藥品微生物檢驗雙濾膜過濾方法
【專利摘要】本發明涉及一種藥品微生物檢驗雙濾膜過濾方法，采用兩層過濾膜，第一層濾膜的孔徑可以為5μm～10μm、10μm～20μm、20μm～30μm和30μm～50μm四類，用于截流大分子基質、顆粒、纖維和藥物殘渣等不溶性物質；第二層濾膜孔徑不大于0.45μm，用于截留微生物。本發明方法可以有效防止濾膜堵塞，利于消除供試品抑菌活性，避免供試品中污染微生物受到損傷。對現行方法不能實現有效檢驗的藥物，可采用本發明方法進行檢驗，經大量試驗數據證明，本方法簡便可行，結果有效。
【專利說明】藥品微生物檢驗雙濾膜過濾方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及藥品微生物檢驗領域，具體涉及一種藥品微生物檢驗雙濾膜過濾方法。
【背景技術】
[0002]微生物污染是造成藥品不良事件的主要原因之一，杜絕受污染的藥品流入市場，對于保障患者的生命安全意義重大。在藥品微生物檢驗環節，能否檢測出微觀世界中的微生物，檢驗方法至關重要。薄膜過濾技術是藥品微生物檢驗領域，用于附集微生物的一種重要技術。對于有抗菌活性的藥物，需要采用薄膜過濾方法，充分消除藥物的抗菌活性，以利于藥品中休眠或損傷狀態的微生物復蘇、繁殖和檢出。但目前該技術存在一定缺陷:某些藥物供試液中含有卡波姆、纖維素衍生物、膠體硅、鈣皂和不溶性藥物殘渣等，試驗過程中經常會堵塞濾膜(國家標準中規定濾膜孔徑不大于0.45 μ m)，導致試驗無法繼續。
[0003]目前，對于該類藥物并無十分有效的微生物檢驗方法。在醫藥工業發達的國家，對于該類樣品多施行生產過程控制。在我國，由于國情所限現階段還無法效仿，現行國家標準仍以最終檢測結果作為產品是否合格的依據。但是，由于方法存在缺陷，導致部分受到微生物污染，特別是低水平污染的藥品檢測結果合格，流入臨床，給患者的身體健康甚至是生命安全造成嚴重威脅。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種藥品微生物檢驗雙濾膜過濾方法，采用兩層過濾膜，第一層濾膜用于截流大分子基質、顆粒、纖維和藥物殘渣等不溶性物質，第二層濾膜用于截留微生物，可以有效防止濾膜堵塞，利于消除供試品的抑菌活性，避免供試品中污染微生物受到損傷。
[0005]本發明解決其技術問題所采用的技術方案是:藥品微生物檢驗雙濾膜過濾方法，包括以下步驟:
[0006]I)按常規步驟取規定量的供試品制備成供試液，將供試液通過第一層濾膜過濾，截留大分子基質、顆粒、纖維和藥物殘渣等不溶性物質，供試液繼續通過第二層濾膜，截留供試液中潛在的微生物；
[0007]2)用沖洗液對第一層和第二層濾膜進行沖洗，沖洗液通過濾膜方式與供試液相同，沖洗液將第一層濾膜上可能附著的微生物洗脫至第二層濾膜，同時洗脫兩層濾膜上附著的具有抗菌活性的物質；
[0008]3)根據檢驗目的，將第一層和第二層濾膜分別接入相應的培養基中，進行培養；
[0009]4)根據培養結果，按照現行中國藥典或其他國家標準要求，進行結果判斷。
[0010]具體地，檢驗過程中，供試液將通過第一層和第二層，共兩層過濾膜。
[0011]具體地，根據檢驗目的的需要或供試液特性，在步驟2)之后單獨增加對第二層濾膜沖洗液的沖洗量，以充分消除第二層濾膜上抗菌活性物質的存在。[0012]具體地,所述第一層濾膜按孔徑大小分為四種:5 μ m~10 μ m、10 μ m~20 μ m、20 μ m ~30 μ m 和 30 μ m ~50 μ m。
[0013]具體地，所述第一層濾膜為上述四種中的一種。
[0014]具體地，所述第一層濾膜可選擇兩種或兩種以上不同孔徑的濾膜疊加使用。
