平衡等方面。這些作用均是通過催乳素受體(Prolactin receptor, PRLR)調節實現的。PRLR基因位于常染色體上。編碼奶牛PRLR的基因定位在20ql7上；人的PRLR基因定位于5pl3~5pl4上；豬的PRLR基因定位在16ql.4或16q2.2~16q2.3上；小鼠的定位在15號染色體上；大鼠的PRLR基因定位在2號染色體上；綿羊的PRLR基因定位于16號染色體上。
[0006]PRLR屬于細胞因子受體家族成員。根據對PRLR初級轉錄物的選擇性剪接形成的膜內區長度的不同，將PRLR分為三種類型:即長型(LPRLR)、中型(IPRLR)和短型(sPRLR)。研究表明由于各型催乳素受體膜內區不同，因而所啟動的下游信號通路也不同。如LPRLR激活后主要啟動JAK-STAT途徑，而iPRLR和sPRLR則不能啟動該途徑或者改變其信號轉導的方向，但sPRLR則對LF有抑制作用。奶牛有兩種形式的PRLR存在，即長型PRLR:由557個氨基酸組成的；短型PRLR:由272個氨基酸組成。LPRLR和sPRLR在泌乳周期、發情周期和妊娠周期均表達，但因各周期的激素環境不同其表達具有組織特異性。研究綿羊卵巢PRLR的表達情況發現=LPRLR在動情期表達量增加，在黃體中期和卵泡發生初期表達降低等，而sPRLR則在整個發情周期穩定表達。PRLR被認為是與產奶量及奶成分有關的重要候選基因。目前，關于PRLR基因的研究報道很多，主要集中在其多態性與產奶性能及繁殖性能等方面。由于PRLR在促進奶牛及奶山羊等動物的乳腺發育、乳汁生成和維持泌乳等方面發揮重要作用，人們通過對PRLR基 因多態性分析，希望找到有效的遺傳分子標記，以用于產奶動物產奶性狀的標記輔助選擇。
[0007]ETS轉錄因子家族有50多個成員組成，是轉錄因子家族中的最大的一個家族之一。該家族基因在人中有29個，在老鼠中有28個，在線蟲中有10個，在果蠅中有9個。ETS家族是一個有翼的螺旋-轉折-螺旋超家族，與E26鳥類的骨髓成紅血細胞增多癥病毒編碼的v-ets致癌基因同源，且帶有一個保守的同源DNA結合域。EST家族有很多功能，包括細胞分化、免疫應答、遷移、增殖與凋亡的調控及血管生成等。人類Ets家族基因在進化上高度保守，其共同點是在C-端的Ets區有一個大約85個氨基酸的DNA結合域。可識別并結合富含嘌呤的DNA核心序列A/CGGAA/T。大多數ETS家族基因的表達范圍較廣泛，但少數基因的表達是上皮特異性的，ELF5是其中的一個。ELF5作為ETS家族中的一個轉錄因子，該基因在人上被定位于11號染色體上(11ρ13-15處)，它能夠激活許多上皮特異性的基因啟動子，包括 SPRR2A、PSA、PSP。
[0008]研究發現ELF5是一個重要的乳腺腺泡發育調控因子，可以調控腔先驅細胞向腺泡結構分化。在乳腺發育過程中，ELF5功能的發揮是受催乳素調控的，而且它是催乳素發揮作用的中介因子。研究發現，在ELF5 + /—鼠中，乳腺不能夠分泌乳汁。研究發現在老鼠體內ELF5和乳蛋白基因的表達是直接相關的，并且在催乳素受體缺失鼠中ELF5可以代替催乳素信號發揮作用。研究發現ELF5基因在牛乳腺中表達，胰島素對其表達起著促進作用，并且它可能是一個重要的乳蛋白基因轉錄因子。從以上眾多研究報道可以發現，ELF5很可能是一個能夠對動物泌乳性能產生重要影響的候選基因。但目前還沒有研究ELF5基因對動物產奶性能影響的報道。
【發明內容】
[0009]本發明的目的在于，提供一種利用雙基因聚合效應選育奶山羊產奶性狀的方法。以對動物繁殖性狀有重要調控作用的PRLR和ELF5基因為研究對象，采用PCR-RFLP和DNA測序技術研究這2個基因在奶山羊中的SNPs及其與產奶性狀的關聯性；用數量遺傳學分析方法研究PRLR和ELF5基因聚合效應對產奶性狀的影響，為集成創新奶山羊產奶性狀的多基因聚合育種技術體系提供試驗依據和理論依據。
[0010]為了實現上述任務，本發明采取如下的技術解決方案:
[0011]一種利用雙基因聚合效應選育奶山羊產奶性狀的方法，其特征在于，以奶山羊基因組DNA為模板，在PCR條件下，利用2對引物Pl和P2，分別擴增催乳素受體(PRLR)基因的外顯子9和乳蛋白轉錄因子(ELF5)基因的內含子1，其中:
[0012]所述的引物Pl如下:
[0013]上游引物IF:5’ -CTTACCACAACATTGCTGAC-3’ ；
