牛呼吸道疾病綜合征多重pcr檢測試劑盒及其制備方法
【專利摘要】牛呼吸道疾病綜合征多重PCR檢測試劑盒及其制備方法，涉及牛呼吸道疾病主要病毒檢測領域，解決了檢測牛呼吸道疾病綜合征多聯PCR方法存在無法同時有效檢測牛呼吸道疾病綜合征的四種病原的問題。該試劑盒包括MightyAmp?DNA聚合酶，2xBuffe?Mix緩沖液，無菌雙蒸水，分別鑒定牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛呼吸道合胞體病毒、牛病毒性腹瀉病毒以及牛副流感3型病毒的四對特異性引物，還包括上述四種病毒的陽性對照質粒。本發明可在同一反應體系中同時檢測是否含有上述四種病毒的核酸，特異性和敏感性較高，可對牛群中隱形感染或持續帶毒宿主和發病動物進行準確檢測，無感染性，安全性高，可在短時間檢測出結果，省時省力。
【專利說明】牛呼吸道疾病綜合征多重PCR檢測試劑盒及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及牛呼吸道疾病主要病毒的檢測【技術領域】，具體涉及一種牛呼吸道疾病綜合征多重PCR檢測試劑盒及其制備方法。
【背景技術】
[0002]隨著我國進出口貿易和養牛業的快速發展，牛系統性疾病時有發生且危害嚴重，研究表明，牛呼吸道疾病綜合征(Bovine respiratorydisease compLex,簡稱BRDC)是由于牛生產運輸和早期斷奶造成的主要系統性疾病之一，由多個致病因子或病原包括應激、病毒和細菌的共同作用引起的，因此病毒的潛在感染是造成該病的重要原因，也是導致牛呼吸道疾病的啟動器。在牛呼吸道疾病中分離出的病毒主要包括牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和牛副流感3型病毒(BPI3)，這些病毒常常形成持續型感染，且急性感染更容易造成大面積的死亡，一旦感染，將會嚴重影響架子牛生長及奶牛的產奶量和牛奶的質量。
[0003]目前，對牛呼吸道疾病綜合征的檢測采用國家標準規定的血清中和試驗方法以及多聯PCR方法，由于牛呼吸道疾病綜合征存在潛伏感染和長期排毒，血清中和試驗方法操作復雜且費時費力，進口產品價格昂貴，檢測成本也較高，并且局限在實驗室操作，很難實現推廣和應用；多聯PCR方法對牛呼吸道疾病綜合征的檢測靈敏高效、經濟簡便，適合推廣應用，多聯PCR方法在疾病的診斷中也是常規的檢測方法有著重要的意義，更適合牛呼吸道疾病綜合征的檢測，但是，目前多聯PCR方法在檢測時主要是針對牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和牛副流感3型病毒(BPI3)建立的PCR檢測方法，因牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)基因組的特殊性，給同一體系同時檢測牛呼吸道疾病綜合征的四種病原帶來極大困難，而臨床往往會發生同時感染的情況，因此，迫切需要建立一種能同時檢測牛呼吸道疾病綜合征的四種病原的多重PCR檢測試劑盒。
【發明內容】
[0004]為了解決現有檢測牛呼吸道疾病綜合征的多聯PCR方法存在的無法同時有效檢測牛呼吸道疾病綜合征的四種病原的問題，本發明提供一種牛呼吸道疾病綜合征多重PCR檢測試劑盒及其制備方法。
[0005]本發明為解決技術問題所采用的技術方案如下:
[0006]牛呼吸道疾病綜合征多重PCR檢測試劑盒，該試劑盒包括:
[0007]MightyAmp DNA聚合酶、2xBuffe Mix緩沖液、無菌雙蒸水、四對特異性引物和四個陽性對照質粒；
[0008]所述四對特異性引物分別為:鑒定牛傳染性鼻氣管炎病毒的引物P1和P2，鑒定牛呼吸道合胞體病毒的引物P3和P4,鑒定牛病毒性腹瀉病毒的引物P5和P6,鑒定牛副流感3型病毒的引物P7和P8:
[0009]P1:5’-GCTCGCCAACTTCTTTCAGGG-3’，[0010]P2:5，-GCGTCAAACTCCTCCTCTTCCTC-3，，[0011]P3:5’-TATGCTATGTCCCGATTGG-3’，
[0012]P4:5’-ACTGATTTGGCTAGTACACCC-3’，
[0013]P5:5’-GGTAGCAACAGTGGTGAGTTC-3’，
[0014]P6:5’-CTCAGGTTAAGATGTGCTGTG-3’ ，
[0015]P7:5’-GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT-3’ ，
[0016]P8:5’-AACCCCTTCCTCAATCCTGATATAC-3’ ；
[0017]所述四個陽性對照質粒分別為:牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性對照質粒、牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒、牛病毒性腹瀉病毒陽性對照質粒和牛副流感3型病毒陽性對照質粒;
[0018]所述牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性對照質粒為含有306個堿基的核苷酸片段構成的pMDlS-T重組質粒，所述牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒為含有600個堿基的核苷酸片段構成的PMD18-T重組質粒，所述牛病毒性腹瀉病毒陽性對照質粒為含有130個堿基的核苷酸片段構成的PMD18-T重組質粒，所述牛副流感3型病毒陽性對照質粒為含有425個堿基的核苷酸片段構成的PMD18-T重組質粒；
[0019]所述含有306個堿基的核苷酸片段構成的PMD18-T重組質粒、含有600個堿基的核苷酸片段構成的PMD18-T重組質粒、含有130個堿基的核苷酸片段構成的pMD18-T重組質粒和含有425個堿基的核苷酸片段構成的PMD18-T重組質粒均能在大腸桿菌DH5 a感受態細胞中增殖。
[0020]所述含有306個堿基的核苷酸片段的序列為:
[0021]GCTCGCCAACTTCTTTCAGGGCCTGGGCGCCGTCGGGCAGGCGGTGGGCACGGTGGTGCTGGGCGCCGCGGGTGCCGCGCTCTCGACCGTGTCGGGCATCGCCTCGTTTATTGCGAACCCGTTCGGCGCGCTGGCCACGGGGCTGCTGGTGCTCGCCGGGCTGGTGGCCGCTTTCCTGGCGTACCGGTACATTTCCCGCCTCCGCAGCAACCCCATGAAGGCGCTGTACCCGATCACCACGCGCGCGCTCAAGGACGACGCCCGGGGCGCAACCGCCCCGGGCGAGGAAGAGGAGGAGTTTGACGC ；
