一種鷹嘴豆抑菌肽的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，包括：步驟1，將鷹嘴豆蛋白粉與水混合制成3～8重量%的懸浮液；步驟2，調整鷹嘴豆蛋白粉懸浮液的pH值為6.0～7.5，按每克鷹嘴豆蛋白粉加入3000-4000U復合酶形成酶解體系；步驟3，酶解體系在45～50℃的溫度條件下反應1.0～1.5h，反應結束后立即將酶解體系溫度升高至≥95℃滅酶10～15min，獲得酶解產物；步驟4，對酶解產物離心分離，用超濾膜對上清液進行肽段截留，獲得分子量在2kDa-6kDa之間的肽段體系；對肽段體系進行噴霧干燥得到鷹嘴豆抑菌肽。本發明的有益效果在于：生產成本較低、工藝操作簡單，同時可使酶解產物中抑菌肽段產量提高。
【專利說明】一種鷹嘴豆抑菌肽的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物蛋白提取【技術領域】，特別是涉及一種鷹嘴豆抑菌肽的制備方法。【背景技術】
[0002]隨著廣大消費者對食品傳統防腐劑抑菌效力、呈味特征及安全性的普遍認識，安全性與穩定性高、抑菌性與溶解性強并且抑菌范圍廣的天然防腐劑的發掘與開發引起了廣大學者的廣泛關注，尤其是抑菌肽類防腐劑。將鷹嘴豆蛋白粉作為營養滋補及藥物配伍資源，已得到了廣大消費者尤其是新疆少數民族居民的認可，以安全性普遍認知的鷹嘴豆蛋白作為肽源進行抑菌肽開發，可為鷹嘴豆蛋白副產物的應用及精深加工提供基礎依據，輔助于防腐類食品添加劑市場開拓與品質升級。作為純天然食品配料的植物蛋白，其水解液富含多種氨基酸和肽，可為食品帶來不同的功能特征。
[0003]目前應用于食品保鮮領域的抑菌肽主要以乳酸鏈球菌素為主，日本、韓國將多聚賴氨酸作為食品添加劑用于食品貯藏保鮮。基于天然防腐劑抑菌的廣譜性能考慮，多種抑菌肽的開發與應用已得到廣大學者的普遍關注，采用化學合成及基因工程的方法實施抑菌肽的制備最為常見，然而由于化學合成高成本低效率、基因工程表達系統不確定等問題的存在，限制了食品添 加劑類抑菌肽在食品加工中的應用。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提出一種鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，以克服現有抑菌肽制備方法的不足，提高抑菌肽段的富集效果。
[0005]為了解決上述技術問題，本發明采用了如下技術方案:一種鷹嘴豆(Cicerarietinum Linn.)抑菌肽的制備方法,包括以下步驟:
[0006]步驟I，將過50~65目篩的鷹嘴豆蛋白粉與水混合制成3~8重量％的鷹嘴豆蛋白粉懸浮液，于35 °C下靜置浸泡20~40min ；
[0007]步驟2，調整鷹嘴豆蛋白粉懸浮液的pH值為6.0~7.5，按每克鷹嘴豆蛋白粉加入3000-4000U復合酶形成酶解體系，所述復合酶為胰蛋白酶與風味蛋白酶復合按重量比1:1~3混合形成的復合酶；
[0008]步驟3，所述酶解體系在45~50°C的溫度條件下密閉反應1.0~1.5h，反應結束后立即將酶解體系溫度升高至> 95°C滅酶10~15min，獲得酶解產物；
[0009]步驟4，對所述酶解產物離心分離10~15min獲得上清液和未水解蛋白沉淀，用截留量分別為6kDa和2kDa的超濾膜對上清液進行不同分子量肽段截留，獲得分子量在2kDa-6kDa之間的肽段體系；對肽段體系進行噴霧干燥得到鷹嘴豆抑菌肽。
[0010]如上所述的鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，進一步，步驟2，調整鷹嘴豆蛋白粉懸浮液的pH值為6.3~7.0。
[0011]如上所述的鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，進一步，按每克鷹嘴豆蛋白加入粉3500-3800U復合酶形成酶解體系。[0012]如上所述的鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，進一步，所述復合酶為胰蛋白酶與風味蛋白酶復合按重量比1:2混合形成的復合酶。