[0014]下游引物IR:5’ -CCTTGGCTGGATTCTATGG-3’ ;
[0015]所述的引物P2如下:
[0016]上游引物2F:5’ -CCTCTCCAACCTCAATCAG-3’ ；
[0017]下游引物2R: 5’ -CAGTCCAAGCAGGCAATA-3’ ；
[0018]引物Pl擴增催乳素受體(PRLR)基因的外顯子9，用于篩查奶山羊催乳素受體(PRLR)基因外顯子9位點的突變；
[0019]引物P2擴增乳蛋白轉錄因子(ELF5)基因內含子1，用于篩查奶山羊乳蛋白轉錄因子(ELF5)基因內含子I位點的突變；
[0020]用濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳對2對引物擴增產物進行大小判定，然后采用DNA測序技術篩查到催乳素受體(PRLR)基因外顯子9和乳蛋白轉錄因子(ELF5)基因內含子I共有3個堿基的突變。
[0021]再利用濃度為3.5%的瓊脂糖凝膠電泳對這3個位點的SNPs進行基因分型，分析不同基因型組合與奶山羊產奶性狀之間的關系，篩選最佳基因型組合，分析含有最佳基因型組合的高產個體形成的選配方式，應用這些選配方式選育奶山羊的多基因聚合良種核心群。
[0022]所述的PCR擴增的條件是:
[0023]15 μ L反應體系:包括DNA模板50ng，7.5 μ 12 X Taq MasterMix,上下游引物(10 μ Μ)各0.25 μ 1，加滅菌水至15 μ I ；
[0024]PCR反應程序如下:
[0025]I)利用引物Pl的PCR反應程序為:95°C預變性5min，94°C變性30s，57.3°C退火30s，72°C延伸32s，共進行33個循環，最后72°C充分延伸10min，4°C保存；[0026]2)利用引物P2的PCR反應程序為:95°C預變性5min，94°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸32s，如此進行33個循環，最后72°C充分延伸10min，4°C保存；
[0027]所述的催乳素受體(PRLR)基因外顯子9在61677bp存在G — A，在61865bp存在G — A的突變，這2個突變分別導致PRLR氨基酸序列的第485處絲氨酸突變為天冬酰胺(Ser — Asn)和第548處的繳氨酸突變為蛋氨酸(Val — Met),所述的乳蛋白轉錄因子(ELF5)基因內含子I在3694bp存在C — G的突變。
[0028]所述的基因分型是濃度為3.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析引物Pl和P2的PCR擴增產物，結果如下:
[0029]引物Pl位點在G61677A的突變處存在2種基因型，純合型GG在61677bp位的堿基是G，雜合型GA在61677bp位的堿基是G\A ；
[0030]弓丨物Pl位點在G61865A的突變處存在3種基因型，純合型GG在61865bp位的堿基是G，雜合型GA在61865bp位的堿基是G\A，純合型AA在61865bp位的堿基是A ；
[0031]引物P2位點在C3694G的突變處存在3種基因型，純合型CC在3694bp位的堿基是C，雜合型CG在3694bp位的堿基是C\G，純合型GG在3694bp位的堿基是G ；
[0032]所述的最佳基因型組合為C4(GGGGCC)。產奶量最低的基因型組合為Cl(GAGACC)。
[0033]所述的不同組合基因型組合對奶山羊產奶性狀的影響為:
[0034]C4 (GGGGCC)組合基因型個體第I泌乳期產奶量顯著高于Cl (GAGACC)和C2(GAGACG)型個體(P〈0.05) ；C5 (GGGGCG)組合基因型個體第I泌乳期產奶量顯著高于Cl(GAGACC)型個體(Ρ〈0.05) ;C4 (GGGGCC)、C5 (GGGGCG)和 C6 (GGGGGG)組合基因型個體第2泌乳期產奶量顯著高于Cl (G AGACC)型個體(Ρ〈0.05);C4 (GGGGCC)和C5 (GGGGCG)組合基因型個體第3泌乳期和平均泌乳期的產奶量顯著高于Cl (GAGACC)型個體(Ρ〈0.05)。
[0035]與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果:
[0036]提出了與奶山羊產奶性狀相關的功能基因催乳素受體(PRLR)基因外顯子9和乳蛋白轉錄因子(ELF5)基因內含子I的3個SNPs，這3個SNPs能夠作為一個分子遺傳標記，利用標記位點信息和數量性狀的表型信息，更準確估計動物個體的育種值，提高選擇效率，加快育種進展。
[0037]對這3個基因的SNPs進行了基因分型和基因頻率分析，檢測母羊個體的基因型組合與產奶性狀的關系，挑選最佳的基因型組合，分析含有最佳基因型組合個體的選配方式，應用這些選配方式形成奶山羊的多基因聚合良種核心群。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0038]圖1是奶山羊催乳素受體(PRLR)基因外顯子9利用引物Pl進行PCR擴增產物電泳圖；
[0039]圖2是奶山羊乳蛋白轉錄因子(ELF5)基因內含子I利用引物P2進行PCR擴增電泳圖；
[0040]圖3是催乳素受體(PRLR)基因外顯子9利用引物Pl進行PCR擴增產物的BfmI酶切產物的電泳檢測結果。
[0041]圖4是催乳素受體(PRLR)基因外顯子9利用引物Pl進行PCR擴增產物的SmaI酶切產物的電泳檢測結果；[0042]圖5是乳蛋白轉錄因子(ELF5)基因內含子I利用引物P2進行PCR產物的BstXI酶切產物的電泳檢測結果；
[0043]以下結合附圖和實施例對本發明作進一步的詳細說明。
【具體實施方式】
[0044]以下是通過對奶山羊基因組DNA的提取、檢測和濃度分析，以及在PCR擴增條件下，利用引物Pl和P2擴增的催乳素受體(PRLR)基因外顯子9和乳蛋白轉錄因子(ELF5)基因內含子I擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳分析的實施例。
[0045]A、利用引物Pl和P2分別擴增的催乳素受體(PRLR)基因外顯子9和乳蛋白轉錄因子(ELF5)基因內含子I及其多態性的檢測:
[0046]1、山羊血樣的采集及處理
[0047]取山羊血樣5mL,加入0.2 μ L的AO)(檸檬酸2.4g ;檸檬酸三鈉6.6g ;葡萄糖
7.35g ;定容至50mL，高壓滅菌)抗凝，緩慢顛倒3次后放入冰盒，-80°C保存備用。
[0048]本實施例血液樣本共采集712份，其中關中奶山羊(GZ)血樣327份，采自陜西圣唐乳液有限公司養殖基地；西農薩能奶山羊(SN)血樣385份，采自陜西省千陽縣羊場。
[0049]2、基因組DNA的提取
[0050]①取290 μ I加入抗凝劑的冷凍或新鮮血液，放入1.5ml離心管中；
[0051]②加入29 μ 120mg/ml的蛋白酶K溶液，室溫15分鐘(期間顛倒混勻幾次)，加入300 μ I混合液CB，立刻劇烈顛倒輕搖，充分混勻，70°C放置10分鐘，溶液應變清亮(但顏色偏黑色)；
[0052]③加入145μ I異丙醇(陳舊血加290μ I異丙醇)，劇烈顛倒輕搖，充分混勻，此時可能會出現絮狀沉淀。
[0053]上述各操作步驟中適當力度充分混勻非常重要，混勻不充分嚴重降低產量，必要時加入樣品粘稠不易混勻時可以渦旋震蕩15秒混勻，但不可用手劇烈震蕩，以免剪切DNA。
[0054]④將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱VI中，(吸附柱放入收集管中)IOOOOrpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液；
[0055]⑤加入725 μ I抑制物去除IR，12000rpm離心30秒，棄廢液；
[0056]⑥加入750 μ I漂洗液WB(請先檢查是否已加入無水乙醇！)，12000rpm離心30秒，
棄掉廢液。
[0057]⑦加入750 μ I漂洗液WB，12000rpm離心30秒，棄掉廢液。
[0058]⑧將吸附柱VI放回空收集管中，13000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。
[0059]⑨取出吸附柱VI，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加70μ I洗脫緩沖液EB(洗脫緩沖液事先在65°C~70°C水浴中預熱)，室溫放置3-5分鐘，12000rpm離心I分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12000rpm離心I分鐘，_20°C保存；