[0022]所述含有600個堿基的核苷酸片段的序列為:
[0023]TATGCTATGTCCCGATTGGGGAGAGAAGATACCCTTAAAATACTCAAAGATGCAGGCTACCAAGTGAGGGCCAATGGGGTTGATGTGATAACACATCGACAGGATGTGAATGGAAAAGAAATGAAATTTGAAGTGCTAACATTAGTCAGCTTAACATCAGAAGTTCAAGGTAATATAGAAATAGAGTCAAGGAAGTCTTACAAAAAGATGCTAAAAGAGATGGGAGAGGTAGCTCCAGAATACAGACATGACTTTCCTGATTGTGGTATGATAGTGCTATGTGTTGCTGCTTTGGTTATAACAAAATTAGCAGCAGGTGATAGGTCAGGCCTCACTGCAGTCATTAGGAGAGCCAACAATGTACTAAGGAATGAAATGAAACGATACAAAGGACTCATCCCGAAAGATATAGCCAACAGCTTCTATGAAGTATTTGAAAAGTACCCTCATTACATAGATGTATTCGTACATTTTGGCATTGCTCAATCCTCAACTAGAGGAGGTAGTAGGGTAGAAGGAATCTTTGCAGGGTTATTCATGAATGCATATGGAGCAGGTCAAGTGATGTTAAGATGGGGTGTGCTAGCCAAATCAGT ；
[0024]所述含有130個堿基的核苷酸片段的序列為:
[0025]GGTAGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGAAGGCTGAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCGACGCTTCGGAGGACAAGCCTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCACAGCACATCTTAACCTGAG ；
[0026]所述含有425個堿基的核苷酸片段的序列為:
[0027]GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTTTGGACAACGAAAAGCAACATGCACAACGAGCCGGATTTCTAGTCTCTCTGTTATCAATGGCCTATGCCAACCCAGAATTGTATTTAACATCAAATGGTAGTAATGCAGATGTTAAGTATGT
CATCTACATGATAGAGAAAGACCCAGGAAGACAAAAATATGGTGGGTTAGTAGTCAAGACTAGAGAGATGGTTTATG
AAAAGACAACCGACTGGATGTTCGGGAGTGATCTTGAGTATGATCAAGATAATATGTTGCAAAATGGTAGAGGCACT
TCTACAATTGAGGATCTTGTTCATACTTTTGGGTATCCATCATGTCTTGGAGCTCTAATAATCCAGATTTGGATAAT
ACTTGTCAAGGCTATAACCAGTATATCAGGATTGAGGAAGGGGTTo
[0028]該試劑盒還包括陰性對照，所述陰性對照為蒸餾水。
[0029]所述牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性對照質粒通過以下方法制備:以牛傳染性鼻氣管炎病毒的gB基因為模板，以P1和P2為引物進行PCR擴增，得到長度為306bp的擴增產物，將擴增產物回收并純化后克隆至PMD18-T載體，得到牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性對照質粒；
[0030]P1:5’-GCTCGCCAACTTCTTTCAGGG-3’，
[0031]P2:5’-GCGTCAAACTCCTCCTCTTCCTC-3’ ；
[0032]得到的牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性對照質粒的序列為:
[0033]ATGCAGTGAATGATTACGATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGCTCGCCAACTTCTTTCAGGGCCTGGGCGCCGTCGGGCAGGCGGTGGGCACGGTGGTGCTGGGCGCCGCGGGTGCCGCGCTCTCGACCGTGTCGGGCATCGCCTCGTTTATTGCGAACCCGTTCGGCGCGCTGGCCACGGGGCTGCTGGTGCTCGCCGGGCTGGTGGCCGCTTTCCTGGCGTACCGGTACATTTCCCGCCTCCGCAGCAACCCCATGAAGGCGCTGTACCCGATCACCACGCGCGCGCTCAAGGACGACGCCCGGGGCGCAACCGCCCCGGGCGAGGAAGAGGAGGAGTTTGACGCAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTT。
[0034]所述牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒通過以下方法制備:以牛呼吸道合胞體病毒的NP基因為模板，以P3和P4為引物進行PCR擴增，得到長度為600bp的擴增產物，將擴增產物回收并純化后克隆至PMD18-T載體，得到牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒；
[0035]P3:5’-TATGCTATGTCCCGATTGG-3’ ，
[0036]P4:5’-ACTGATTTGGCTAGTACACCC-3’ ；
[0037]得到的牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒的序列為:
[0038]TTACGTGCATTCGATTTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTTATGCTATGTCCCGATTGGGGAGAGAAGATACCCTTAAAATACTCAAAGATGCAGGCTACCAAGTGAGGGCCAATGGGGTTGATGTGATAACACATCGACAGGATGTGAATGGAAAAGAAATGAAATTTGAAGTGCTAACATTAGTCAGCTTAACATCAGAAGTTCAAGGTAATATAGAAATAGAGTCAAGGAAGTCTTACAAAAAGATGCTAAAAGAGATGGGAGAGGTAGCTCCAGAATACAGACATGACTTTCCTGATTGTGGTATGATAGTGCTATGTGTTGCTGCTTTGGTTATAACAAAATTAGCAGCAGGTGATAGGTCAGGCCTCACTGCAGTCATTAGGAGAGCCAACAATGTACTAAGGAATGAAATGAAACGATACAAAGGACTCATCCCGAAAGATATAGCCAACAGCTTCTATGAAGTATTTGAAAAGTACCCTCATTACATAGATGTATTCGTACATTTTGGCATTGCTCAATCCTCAACTAGAGGAGGTAGTAGGGTAGAAGGAATCTTTGCAGGGTTATTCATGAATGCATATGGAGCAGGTCAAGTGATGTTAAGATGGGGTGTGCTAGCCAAATCAGTAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCo
[0039]所述牛病毒性腹瀉病毒陽性對照質粒通過以下方法制備:以牛病毒性腹瀉病毒的5’ -UTR基因為模板，以P5和P6為引物進行PCR擴增，得到長度為130bp的擴增產物，將擴增產物回收并純化后克隆至PMD18-T載體，得到牛病毒性腹瀉病毒陽性對照質粒；
[0040]P5:5’-GGTAGCAACAGTGGTGAGTTC-3’ ，
[0041]P6: 5，-CTCAGGTTAAGATGTGCTGTG-3，；
[0042]得到的牛病毒性腹瀉病毒陽性對照質粒的序列為:[0043]TTACGTGCATTCGATTTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGGTAGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGAAGGCTGAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCGACGCTTCGGAGGACAAGCCTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCACAGCACATCTTAACCTGAGAATCGTCGACCTGCAGGCATo
[0044]所述牛副流感3型病毒陽性對照質粒通過以下方法制備:以牛副流感3型病毒的NP基因為模板，以P7和P8為引物進行PCR擴增，得到長度為425bp的擴增產物，將擴增產物回收并純化后克隆至PMD18-T載體，得到牛副流感3型病毒陽性對照質粒；
[0045]P7:5’-GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT-3’ ，
[0046]P8:5’-AACCCCTTCCTCAATCCTGATATAC-3’ ；
[0047]得到的牛副流感3型病毒陽性對照質粒的序列為:
[0048]ATGCAGTGAATGATTACGATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTTTGGACAACGAAAAGCAACATGCACAACGAGCCGGATTTCTAGTCTCTCTGTTATCAATGGCCTATGCCAACCCAGAATTGTATTTAACATCAAATGGTAGTAATGCAGATGTTAAGTATGTCATCTACATGATAGAGAAAGACCCAGGAAGACAAAAATATGGTGGGTTAGTAGTCAAGACTAGAGAGATGGTTTATGAAAAGACAACCGACTGGATGTTCGGGAGTGATCTTGAGTATGATCAAGATAATATGTTGCAAAATGGTAGAGGCACTTCTACAATTGAGGATCTTGTTCATACTTTTGGGTATCCATCATGTCTTGGAGCTCTAATAATCCAGATTTGGATAATACTTGTCAAGGCTATAACCAGTATATCAGGATTGAGGAAGGGGTTAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGo
[0049]牛呼吸道疾病綜合征多重PCR檢測試劑盒的制備方法，該方法的條件和步驟如下:[0050](I)配制PCR反應液:所述PCR反應液包括MightyAmp DNA聚合酶、2xBuffer Mix緩沖液、無菌雙蒸水和四對特異性引物；
[0051]所述四對特異性引物分別為:鑒定牛傳染性鼻氣管炎病毒的引物P1和P2，鑒定牛呼吸道合胞體病毒的引物P3和P4,鑒定牛病毒性腹瀉病毒的引物P5和P6,鑒定牛副流感3型病毒的引物P7和P8:
[0052]P1:5’-GCTCGCCAACTTCTTTCAGGG-3’，
[0053]P2:5，-GCGTCAAACTCCTCCTCTTCCTC-3，，
[0054]P3:5’-TATGCTATGTCCCGATTGG-3’，
[0055]P4:5’-ACTGATTTGGCTAGTACACCC-3’，
[0056]P5:5’-GGTAGCAACAGTGGTGAGTTC-3’，
[0057]P6:5’-CTCAGGTTAAGATGTGCTGTG-3’，
[0058]P7:5’-GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT-3’，
[0059]P8:5’-AACCCCTTCCTCAATCCTGATATAC-3’ ；
[0060](2)建立四個陽性對照質粒:
[0061]所述四個陽性對照質粒分別為:牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性對照質粒、牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒、牛病毒性腹瀉病毒陽性對照質粒和牛副流感3型病毒陽性對照質粒;
