一株能降解海水柴油污染物的基因工程細菌Y8-alkB2的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一株能降解海水柴油污染物的基因工程菌的制備、鑒定及其降解能力的測定。本發明利用現代生物工程技術，采用合成alkB2基因；并選擇柴油降解率低的海洋土著菌Y8，構建了Y8-alkB2基因工程菌。經過鑒定，確定Y8屬于克雷伯氏菌屬；Y8-alkB2含有alkB2轉基因片段，能表達ALKB蛋白。對該基因工程菌的降解率的測定和降解條件的分析，顯示該基因工程菌株能有效提高土著菌Y8的柴油降解效率，穩定、高效地對柴油污染物進行降解，有望應用于海水柴油污染的治理。
【專利說明】—株能降解海水柴油污染物的基因工程細菌Y8-alkB2
1【技術領域】
[0001]本發明涉及一株能降解海水柴油污染物的基因工程菌的制備、鑒定及其降解能力的測定。
2【背景技術】
[0002]微生物降解是去除環境中石油污染物的主要途徑。生物修復是指利用生物特別是微生物來催化降解環境污染物，減小或最終消除環境污染的受控或自發過程，是在微生物降解基礎上發展起來的新興的環保技術。
[0003]土著微生物降解污染物的潛力巨大，但馴化時間長、生長速度慢、代謝活性低，因而轉入外源高效污染物降解基因，能夠提高生物修復效率。近年來，構建高效的基因工程菌以顯著提高污染物的降解效率成為油類污染治理的一個熱點，它為解決生物修復周期長等問題提供了嶄新的途徑。國外學者Charkrabany經過研究發現能降解芳烴、萜烴、多環芳烴的細菌的降解基因位于質粒上，他根據質粒容易傳遞的特性將能夠降解脂(含質粒A)的一種假單胞菌作為受體細胞，分別將能夠降解芳烴(含質粒B)、萜烴(含質粒C)、多環芳烴(含質粒D)的質粒，用遺傳工程的方法人工轉入受體細胞，獲得多質粒的“超級細菌”，這一新型菌能同時降解四種石油組分，能把原油中約2 / 3的烴類消耗。它的突出優點是比自然菌降解速度快。所以，本研究著重選取恰當的基因，構建基因工程菌，以期解決土著菌降解效率低的難題。
[0004]烷烴降解菌的降解酶基因以烷烴末端但加氧酶AlkB相關的烷烴羥化酶為目前的研究熱點。烷烴進入細菌后，先被細胞膜上的AlkB蛋白進行末端羥基化，然后在乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的作用下進一步氧化，最后加上乙酰輔酶A，進入β氧化循環，分解成二氧化碳和水，AlkB酶是烷烴降解的限速酶。
[0005] 某些微生物能以烷烴為碳源已被公認，但大多數生化和遺傳研究主要還是集中在有限的幾個原型系統，Alcanivorax borkumensis燒烴輕化酶系統是其中之一，Alcanivorax borkumensis是海洋微生物中一種獨特的、以燒烴為主要的特異性底物生長的桿狀Y-蛋白菌。該菌遍布全球眾多海域，包括太平洋、地中海、日本海、中國沿海和北極。在沒有污染的海洋中，該菌數量很少，但在石油污染的開發海域或海岸，該菌可快速生長成為污染水域中的優勢菌群，在石油降解菌群中，該菌所占比例為80-90%。近期研究報道證明A.borkumensis在石油污染生物修復中發揮關鍵作用。2006年，NatureB1technology報道了 A.borku-mensis SK2的基因組全長序列及其功能分析結果,發現該菌基因組中含有多個編碼烴類物質分解代謝酶系統的基因簇，如alkSBlGJH基因簇，gntR和alkB2，p450等。這些基因編碼的蛋白在η-烷烴轉變成脂肪酸的過程中發揮重要作用，其中alkB2編碼的烷烴羥化酶是不含血紅素鐵的膜蛋白，其催化的烷烴羥化反應是烷烴降解作用過程中的第一步也是關鍵步驟，其烷烴降解的范圍是C8-C16。因此，我們選擇A.borku-mensis SK2的alkB2基因為目的基因。3
【發明內容】
[0006]本發明的目的是制備一株能降解海水柴油污染物的基因工程菌，并鑒定其降解能力。
[0007]Y8菌是從定海港口受污染的海水中，采用富集培養微生物的方法，分離獲得的對油類污染降解效率較低的土著菌，但能在以柴油為唯一碳源的海水培養基中生長繁殖。經紫外分光光度法檢測，其對柴油污染物的7天降解效率僅為10~15%。
[0008]對Y8菌株直接進行菌落PCR擴增，得到16S rDNA的基因序列，構建系統發育樹，結果表明Y8菌株與Klebsiella oxytoca strain ATCC13182相似度達到99%,由此可確定該菌株屬于克雷伯氏菌，重建的系統發生樹表明Y8與Klebsiella oxytoca strain ATCC13182所構的支為姐妹群關系。
[0009]提取Y8基因組，經PCR分析得知Y8中未含有烷烴羥化酶AlkB2，由于烷烴羥化酶是柴油降解的重要限速酶，所以采用基因轉導的方法，在Y8中轉入alkB2基因，構建基因工程菌 Y8-alkB2。
[0010]經鑒定Y8-alkB2能特異表達AlkB2蛋白，對柴油的降解率分別為:2天，20.14% ；4 天，51.94% 以及 6 天，72.16%。