[0060]注意:洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當減少洗脫體積，但是最小體積不應少于50 μ 1，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產量。
[0061]3、DNA池的構建[0062](I)濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測
[0063]選部分DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇DNA樣品條帶均一、無拖尾、無降解的樣品進行DNA池的構建。 [0064](2) OD 值測定
[0065]用紫外光光度計測定DNA樣品在260nm、280nm處的OD值，并計算DNA含量和OD26tl/OD280的比值。如0D26(i/0D28(i比值小于1.6，說明樣品中含有較多的蛋白質或酚，則應進行純化；若比值大于1.8，則應該考慮去除RNA純化。
[0066]DNA 濃度(μ g/mL) =50 X OD260 值 X 稀釋倍數
[0067](3)品種DNA池的構建
[0068]DNA檢測完畢后，取出一定的量稀釋至80ng/μ I~IOOng/μ 1，然后從每個樣品中吸取5 μ I的DNA樣品混合構建DNA池。
[0069]4、PCR擴增引物設計
[0070]根據GenBank數據庫中牛PRLR基因的DNA序列(GenBank N0.NC_007318),利用Primer6.0設計引物P1，擴增催乳素受體(PRLR)基因外顯子9，篩查奶山羊PRLR基因Pl位點的突變；
[0071]根據GenBank數據庫中牛ELF5基因的DNA序列(GenBank N0.AC_000172),利用Primer6.0設計引物P2，擴增奶山羊乳蛋白轉錄因子(ELF5 )基因內含子I，篩查奶山羊ELF5基因P2位點的突變。
[0072]所述的引物Pl如下:
[0073]上游引物IF:5’ -CTTACCACAACATTGCTGAC-3’ ；
[0074]下游引物IR:5’ -CCTTGGCTGGATTCTATGG-3’ ;
[0075]所述的引物P2如下:
[0076]上游引物2F:5’-CCTCTCCAACCTCAATCAG-3’ ；
[0077]下游引物2R:5’-CAGTCCAAGCAGGCAATA-3’ ；
[0078]5、PCR 擴增
[0079]分別以單個奶山羊群體的DNA池為模版，利用引物Pl和P2分別擴增的催乳素受體(PRLR)基因外顯子9和乳蛋白轉錄因子(ELF5)基因內含子1，PCR擴增條件及程序如下所示:
[0080]PCR擴增的條件是:
[0081]15 μ L反應體系:包括DNA模板50ng，7.5 μ 12XTaq MasterMix，上下游引物(10 μ Μ)各0.25 μ 1，加滅菌水至15 μ I ；
[0082]PCR反應程序如下:
[0083]I)利用引物Pl的PCR反應程序為:95°C預變性5min，94°C變性30s，57.3°C退火30s，72°C延伸32s，共進行33個循環，最后72°C充分延伸10min，4°C保存；
[0084]2)利用引物P2的PCR反應程序為:95°C預變性5min，94°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸32s，如此進行33個循環，最后72°C充分延伸10min，4°C保存；
[0085]6、PCR產物純化和測序
[0086]PCR擴增完成之后進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果如圖1、圖2和圖3所示，可以清楚看到465bp和430bp的條帶，說明目的基因片段擴增成功；[0087]然后進行PCR產物的切膠回收及純化:在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mL離心管中，然后用PCR產物回收純化試劑盒(北京天根生物公司)純化PCR產物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟如下:
[0088](I)首先向吸附柱中加入500 μ L平衡液BL，12000r/min離心lmin，倒掉收集管中