[0062]所述牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性對照質粒為含有306個堿基的核苷酸片段構成的pMDlS-T重組質粒，所述牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒為含有600個堿基的核苷酸片段構成的PMD18-T重組質粒，所述牛病毒性腹瀉病毒陽性對照質粒為含有130個堿基的核苷酸片段構成的PMD18-T重組質粒，所述牛副流感3型病毒陽性對照質粒為含有425個堿基的核苷酸片段構成的PMD18-T重組質粒；
[0063]所述含有306個堿基的核苷酸片段構成的PMD18-T重組質粒、含有600個堿基的核苷酸片段構成的PMD18-T重組質粒、含有130個堿基的核苷酸片段構成的pMD18-T重組質粒和含有425個堿基的核苷酸片段構成的PMD18-T重組質粒均能在大腸桿菌DH5 α感受態細胞中增殖；
[0064](3)陰性對照:所述陰性對照為蒸餾水。
[0065]所述含有306個堿基的核苷酸片段的序列為:
[0066]GCTCGCCAACTTCTTTCAGGGCCTGGGCGCCGTCGGGCAGGCGGTGGGCACGGTGGTGCTGGGCGCCGCGGGTGCCGCGCTCTCGACCGTGTCGGGCATCGCCTCGTTTATTGCGAACCCGTTCGGCGCGCTGGCCACGGGGCTGCTGGTGCTCGCCGGGCTGGTGGCCGCTTTCCTGGCGTACCGGTACATTTCCCGCCTCCGCAGCAACCCCATGAAGGCGCTGTACCCGATCACCACGCGCGCGCTCAAGGACGACGCCCGGGGCGCAACCGCCCCGGGCGAGGAAGAGGAGGAGTTTGACGC ；
[0067]所述含有600個堿基的核苷酸片段的序列為:
[0068]TATGCTATGTCCCGATTGGGGAGAGAAGATACCCTTAAAATACTCAAAGATGCAGGCTACCAAGTGAGGGCCAATGGGGTTGATGTGATAACACATCGACAGGATGTGAATGGAAAAGAAATGAAATTTGAAGTGCTAACATTAGTCAGCTTAACATCAGAAGTTCAAGGTAATATAGAAATAGAGTCAAGGAAGTCTTACAAAAAGATGCTAAAAGAGATGGGAGAGGTAGCTCCAGAATACAGACATGACTTTCCTGATTGTGGTATGATAGTGCTATGTGTTGCTGCTTTGGTTATAACAAAATTAGCAGCAGGTGATAGGTCAGGCCTCACTGCAGTCATTAGGAGAGCCAACAATGTACTAAGGAATGAAATGAAACGATACAAAGGACTCATCCCGAAAGATATAGCCAACAGCTTCTATGAAGTATTTGAAAAGTACCCTCATTACATAGATGTATTCGTACATTTTGGCATTGCTCAATCCTCAACTAGAGGAGGTAGTAGGGTAGAAGGAATCTTTGCAGGGTTATTCATGAATGCATATGGAGCAGGTCAAGTGATGTTAAGATGGGGTGTGCTAGCCAAATCAGT ；
[0069]所述含有130個堿基的核苷酸片段的序列為:
[0070]GGTAGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGAAGGCTGAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCGACGCTTCGGAGGACAAGCCTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCACAGCACATCTTAACCTGAG ；
[0071]所述含有425個堿基的核苷酸片段的序列為:
[0072]GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTTTGGACAACGAAAAGCAACATGCACAACGAGCCGGATTTCTAGTCTCTCTGTTATCAATGGCCTATGCCAACCCAGAATTGTATTTAACATCAAATGGTAGTAATGCAGATGTTAAGTATGTCATCTACATGATAGAGAAAGACCCAGGAAGACAAAAATATGGTGGGTTAGTAGTCAAGACTAGAGAGATGGTTTATGAAAAGACAACCGACTGGATGTTCGGGAGTGATCTTGAGTATGATCAAGATAATATGTTGCAAAATGGTAGAGGCACTTCTACAATTGAGGATCTTGTTCATACTTTTGGGTATCCATCATGTCTTGGAGCTCTAATAATCCAGATTTGGATAATACTTGTCAAGGCTATAACCAGTATATCAGGATTGAGGAAGGGGTTo
[0073]所述牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒通過以下方法制備:以牛呼吸道合胞體病毒的NP基因為模板，以P3和P4為引物進行PCR擴增，得到長度為600bp的擴增產物，將擴增產物回收并純化后克隆至PMD18-T載體，得到牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒；
[0074]P3:5’-TATGCTATGTCCCGATTGG-3’ ，
[0075]P4:5’-ACTGATTTGGCTAGTACACCC-3’ ；
[0076]得到的牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒的序列為:
[0077]TTACGTGCATTCGATTTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTTATGCTATGTCCCGATTGGGGAGAGAAGATACCCTTAAAATACTCAAAGATGCAGGCTACCAAGTGAGGGCCAATGGGGTTGATGTGATAACACATC
【權利要求】
1.牛呼吸道疾病綜合征多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括: MightyAmp DNA聚合酶、2xBuffe Mix緩沖液、無菌雙蒸水、四對特異性引物和四個陽性對照質粒； 所述四對特異性引物分別為:鑒定牛傳染性鼻氣管炎病毒的引物P1和P2，鑒定牛呼吸道合胞體病毒的引物P3和P4,鑒定牛病毒性腹瀉病毒的引物P5和P6,鑒定牛副流感3型病毒的引物P7和P8:
P1:5’-GCTCGCCAACTTCTTTCAGGG-3’，
P2:5’-GCGTCAAACTCCTCCTCTTCCTC-3’ ，
P3:5’-TATGCTATGTCCCGATTGG-3’，
P4:5’-ACTGATTTGGCTAGTACACCC-3’ ，
P5:5，-GGTAGCAACAGTGGTGAGTTC-3，，
P6:5’-CTCAGGTTAAGATGTGCTGTG-3’，
P7:5’-GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT-3’，
P8:5’-AACCCCTTCCTCA ATCCTGATATAC-3’ ； 所述四個陽性對照質粒分別為:牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性對照質粒、牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒、牛病毒性腹瀉病毒陽性對照質粒和牛副流感3型病毒陽性對照質粒; 所述牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性對照質粒為含有306個堿基的核苷酸片段構成的PMD18-T重組質粒，所述牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒為含有600個堿基的核苷酸片段構成的PMD18-T重組質粒，所述牛病毒性腹瀉病毒陽性對照質粒為含有130個堿基的核苷酸片段構成的PMD18-T重組質粒，所述牛副流感3型病毒陽性對照質粒為含有425個堿基的核苷酸片段構成的PMD18-T重組質粒； 所述含有306個堿基的核苷酸片段構成的pMD18-T重組質粒、含有600個堿基的核苷酸片段構成的PMD18-T重組質粒、含有130個堿基的核苷酸片段構成的pMD18-T重組質粒和含有425個堿基的核苷酸片段構成的PMD18-T重組質粒均能在大腸桿菌DH5 α感受態細胞中增殖。
2.根據權利要求1所述的牛呼吸道疾病綜合征多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述含有306個堿基的核苷酸片段的序列為:
GCTCGCCAACTTCTTTCAGGGCCTGGGCGCCGTCGGGCAGGCGGTGGGCACGGTGGTGCTGGGCGCCGCGGGTGCCGCGCTCTCGACCGTGTCGGGCATCGCCTCGTTTATTGCGAACCCGTTCGGCGCGCTGGCCACGGGGCTGCTGGTGCTCGCCGGGCTGGTGGCCGCTTTCCTGGCGTACCGGTACATTTCCCGCCTCCGCAGCAACCCCATGAAGGCGCTGTACCCGATCACCACGCGCGCGCTCAAGGACGACGCCCGGGGCGCAACCGCCCCGGGCGAGGAAGAGGAGGAGTTTGACGC ； 所述含有600個堿基的核苷酸片段的序列為:
TATGCTATGTCCCGATTGGGGAGAGAAGATACCCTTAAAATACTCAAAGATGCAGGCTACCAAGTGAGGGCCAATGGGGTTGATGTGATAACACATCGACAGGATGTGAATGGAAAAGAAATGAAATTTGAAGTGCTAACATTAGTCAGCTTAACATCAGAAGTTCAAGGTAATATAGAAATAGAGTCAAGGAAGTCTTACAAAAAGATGCTAAAAGAGATGGGAGAGGTAGCTCCAGAATACAGACATGACTTTCCTGATTGTGGTATGATAGTGCTATGTGTTGCTGCTTTGGTTATAACAAAATTAGCAGCAGGTGATAGGTCAGGCCTCACTGCAGTCATTAGGAGAGCCAACAATGTACTAAGGAATGAAATGAAACGATACAAAGGACTCATCCCGAAAGATATAGCCAACAGCTTCTATGAAGTATTTGAAAAGTACCCTCATTACATAGATGTATTCGTACATTTTGGCATTGCTCAATCCTCAACTAGAGGAGGTAGTAGGGTAGAAGGAATCTTTGCAGGGTTATTCATGAATGCATATGGAGCAGGTCAAGTGATGTTAAGATGGGGTGTGCTAGCCAAATCAGT ； 所述含有130個堿基的核苷酸片段的序列為:
GGTAGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGAAGGCTGAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCGACGCTTCGGAGGACAAGCCTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCACAGCACATCTTAACCTGAG ； 所述含有425個堿基的核苷酸片段的序列為:
GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTTTGGACAACGAAAAGCAACATGCACAACGAGCCGGATTTCTAGTCTCTCTGTTATCAATGGCCTATGCCAACCCAGAATTGTATTTAACATCAAATGGTAGTAATGCAGATGTTAAGTATGTCATCTACATGATAGAGAAAGACCCAGGAAGACAAAAATATGGTGGGTTAGTAGTCAAGACTAGAGAGATGGTTTATGAAAAGACAACCGACTGGATGTTCGGGAGTGATCTTGAGTATGATCAAGATAATATGTTGCAAAATGGTAGAGGCACTTCTACAATTGAGGATCTTGTTCATACTTTTGGGTATCCATCATGTCTTGGAGCTCTAATAATCCAGATTTGGATAATACTTGTCAAGGCTATAACCAGTATATCAGGATTGAGGAAGGGGTTo
3.根據權利要求1所述的牛呼吸道疾病綜合征多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括陰性對照，所述陰性對照為蒸餾水。