[0013]如上所述的鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，進一步，步驟3，所述酶解體系在45~50°C的溫度條件下密閉反應1.2h。
[0014]如上所述的鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，進一步，反應結束后立即將酶解體系溫度升高至95°C滅酶12min，獲得酶解產物。
[0015]如上所述的鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，進一步，步驟4，對所述酶解產物離心分離的離心速度為1900~2200r/min。
[0016]與現有技術相比，本發明的有益效果在于:
[0017]通過本發明方法制備抑菌肽，生產成本較低、工藝操作簡單、設備及人力投資小、重復性好，減少了水資源的浪費與污染，同時可使酶解產物中抑菌肽段產量提高。通過本發明制得的抑菌肽不僅具有較為顯著的抑菌效果而且安全營養，為天然保鮮劑的開發提供可靠的基料或配料，可以提高我國防腐劑產品的重量和安全性，適應天然食品添加劑市場發展的要求。此外，通過本發明方法制備的抑菌肽分子量分布集中，抑菌活性較強，食用安全性高。
【具體實施方式】
[0018]下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細描述，但不作為對本發明的限定。
[0019]實施例1 [0020]將過60目篩的鷹嘴豆脫脂蛋白粉50g與950g水混合制成蛋白粉懸浮液，35°C下靜置浸泡30min ;攪拌調整混合溶液的pH值為7.2，每克鷹嘴豆蛋白粉加入復合酶3500U(為胰蛋白酶與風味蛋白酶復合重量比為1:2的復合酶)，在50°C的溫度條件下密閉反應1.5h，反應結束后立即將酶解體系溫度升高至95°C滅酶15min終止反應；在2000r/min的條件下離心分離，獲得上清液并棄除未水解蛋白沉淀，用截留量分別為6kDa和2kDa的超濾膜對上清液進行不同分子量肽段截留，獲得分子量在2kDa_6kDa之間的肽段體系；對肽段體系進行噴霧干燥得到鷹嘴豆抑菌肽15.lg。
[0021]實施例2
[0022]將過60目篩的鷹嘴豆脫脂蛋白粉50g與950g水混合制成蛋白粉懸浮液，35°C下靜置浸泡30min ;攪拌調整混合溶液的pH值為6.5，每克鷹嘴豆蛋白粉加入復合酶3500U(為胰蛋白酶與風味蛋白酶復合重量比為1:2的復合酶)，每克鷹嘴豆蛋白粉加入復合酶4000U(為胰蛋白酶與風味蛋白酶復合重量比為1:2的復合酶)，在45°C的溫度條件下密閉反應
1.0h，反應結束后立即將酶解體系溫度升高至95°C滅酶IOmin終止反應；在2000r/min的條件下離心分離，獲得上清液并棄除未水解蛋白沉淀，用截留量分別為6kDa和2kDa的超濾膜對上清液進行不同分子量肽段截留，獲得分子量在2kDa_6kDa之間的肽段體系；對肽段體系進行噴霧干燥得到鷹嘴豆抑菌肽13.3g。
[0023]實施例3
[0024]將過60目篩的鷹嘴豆脫脂蛋白粉50g與950g水混合制成蛋白粉懸浮液，35°C下靜置浸泡30min ;攪拌調整混合溶液的pH值為7.5，每克鷹嘴豆蛋白粉加入復合酶4000U(為胰蛋白酶與風味蛋白酶復合重量比為1:2的復合酶)，在48°C的溫度條件下密閉反應1.5h，反應結束后立即將酶解體系溫度升高至95°C滅酶IOmin終止反應；在2000r/min的條件下離心分離，獲得上清液并棄除未水解蛋白沉淀，用截留量分別為6kDa和2kDa的超濾膜對上清液進行不同分子量肽段截留，獲得分子量在2kDa_6kDa之間的肽段體系；對肽段體系進行噴霧干燥得到鷹嘴豆抑菌肽17.6g。
[0025]實施例4
[0026]將過60目篩的鷹嘴豆脫脂蛋白粉50g與950g水混合制成蛋白粉懸浮液，35°C下靜置浸泡30min ;攪拌調整混合溶液的pH值為8.0，每克鷹嘴豆蛋白粉加入復合酶3800U(為胰蛋白酶與風味蛋白酶復合重量比為1:2的復合酶)，在50°C的溫度條件下密閉反應1.0h,反應結束后立即將酶解體系溫度升高至95°C滅酶IOmin終止反應；在2000r/min的條件下離心分離，獲得上清液并棄除未水解蛋白沉淀，用截留量分別為6kDa和2kDa的超濾膜對上清液進行不同分子量肽段截留，獲得分子量在2kDa_6kDa之間的肽段體系；對肽段體系進行噴霧干燥得到鷹嘴豆抑菌肽5.2g。