的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
[0089](2)將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入干凈的離心管中，稱取重量。
[0090](3)向膠塊中加入等體積溶液PC，60°C水浴放置10分鐘左右，其間不斷溫和地上下翻轉離心管，以確保膠塊充分溶解。
[0091](4)將上一步所得溶液加入一個吸附柱中，12000r/min離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。
[0092](5)向吸附柱中加入700 μ L漂洗液，12000r/min離心lmin，倒掉廢液，將吸附柱重
新放入收集管中。
[0093](6)向吸附柱中加入500 μ L漂洗液，12000r/min離心lmin，倒掉廢液，將離心吸附柱放入收集管中，12000r/min離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫或50°C溫箱數分鐘，徹底晾干。
[0094](7)將吸附柱放到一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫緩沖液，室溫放置2min。12000r/min離心lmin收集DNA溶液。
[0095](8)為了提高DNA的 回收量，可將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中，重復步驟7。
[0096]把以上以2個奶山羊群體DNA池為模板的PCR純化產物送英俊公司進行雙向測序，對測序峰圖進行分析，結果表明，所述的催乳素受體(PRLR)基因外顯子9在61677bp存在G — A，在61865bp存在G — A的突變，這2個突變分別導致PRLR氨基酸序列的第485處絲氨酸突變為天冬酰胺(Ser — Asn)和第548處的纈氨酸突變為蛋氨酸(Val — Met)，所述的乳蛋白轉錄因子(ELF5)基因內含子I在3694bp存在C — G的突變。
[0097]B、利用引物Pl和P2擴增得到的奶山羊催乳素受體(PRLR)基因外顯子9和乳蛋白轉錄因子(ELF5)基因內含子I的3個SNPs的瓊脂糖凝膠電泳分析:
[0098]利用引物Pl和P2分別對2個奶山羊品種712份基因組DNA進行PCR擴增，然后利用如下方法對每個奶山羊的催乳素受體(PRLR)基因外顯子9和乳蛋白轉錄因子(ELF5)基因內含子I進行基因分型，具體方法如下:
[0099]用濃度為3.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析，電壓105V電泳45min，凝膠成像系統拍照并分型。基因分型結果見圖3，圖4和圖5。
[0100]C、SNP位點的遺傳結構分析
[0101]基因型頻率是指一個群體中某一性狀的某種基因型個體數占總個體數的比率。PAA = NAA/N，其中PAA代表某一位點的AA基因型頻率；NAA表示群體中具有AA基因型的個體數；N為檢測群體的總數量。多態信息含量(PIC)用來估計標記位點的多態，PIC〈0.25為低度多態，0.25〈PIC〈0.5為中度多態，PIO0.5為高度多態。雜合度(He)是度量某一群體中特定位點上等位基因雜合程度的指標。采用皮爾遜X2統計量對某基因位點的Hardy-Weinberg平衡性進行檢測(表1)。
[0102]表1:SNP位點的遺傳結構
【權利要求】
1.一種利用雙基因聚合效應選育奶山羊產奶性狀的方法，其特征在于，以奶山羊基因組DNA為模板，在PCR條件下，利用2對引物Pl和P2，分別擴增催乳素受體(PRLR)基因的外顯子9和乳蛋白轉錄因子(ELF5)基因的內含子1，其中: 所述的引物Pl如下:
上游引物 IF:5’ -CTTACCACAACATTGCTGAC-3’ ；
下游引物 IR:5’-CCTTGGCTGGATTCTATGG-3’ ； 所述的引物P2如下:
上游引物 2F:5’ -CCTCTCCAACCTCAATCAG-3’ ；