[0015]具體地，所述第二層濾膜按照國家標準要求孔徑不大于0.45 μ m。
[0016]本發明具有以下有益效果:本發明的藥品微生物檢驗雙濾膜過濾方法，采用兩層過濾膜，根據濾膜不同孔徑和材質，分別截流大分子基質、顆粒、纖維和藥物殘渣等不溶性物質或微生物，防止濾膜堵塞，利于消除供試品的抑菌活性，避免供試品中污染微生物受到損傷。對現行方法不能實現有效檢驗的藥物，可采用本發明方法進行檢驗，經大量試驗數據證明，本方法簡便可行，結果有效。
【具體實施方式】
[0017]以下是本發明的具體實施例，對本發明的技術方案做進一步作描述，但是本發明的保護范圍并不限于這些實施例。凡是不背離本發明構思的改變或等同替代均包括在本發明的保護范圍之內。
[0018]藥品微生物檢驗雙濾膜過濾方法，包括以下步驟:
[0019]I)按常規步驟取規定量的供試品制備成供試液，將供試液通過第一層濾膜過濾，截留大分子基質、顆粒、纖維和藥物殘渣等不溶性物質，供試液繼續通過第二層濾膜，截留供試液中潛在的微生物；
[0020]2)用沖洗液對第一層和第二層濾膜進行沖洗，沖洗液通過濾膜方式與供試液相同，沖洗液將第一層濾膜上可能附著的微生物洗脫至第二層濾膜，同時洗脫兩層濾膜上附著的具有抗菌活性的物質；
[0021]3)根據檢驗目的，將第一層和第二層濾膜分別接入相應的培養基中，進行培養；
[0022]4)根據培養結果，按照現行中國藥典或其他國家標準要求，進行結果判斷。
[0023]具體地，檢驗過程中，供試液將通過第一層和第二層，共兩層過濾膜。
[0024]具體地，根據檢驗目的的需要或供試液特性，在步驟2)之后單獨增加對第二層濾膜沖洗液的沖洗量，以充分消除第二層濾膜上抗菌活性物質的存在。
[0025]具體地,所述第一層濾膜按孔徑大小分為四種:5 μ m~10 μ m、10 μ m~20 μ m、20 μ m ~ 30 μ m 和 30 μ m ~50 μ m。
[0026]具體地，所述第一層濾膜為上述四種中的一種。
[0027]具體地，所述第一層濾膜可選擇兩種或兩種以上不同孔徑的濾膜疊加使用。
[0028]具體地，所述第二層濾膜按照國家標準要求孔徑不大于0.45 μ m。
[0029]實施例1
[0030]以更昔洛韋眼用凝膠無菌檢查試驗為例。
[0031]1.培養基與 試劑:硫乙醇酸鹽流體培養基、改良馬丁培養基、營養肉湯培養基、營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、0.1%蛋白胨緩沖液、無水氯化鈣。
[0032]2.試驗用樣品:更昔洛韋眼用凝膠。
[0033]3.實驗菌種:枯草芽孢桿菌[CMCC(B) 63501]、大腸埃希菌[CMCC(B) 44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B) 26003];生孢梭菌[CMCC(B) 64941]、白色念珠菌[CMCC (F) 98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]均由中國食品藥品鑒定研究院提供。
[0034]4.菌液制備:大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌采用營養肉湯培養基，生孢梭菌采用硫乙醇酸鹽流體培養基，30~35°C培養18~24小時；白色念珠菌采用改良馬丁培養基，20~25°C培養24~48小時；黑曲霉采用沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養基，20~25°C培養5~7天。按藥典規定制備上述試驗菌懸液,使最終稀釋濃度均小于IOOcfu