[0027]實施例5
[0028]將過60目篩的鷹嘴豆脫脂蛋白粉50g與950g水混合制成蛋白粉懸浮液，35°C下靜置浸泡30min ;攪拌調整混合溶液的pH值為5.5，每克鷹嘴豆蛋白粉加入復合酶4000U(為胰蛋白酶與風味蛋白酶復合重量比為1:2的復合酶)，在45°C的溫度條件下密閉反應1.5h，反應結束后立即將酶解體 系溫度升高至95°C滅酶IOmin終止反應；在2000r/min的條件下離心分離，獲得上清液并棄除未水解蛋白沉淀，用截留量分別為6kDa和2kDa的超濾膜對上清液進行不同分子量肽段截留，獲得分子量在2kDa_6kDa之間的肽段體系；對肽段體系進行噴霧干燥得到鷹嘴豆抑菌肽1.3g。
[0029]實施例6
[0030]將過60目篩的鷹嘴豆脫脂蛋白粉50g與950g水混合制成蛋白粉懸浮液，35°C下靜置浸泡30min ;攪拌調整混合溶液的pH值為7.0，每克鷹嘴豆蛋白粉加入復合酶4500U(為胰蛋白酶與風味蛋白酶復合重量比為2:1的復合酶)，在50°C的溫度條件下密閉反應1.0h,反應結束后立即將酶解體系溫度升高至95°C滅酶IOmin終止反應；在2000r/min的條件下離心分離，獲得上清液并棄除未水解蛋白沉淀，用截留量分別為6kDa和2kDa的超濾膜對上清液進行不同分子量肽段截留，獲得分子量在2kDa_6kDa之間的肽段體系；對肽段體系進行噴霧干燥得到鷹嘴豆抑菌肽4.lg。
[0031]實施例7
[0032]將過60目篩的鷹嘴豆脫脂蛋白粉50g與950g水混合制成蛋白粉懸浮液，35°C下靜置浸泡30min ;攪拌調整混合溶液的pH值為7.0，每克鷹嘴豆蛋白粉加入復合酶5300U(為胰蛋白酶與風味蛋白酶復合重量比為1:3的復合酶)，在48°C的溫度條件下密閉反應2.0h,反應結束后立即將酶解體系溫度升高至95°C滅酶IOmin終止反應；在2000r/min的條件下離心分離，獲得上清液并棄除未水解蛋白沉淀，用截留量分別為6kDa和2kDa的超濾膜對上清液進行不同分子量肽段截留，獲得分子量在2kDa_6kDa之間的肽段體系；對肽段體系進行噴霧干燥得到鷹嘴豆抑菌肽7.4g。
[0033]實施例8
[0034]將過60目篩的鷹嘴豆脫脂蛋白粉50g與850g水混合制成蛋白粉懸浮液，35°C下靜置浸泡30min ;攪拌調整混合溶液的pH值為7.5，每克鷹嘴豆蛋白粉加入復合酶3800U(為胰蛋白酶與風味蛋白酶復合重量比為1:3的復合酶)，在50°C的溫度條件下密閉反應2.0h,反應結束后立即將酶解體系溫度升高至95°C滅酶IOmin終止反應；在2000r/min的條件下離心分離，獲得上清液并棄除未水解蛋白沉淀，用截留量分別為6kDa和2kDa的超濾膜對上清液進行不同分子量肽段截留，獲得分子量在2kDa_6kDa之間的肽段體系；對肽段體系進行噴霧干燥得到鷹嘴豆抑菌肽3.Sg。
[0035]實施例9
[0036]將過60目篩的鷹嘴豆脫脂蛋白粉60g與1000g水混合制成蛋白粉懸浮液，35°C下靜置浸泡30min ;攪拌調整混合溶液的pH值為8.5，每克鷹嘴豆蛋白粉加入復合酶4500U(為胰蛋白酶與風味蛋白酶復合重量比為1:2的復合酶)，在55°C的溫度條件下密閉反應2.0h,反應結束后立即將酶解體系溫度升高至95°C滅酶IOmin終止反應；在2000r/min的條件下離心分離，獲得上清液并棄除未水解蛋白沉淀，用截留量分別為6kDa和2kDa的超濾膜對上清液進行不同分子量肽段截留，獲得分子量在2kDa_6kDa之間的肽段體系；對肽段體系進行噴霧干燥得到鷹嘴豆抑菌肽5.7g。
[0037]效果例
[0038]實驗過程如下:將實施例1-9中制得的鷹嘴豆抑菌肽用蒸餾水溶解，分別配制成0mg/mL、0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、lmg/mL、2mg/mL 的系列濃度樣品溶液。將各樣品溶液100 μ L、Luria-Be rtani培養基30 μ L和濃度為5Χ 103CFU/mL菌液70 μ L (菌液分別為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌或幽門螺桿菌中的一種)分別加入到培養皿中，在振蕩器充分混勻，每次處理重復3次，然后在37°C恒溫條件下培養18h。以抑菌肽濃度為橫坐標，相對抑制率為縱坐標，利用Origins.0軟件制作直線回歸方程計算半抑制濃度(IC5tl)。