下游引物 2R:5’ -CAGTCCAAGCAGGCAATA-3’ ； 引物Pl擴增催乳素受體(PRLR)基因的外顯子9，用于篩查奶山羊催乳素受體(PRLR)基因外顯子9位點的突變； 引物P2擴增乳蛋白轉錄因子(ELF5)基因內含子1，用于篩查奶山羊乳蛋白轉錄因子(ELF5)基因內含子I位點的突變； 用濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳對2對引物擴增產物進行大小判定，然后采用DNA測序技術篩查到催乳素受體(PRLR)基因外顯子9和乳蛋白轉錄因子(ELF5)基因內含子I共有3個堿基的突變； 再利用濃度為3.5%的瓊脂糖凝膠電泳對這3個位點的SNPs進行基因分型，分析不同基因型組合與奶山羊產奶性狀之間的關系，篩選最佳基因型組合，分析含有最佳基因型組合的高產個體形成的選配方式，應用這些選配方式選育奶山羊的多基因聚合良種核心群。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的PCR擴增的條件是: 15 μ L反應體系:包括DNA模板50ng，7.5 μ 12 X Taq MasterMix，10 μ M的上下游引物各0.25 μ I，加滅菌水至15 μ I ； PCR反應程序如下:
1)利用引物Pl的PCR反應程序為:95°C預變性5min，94°C變性30s,57.3°C退火30s，72°C延伸32s，共進行33個循環，最后72°C充分延伸10min，4°C保存； 2)利用引物P2的PCR反應程序為:95°C預變性5min，94°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸32s，共進行33個循環，最后72°C充分延伸10min，4°C保存。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的催乳素受體(PRLR)基因外顯子9在61677bp存在G — A，在61865bp存在G — A的突變，這2個突變分別導致PRLR氨基酸序列的第485處絲氨酸突變為天冬酰胺(Ser — Asn)和第548處的纈氨酸突變為蛋氨酸(Val — Met)，所述的乳蛋白轉錄因子(ELF5)基因內含子I在3694bp存在C — G的突變。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因分型是濃度為3.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析引物Pl和P2的PCR擴增產物，結果如下: 引物Pl位點在G61677A的突變處存在2種基因型，純合型GG在61677bp位的堿基是G,雜合型GA在61677bp位的堿基是G\A ； 引物Pl位點在G61865A的突變處存在3種基因型，純合型GG在61865bp位的堿基是G,雜合型GA在61865bp位的堿基是G\A，純合型AA在61865bp位的堿基是A ； 引物P2位點在C3694G的突變處存在3種基因型，純合型CC在3694bp位的堿基是C，雜合型CG在3694bp位的堿基是C\G，純合型GG在3694bp位的堿基是G。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的最佳基因型組合為C4(GGGGCC)0產奶量最低的基因型組合為Cl (GAGACC)0
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的不同基因型組合對奶山羊產奶性狀的影響為: C4 (GGGGCC)組合基因型個體第I泌乳期產奶量顯著高于Cl (GAGACC)和C2 (GAGACG)型個體(P〈0.05) ；C5 (GGGGCG)組合基因型個體第I泌乳期產奶量顯著高于Cl (GAGACC)型個體；C4 (GGGGCC)、C5 (GGGGCG)和C6 (GGGGGG)組合基因型個體第2泌乳期產奶量顯著高于Cl (GAGACC)型個體；C4 (GGGGCC)和C5 (GGGGCG)組合基因型個體第3泌乳期和平均泌乳期的產奶量顯著高于Cl (GAGACC)型個體。
【文檔編號】C12Q1/68GK103468819SQ201310449829
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月27日 優先權日:2013年9月27日
【發明者】曹斌云, 侯金星, 安小鵬, 王建剛, 宋宇軒 申請人:西北農林科技大學