4.根據權利要求1所述的牛呼吸道疾病綜合征多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性對照質粒通過以下方法制備:以牛傳染性鼻氣管炎病毒的gB基因為模板，以P1和P2為引物進行PCR擴增，得到長度為306bp的擴增產物，將擴增產物回收并純化后克隆至PMD18-T載體，得到牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性對照質粒；
P1:5’-GCTCGCCAACTTCTTTCAGGG-3’，
P2:5’-GCGTCAAACTCCTCCTCTTCCTC-3’ ； 得到的牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性對照質粒的序列為:
ATGCAGTGAATGATTACGATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGCTCGCCAACTTCTTTCAGGGCCTGGGCGCCGTCGGGCAGGCGGTGGGCACGGTGGTGCTGGGCGCCGCGGGTGCCGCGCTCTCGACCGTGTCGGGCATCGCCTCGTTTATTGCGAACCCGTTCGGCGCGCTGGCCACGGGGCTGCTGGTGCTCGCCGGGCTGGTGGCCGCTTTCCTGGCGTACCGGTACATTTCCCGCCTCCGCAGCAACCCCATGAAGGCGCTGTACCCGATCACCACGCGCGCGCTCAAGGACGACGCCCGGGGCGCAACCGCCCCGGGCGAGGAAGAGGAGGAGTTTGACGCAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTT。
5.根據權利要求1所述的牛呼吸道疾病綜合征多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒通過以下方法制備:以牛呼吸道合胞體病毒的NP基因為模板，以P3和P4為引物進行PCR擴增，得到長度為600bp的擴增產物，將擴增產物回收并純化后克隆至PMD18-T載體，得到牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒；
P3:5’-TATGCTATGTCCCGATTGG-3’，
P4:5’-ACTGATTTGGCTAGTACACCC-3’ ； 得到的牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒的序列為:
TTACGTGCATTCGATTTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTTATGCTATGTCCCGATTGGGGAGAGAAGATACCCTTAAAATACTCAAAGATGCAGGCTACCAAGTGAGGGCCAATGGGGTTGATGTGATAACACATCGACAGGATGTGAATGGAAAAGAAATGAAATTTGAAGTGCTAACATTAGTCAGCTTAACATCAGAAGTTCAAGGTAATATAGAAATAGAGTCAAGGAAGTCTTACAAAAAGATGCTAAAAGAGATGGGAGAGGTAGCTCCAGAATACAGACATGACTTTCCTGATTGTGGTATGATAGTGCTATGTGTTGCTGCTTTGGTTATAACAAAATTAGCAGCAGGTGATAGGTCAGGCCTCACTGCAGTCATTAGGAGAGCCAACAATGTACTAAGGAATGAAATGAAACGATACAAAGGACTCATCCCGAAAGATATAGCCAACAGCTTCTATGAAGTATTTGAAAAGTACCCTCATTACATAGATGTATTCGTACATTTTGGCATTGCTCAATCCTCAACTAGAGGAGGTAGTAGGGTAGAAGGAATCTTTGCAGGGTTATTCATGAATGCATATGGAGCAGGTCAAGTGATGTTAAGATGGGGTGTGCTAGCCAAATCAGTAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCo
6.根據權利要求1所述的牛呼吸道疾病綜合征多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述牛病毒性腹瀉病毒陽性對照質粒通過以下方法制備:以牛病毒性腹瀉病毒的5’-UTR基因為模板，以？5和P6為引物進行PCR擴增，得到長度為130bp的擴增產物，將擴增產物回收并純化后克隆至PMD18-T載體，得到牛病毒性腹瀉病毒陽性對照質粒；
P5:5，-GGTAGCAACAGTGGTGAGTTC-3，，
P6:5’-CTCAGGTTAAGATGTGCTGTG-3’ ； 得到的牛病毒性腹瀉病毒陽性對照質粒的序列為:TTACGTGCATTCGATTTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGGTAGCAACAGTGGTGAGTTCGT TGGAAGGCTGAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCGACGCTTCGGAGGACAAGCCTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCACAGCACATCTTAACCTGAGAATCGTCGACCTGCAGGCATo
7.根據權利要求1所述的牛呼吸道疾病綜合征多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述牛副流感3型病毒陽性對照質粒通過以下方法制備:以牛副流感3型病毒的NP基因為模板，以？7和P8為引物進行PCR擴增，得到長度為425bp的擴增產物，將擴增產物回收并純化后克隆至PMD18-T載體，得到牛副流感3型病毒陽性對照質粒；
P7:5’-GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT-3’ ，
P8:5’-AACCCCTTCCTCAATCCTGATATAC-3’ ； 得到的牛副流感3型病毒陽性對照質粒的序列為:
ATGCAGTGAATGATTACGATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTTTGGACAACGAAAAGCAACATGCACAACGAGCCGGATTTCTAGTCTCTCTGTTATCAATGGCCTATGCCAACCCAGAATTGTATTTAACATCAAATGGTAGTAATGCAGATGTTAAGTATGTCATCTACATGATAGAGAAAGACCCAGGAAGACAAAAATATGGTGGGTTAGTAGTCAAGACTAGAGAGATGGTTTATGAAAAGACAACCGACTGGATGTTCGGGAGTGATCTTGAGTATGATCAAGATAATATGTTGCAAAATGGTAGAGGCACTTCTACAATTGAGGATCTTGTTCATACTTTTGGGTATCCATCATGTCTTGGAGCTCTAATAATCCAGATTTGGATAATACTTGTCAAGGCTATAACCAGTATATCAGGATTGAGGAAGGGGTTAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGo
8.制備權利要求1所述的牛呼吸道疾病綜合征多重PCR檢測試劑盒的方法，其特征在于，該方法的條件和步驟如下: (I)配制PCR反應液:所述PCR反應液包括MightyAmp DNA聚合酶、2xBuffer Mix緩沖液、無菌雙蒸水和四對特異性引物； 所述四對特異性引物分別為:鑒定牛傳染性鼻氣管炎病毒的引物P1和P2，鑒定牛呼吸道合胞體病毒的引物P3和P4,鑒定牛病毒性腹瀉病毒的引物P5和P6,鑒定牛副流感3型病毒的引物P7和P8:
P1:5’-GCTCGCCAACTTCTTTCAGGG-3’，
P2:5’-GCGTCAAACTCCTCCTCTTCCTC-3’ ，
P3:5’-TATGCTATGTCCCGATTGG-3’，P4:5’-ACTGATTTGGCTAGTACACCC-3’，
P5:5，-GGTAGCAACAGTGGTGAGTTC-3，，
P6:5’-CTCAGGTTAAGATGTGCTGTG-3’，
P7:5’-GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT-3’，
P8:5’-AACCCCTTCCTCAATCCTGATATAC-3’ ； (2)建立四個陽性對照質粒: 所述四個陽性對照質粒分別為:牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性對照質粒、牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒、牛病毒性腹瀉病毒陽性對照質粒和牛副流感3型病毒陽性對照質粒; 所述牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性對照質粒為含有306個堿基的核苷酸片段構成的PMD18-T重組質粒，所述牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒為含有600個堿基的核苷酸片段構成的PMD18-T重組質粒，所述牛病毒性腹瀉病毒陽性對照質粒為含有130個堿基的核苷酸片段構成的PMD18-T重組質粒，所述牛副流感3型病毒陽性對照質粒為含有425個堿基的核苷酸片段構成的PMD18-T重組質粒； 所述含有306個堿基的核苷酸片段構成的pMD18-T重組質粒、含有600個堿基的核苷酸片段構成的PMD18-T重組質粒、含有130個堿基的核苷酸片段構成的pMD18-T重組質粒和含有425個堿基的核苷酸片段構成的PMD18-T重組質粒均能在大腸桿菌DH5 a感受態細胞中增殖； (3)陰性對照:所述陰性對照為蒸餾水。
9.根據權利要求8所述的牛呼吸道疾病綜合征多重PCR檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，所述含有306個堿基的核苷酸片段的序列為:
GCTCGCCAACTTCTTTCAGGGCCTGGGCGCCGTCGGGCAGGCGGTGGGCACGGTGGTGCTGGGCGCCGCGGGTGCCGCGCTCTCGACCGTGTCGGGCATCGCCTCGTTTATTGCGAACCCGTTCGGCGCGCTGGCCACGGGGCTGCTGGTGCTCGCCGGGCTGGTGGCCGCTTTCCTGGCGTACCGGTACATTTCCCGCCTCCGCAGCAACCCCATGAAGGCGCTGTACCCGATCACCACGCGCGCGCTCAAGGACGACGCCCGGGGCGCAACCGCCCCGGGCGAGGAAGAGGAGGAGTTTGACGC ； 所述含有600個堿基的核苷酸片段的序列為:
TATGCTATGTCCCGATTGGGGAGAGAAGATACCCTTAAAATACTCAAAGATGCAGGCTACCAAGTGAGGGCCAATGGGGTTGATGTGATAACACATCGACAGGATGTGAATGGAAAAGAAATGAAATTTGAAGTGCTAACATTAGTCAGCTTAACATCAGAAGTTCAAGGTAATATAGAAATAGAGTCAAGGAAGTCTTACAAAAAGATGCTAAAAGAGATGGGAGAGGTAGCTCCAGAATACAGACATGACTTTCCTGATTGTGGTATGATAGTGCTATGTGTTGCTGCTTTGGTTATAACAAAATTAGCAGCAGGTGATAGGTCAGGCCTCACTGCAGTCATTAGGAGAGCCAACAATGTACTAAGGAATGAAATGAAACGATACAAAGGACTCATCCCGAAAGATATAGCCAACAGCTTCTATGAAGTATTTGAAAAGTACCCTCATTACATAGATGTATTCGTACATTTTGGCATTGCTCAATCCTCAACTAGAGGAGGTAGTAGGGTAGAAGGAATCTTTGCAGGGTTATTCATGAATGCATATGGAGCAGGTCAAGTGATGTTAAGATGGGGTGTGCTAGCCAAATCAGT ； 所述含有130個堿基的核苷酸片段的序列為:
GGTAGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGAAGGCTGAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCGACGCTTCGGAGGACAAGCCTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCACAGCACATCTTAACCTGAG ； 所述含有425個堿基的核苷酸片段的序列為:GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTTTGGACAACGAAAAGCAACATGCACAACGAGCCGGATTTCTAGTCTCTCTGTTATCAATGGCCTATGCCAACCCAGAATTGTATTTAACATCAAATGGTAGTAATGCAGATGTTAAGTATGTCATCTACATGATAGAGAAAGACCCAGGAAGACAAAAATATGGTGGGTTAGTAGTCAAGACTAGAGAGATGGTTTATGAAAAGACAACCGACTGGATGTTCGGGAGTGATCTTGAGTATGATCAAGATAATATGTTGCAAAATGGTAGAGGCACTTCTACAATTGAGGATCTTGTTCATACTTTTGGGTATCCATCATGTCTTGGAGCTCTAATAATCCAGATTTGGATAATACTTGTCAAGGCTATAAC CAGTATATCAGGATTGAGGAAGGGGTT。
10.根據權利要求8所述的牛呼吸道疾病綜合征多重PCR檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，所述牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒通過以下方法制備:以牛呼吸道合胞體病毒的NP基因為模板，以P3和P4為引物進行PCR擴增，得到長度為600bp的擴增產物，將擴增產物回收并純化后克隆至PMD18-T載體，得到牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒；
P3:5’-TATGCTATGTCCCGATTGG-3’，
P4:5’-ACTGATTTGGCTAGTACACCC-3’ ； 得到的牛呼吸道合胞體病毒陽性對照質粒的序列為:
TTACGTGCATTCGATTTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTTATGCTATGTCCCGATTGGGGAGAGAAGATACCCTTAAAATACTCAAAGATGCAGGCTACCAAGTGAGGGCCAATGGGGTTGATGTGATAACACATCGACAGGATGTGAATGGAAAAGAAATGAAATTTGAAGTGCTAACATTAGTCAGCTTAACATCAGAAGTTCAAGGTAATATAGAAATAGAGTCAAGGAAGTCTTACAAAAAGATGCTAAAAGAGATGGGAGAGGTAGCTCCAGAATACAGACATGACTTTCCTGATTGTGGTATGATAGTGCTATGTGTTGCTGCTTTGGTTATAACAAAATTAGCAGCAGGTGATAGGTCAGGCCTCACTGCAGTCATTAGGAGAGCCAACAATGTACTAAGGAATGAAATGAAACGATACAAAGGACTCATCCCGAAAGATATAGCCAACAGCTTCTATGAAGTATTTGAAAAGTACCCTCATTACATAGATGTATTCGTACATTTTGGCATTGCTCAATCCTCAACTAGAGGAGGTAGTAGGGTAGAAGGAATCTTTGCAGGGTTATTCATGAATGCATATGGAGCAGGTCAAGTGATGTTAAGATGGGGTGTGCTAGCCAAATCAGTAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGC ； 所述牛病毒性腹瀉病毒陽性對照質粒通過以下方法制備:以牛病毒性腹瀉病毒的5’ -UTR基因為模板，以P5和P6為引物進行PCR擴增，得到長度為130bp的擴增產物，將擴增產物回收并純化后克隆至PMD18-T載體，得到牛病毒性腹瀉病毒陽性對照質粒；
P5:5，-GGTAGCAACAGTGGTGAGTTC-3，，
P6:5’-CTCAGGTTAAGATGTGCTGTG-3’ ； 得到的牛病毒性腹瀉病毒陽性對照質粒的序列為:
TTACGTGCATTCGATTTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGGTAGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGAAGGCTGAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCGACGCTTCGGAGGACAAGCCTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCACAGCACATCTTAACCTGAGAATCGTCGACCTGCAGGCAT ； 所述牛副流感3型病毒陽性對照質粒通過以下方法制備:以牛副流感3型病毒的NP基因為模板，以NP1和NP2為引物進行PCR擴增，得到長度為425bp的擴增產物，將擴增產物回收并純化后克隆至PMD18-T載體，得到牛副流感3型病毒陽性對照質粒；
P7:5’-GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT-3’ ，`
P8:5’-AACCCCTTCCTCAATCCTGATATAC-3’ ； 得到的牛副流感3型病毒陽性對照質粒的序列為:
ATGCAGTGAATGATTACGATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTTTGGACAACGAAAAGCAACATGCACAACGAGCCGGATTTCTAGTCTCTCTGTTATCAATGGCCTATGCCAAC
【文檔編號】C12Q1/70GK103498009SQ201310470178
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月10日 優先權日:2013年10月10日
【發明者】郭利, 王煒, 楊艷玲, 武華, 張淑琴, 李光玉, 陳立志, 程世鵬, 楊福合, 李春義, 溫永俊, 王鳳雪, 孫娜, 王建科, 易立 申請人:中國農業科學院特產研究所, 華威特（北京）生物科技有限公司