[0039]實驗結果:抑菌肽均可有效抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及幽門螺桿菌，對金黃色葡萄球菌的半抑制濃度(IC5tl)為290 μ g/mL、對大腸桿菌的半抑制濃度(IC5tl)為680 μ g/mL、對幽門螺桿菌的半抑制濃度(IC5tl)為710 μ g/mL。
[0040]對上述實施例所得的不同條件下的2kDa_6kDa肽段產率對照分析，可充分論證采用此種酶水解法制備鷹嘴豆特定分子量分布的抑菌肽的科學性、簡捷性及可行性，為天然保鮮劑的開發提供可靠的基料或配料，可以提高我國防腐劑產品的重量和安全性，適應天然食品添加劑市場發展的要求。
[0041]以上實施例僅為本發明的示例性實施例，不用于限制本發明，本發明的保護范圍由權利要求書限定。本領域技術人員可以在本發明的實質和保護范圍內，對本發明做出各種修改或等同替換，這種修改或等同替換也應視為落在本發明的保護范圍內。
【權利要求】
1.一種鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，包括以下步驟: 步驟1，將過50~65目篩的鷹嘴豆蛋白粉與水混合制成3~8重量％的鷹嘴豆蛋白粉懸浮液，靜置浸泡20~40min ； 步驟2，調整鷹嘴豆蛋白粉懸浮液的pH值為6.0~7.5，按每克鷹嘴豆蛋白粉加入3000-4000U復合酶形成酶解體系，所述復合酶為胰蛋白酶與風味蛋白酶復合按重量比1:1~3混合形成的復合酶； 步驟3，所述酶解體系在45~50°C的溫度條件下密閉反應1.0~1.5h，反應結束后立即將酶解體系溫度升高至> 95°C滅酶10~15min，獲得酶解產物； 步驟4，對所述酶解產物離心分離10~15min獲得上清液和未水解蛋白沉淀，用截留量分別為6kDa和2kDa的超濾膜對上清液進行不同分子量肽段截留，獲得分子量在2kDa_6kDa之間的肽段體系；對肽段體系進行噴霧干燥得到鷹嘴豆抑菌肽。
2.根據權利要求1所述的鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，其特征在于，步驟2，調整鷹嘴豆蛋白粉懸浮液的pH值為6.3~7.0。
3.根據權利要求1所述的鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，其特征在于，按每克鷹嘴豆蛋白粉加入3500-3800U復合酶形成酶解體系。
4.根據權利要求1所述的鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，其特征在于，所述復合酶為胰蛋白酶與風味蛋白酶復合按重量比1:2混合形成的復合酶。
5.根據權利要求1所述的鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，其特征在于，步驟3，所述酶解體系在45~50°C的溫度條件下密閉反應1.2h。
6.根據權利要求1所述的鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，其特征在于，反應結束后立即將酶解體系溫度升高至95°C滅酶12min，獲得酶解產物。
7.根據權利要求1所述的鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，其特征在于，步驟4，對所述酶解產物離心分離的離心速度為1900~2200r/min。
【文檔編號】C12P21/06GK103525891SQ201310515764
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月28日 優先權日:2013年10月28日
【發明者】田洪磊, 詹萍, 程衛東, 朱新榮, 顏海燕 申請人:石河子大學