[0035]5.無菌檢查試驗
[0036]中國藥典要求無菌檢查應用的濾膜孔徑應不大于0.45 μ m,而卡波姆凝膠無法通過該孔徑濾膜，因此，不能采用供試品稀釋后直接過濾的方法。某些二價粒子、強親水性電解質等會使卡波姆凝膠發生絮凝，因此，可考慮先將卡波姆凝膠沉淀，分離，再進行檢驗。使卡波姆凝膠沉淀的介質不會對供試品中微生物造成損傷，綜合考慮各種影響因素，選擇氯化鈣進行試驗。
[0037]供試液的制備:取供試品15支，用50mL0.1%無菌蛋白胨緩沖液稀釋，然后加入10 %無菌氯化鈣溶液溶解，邊加邊振搖，此時二價離子和羧酸根結合形成不溶性鹽，逐漸產生大量絮狀沉淀，至沉淀量不再增加，使用氯化鈣溶液約80mL。
[0038]取上述供試液過濾，供試液首先通過第一層濾膜(孔徑20 μ m~30 μ m)，絮狀沉淀被截留；然后供試液通過第二層濾膜(孔徑應不大于0.45 μ m)，供試液中的微生物被截留。采用沖洗液，按照供試液通過方式對兩層濾膜進行沖洗，總沖洗量為500ml。分別將100ml硫乙醇酸鹽流體培養基及改良馬丁培養基加入相應的濾筒內。
[0039]結果判斷:應首先滿足中國藥典結果判斷原則。經培養后，如果培養液整體澄清或第一層、第二層濾膜之間的培養液澄清(第一層濾膜以上的培養液渾濁為顆粒物、沉淀物等造成，如確有可疑，應進行轉接試驗)，則判供試品符合規定；如果培養液整體渾濁，則判供試品不符合規定。培養結果見表1。
[0040]表1無菌檢查方法驗證結果
[0041]
【權利要求】
1.藥品微生物檢驗雙濾膜過濾方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)按常規步驟取規定量的供試品制備成供試液，將供試液通過第一層濾膜過濾，截留大分子基質、顆粒、纖維和藥物殘渣等不溶性物質，供試液繼續通過第二層濾膜，截留供試液中潛在的微生物； 2)用沖洗液對第一層和第二層濾膜進行沖洗，沖洗液通過濾膜方式與供試液相同，沖洗液將第一層濾膜上可能附著的微生物洗脫至第二層濾膜，同時洗脫兩層濾膜上附著的具有抗菌活性的物質； 3)根據檢驗目的，將第一層和第二層濾膜分別接入相應的培養基中，進行培養； 4)根據培養結果，按照現行中國藥典或其他國家標準要求，進行結果判斷。
2.根據權利要求1所述的藥品微生物檢驗雙濾膜過濾方法，其特征在于，供試液將通過第一層和第二層，共兩層過濾膜。
3.根據權利要求1所述的藥品微生物檢驗雙濾膜過濾方法，其特征在于，根據檢驗目的的需要或供試液特性，在步驟2)之后，單獨增加對第二層濾膜沖洗液的沖洗量，以充分消除第二層濾膜上抗菌活性物質的存在。
4.根據權利要求1所述的藥品微生物檢驗雙濾膜過濾方法，其特征在于，所述第一層濾膜按孔徑大小分為四種:5 μ m~10 μ m、10 μ m~20 μ m、20 μ m~30 μ m和30 μ m~50 μ m0
5.根據權利要求4所述的藥品微生物檢驗雙濾膜過濾方法，其特征在于，所述第一層濾膜為上述四種中的一種。
6.根據權利要求4所述的藥品微生物檢驗雙濾膜過濾方法，其特征在于，所述第一層濾膜可選擇兩種或兩種以上不同孔徑的濾膜疊加使用。
7.根據權利要求1所述的藥品微生物檢驗雙濾膜過濾方法，其特征在于，所述第二層濾膜按照國家標準要求孔徑不大于0.45 μ m。
【文檔編號】C12Q1/04GK103555810SQ201310492956
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月21日 優先權日:2013年10月21日
【發明者】丁勃, 王志宏, 劉艷, 徐曉潔, 冷佳蔚, 胡文宏, 國明 申請人:山東省食品藥品檢驗所