4【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1:根據Y816s rDNA序列構建的系統發育樹。
[0012]圖2 =PCR鑒定Y8中alkB2基因表達:P_質粒；G_基因組。
[0013]圖3:PCom8-alkB2質粒的鑒定(質粒大小、PCR和酶切)
[0014]圖4:Y8-alkB2菌株抽提質粒PCR、酶切鑒定以及蛋白表達鑒定的鑒定。
[0015]圖5:Y8與Y8_alkB2菌株對柴油的降解效率比較。
5【具體實施方式】
[0016]以下通過具體實施對本發明做進一步說明。
[0017]實施例1.污染海水中細菌的富集、培養
[0018]從受污染的海水區域采集表層水樣，用滅菌后的4L棕色玻璃瓶取2L表層海水后密封保存，24h內進行微生物的富集培養和分離工作。
[0019]將采集的水樣取ImL接種于含0.5% (V / V)柴油的10mL滅菌的人工海水培養基(MMC)中。MMC 的配方為(每升含量):NaC124g ；MgS04.7H200.7g ；NH4NO3Ig ；KC10.7g ；KH2P042g ；Na2HPO4.12H203g ；pH7.5，滅菌后補加適量微量元素混合。微量元素經0.22 μ m濾膜過濾除菌，其組成(每升含量)如下:CaCl22mg ；FeCl3.6H2050mmg ；CuSO40.5mmg ；MnCl2.4Η200.5mg ；ZnSO4.7H2010mg / L。在 30°C,200r / min 的搖床培養 7 天后，從培養液中取出ImL轉入10mL新鮮培養基中，培養基的油濃度提高至I % (v / v)，在相同的條件下培養；油濃度按梯度(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5% )提高，富集培養五個周期。
[0020]實施例2.Y8菌株的分離
[0021]用移液槍(槍頭已滅菌)吸取ImL富集培養物置于9mL無菌水中，作為KT1稀釋液進行倍比稀釋，分別制成10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7、10_8稀釋液；分別吸取0.2mL不同稀釋度的樣品滴入LB固體培養基內，涂布8個平板，對應編號，倒置于35°C生化培養箱培養I~2天；再在平板上挑取單菌落，采取分區劃線法，使菌種進一步純化；純化后的菌株保存在斜面培養基中，并于4°C冰箱中保藏；實驗均在無菌室超凈工作臺操作。
[0022]將分離純化的細菌分別接種于5ml LB液體培養基中，200rpm，35°C下振蕩培養12h，至菌懸液OD600nm值為0.8~1.0 (菌體濃度為18~19Cells / mL)，然后將0.5ml去掉LB培養基的各菌懸液分別加入50mL相同柴油濃度的MMC中，設空白對照，200rpm，30°C下振蕩培養7天，將能以柴油作為唯一碳源生長的菌株保存，即為Y8。
[0023]實施例3.Y8菌株降解率的初步測定
[0024]取保存的Y8菌種，LB平板劃線，30°C恒溫培養過夜，挑取單克隆，接種于5mL LB培養基中，于30°C、200rpm的搖床培養8小時。吸取0.5mL活化后的菌液至1.5mLEP管中，在3000rpm條件下離心5min，棄上清；用0.5mL的MMC培養基懸浮沉淀，再次在3000rpm條件下離心5min,重復洗漆菌體一次。將沉淀菌體用0.5mL MMC培養基懸浮后,接種于50mL添加過I %柴油的MMC培養基中，于30°C、200rpm的搖床培養一周。
[0025]根據《海洋監測規范-海水分析》(GB17378.4-2007)，用石油醚萃取MMC中的殘留柴油，采用紫外分光光度法測定柴油的殘留量，以未接菌的含相同柴油濃度的MMC培養基為對照， 計算降解率。該實驗設3個重復。柴油降解率計算公式為:=Il-(C0-C1) / CcJ X 100%，其中，Ctl和C1分別為對照組柴油濃度和接菌組柴油濃度。Y8的柴油降解率初步測定為10-15%。
[0026]實施例4.Y8菌株的16S rDNA鑒定
[0027]Y8菌株用TAKARA的DNA提取試劑盒直接提取DNA作為模板，PCR反應體系(50 μ I)為 Premix EX Taq PCR MasterMix (TAKARA) 25 μ I，引物 27F (5，-AGR GTTTGATYVTGGCTCAG-3’)和 1492R(5’-GGHTACCTTGTTACGACTT-3’)各2μ I (1pmol)，DNA 模板 2 μ 1(約 20ng)，超純水19 μ I。PCR 擴增程序為 94°C 1min ；94°C lmin，53°C 90s，72°C 90s，30 個循環；72°C 1min0擴增產物進行測序，測序結果用DNAstar軟件來拼接，DNA序列檢測結果如下:
[0028]5， -TGCAAGTCGAACGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGGGTAAGGTTAATAACCTTGTTCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTGGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTCGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCG-3，
[0029]將測得的菌株的16S rDNA序列通過EzTaxon Server vers1n2.1與其中核酸數據庫進行比對分析，相似的序列進行多重匹配排列分析(clustalxl.83)，用Mega4分析軟件中的Neighbor Joining方法構建系統發育樹(圖1)。結果表明:Y8菌株與Klebsiellaoxytoca strain ATCC13182相似度達到99%，由此可確定該菌株屬于克雷伯氏菌，重建的系統發生樹表明Y8與Klebsiellaoxytoca strainATCC13182所構的支為姐妹群關系。
[0030]實施例5.Y8的alkB2基因表達
[0031]通過堿裂解法，抽提Y8中基因組和土著質粒，按照genebank上alkB2序列，設計alkB2通用引物，經PCR鑒定Y8的alkB2基因表達，結果如圖2所示:與陽性對照菌W3相t匕，Y8中無alkB2基因表達，由于Y8能在以以柴油作為唯一碳源的條件擴增，說明Y8具有利用柴油的一系列酶，然而作為柴油降解限速酶AlkB2，其在Y8中表達缺失，為了進一步增強Y8的降解效率，釆用基因工程的手段，轉入alkB2基因，以期提高Y8的柴油降解效率。
[0032]實施例6.PCom8-alkB2質粒的構建和鑒定
[0033]按照genebank上alkB2序列，運用DNA club、Clustal X等軟件設計目的基因兩端的酶切位點:Sal I和Nde I，交由生物技術公司合成目的基因alkB2_SK2。目的基因序列為:
[0034]latgttcgaga atacgaatcc tgatgtaatg ctaaaaatga aaaaatatgg ctacctggct
[0035]61ttttgggcaa ttatggtgcc gcttgttcct ttttctgcct tcgtgggggt ggaaagtggc
[0036]121acgcaggatt attgggcctg gtttatgtat gccttcatct tcgggattat cccggtactg
[0037]181gattatttgg tgggtaaaga tccgactaat cccagtgaag atgtgcaggttcccactatg
[0038]241agtgaggaag ttttttaccg ggtctctgca atcgccatgg gcttcgtatg gatcgcggta
[0039]301ttgttctatg ctggtcatat tttcatgaac aatggctacg gtctgctggg caaaatcggt
[0040]361tggattgtct ctattggcac cgtaggtggc attatcgcaa tcaatttggg gcatgagttg
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[0042]481tatgcgggtt tcaaggtgga gcatgtgcgg ggtcatcacg tccacgtatc taccccggat
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[0044]601cataacttca ttaacgcctg gagtctggaa aaaaaatacc tggagcgtaa agggaagaag
[0045]661aacattagtg ttcataatga acttatctgg tggtcagca tttctgcgttgttcgcggcc
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[0047]781gccgccctag ccttagagat cattaactac attgaacact acggtttgca tcgccgtgtg
[0048]841aatgacaagg ggcgtttcga gcgggtgaca cctgcacata gctggaactc caacttcttg
[0049]901ttaactaact tggccctgtt tcaactacag cgccacagtg accaccatgc ttacgccaag
[0050]961cgtcgttatc aggtcttgcg ccattatgaa gaaagtccgc agttgccggc aggttacgcc
[0051]1021accatgtatg tgttggcctt gataccgcca ctgtggagaa aggtgatgaa tcctcgagta
[0052]1081gaagcgtatt acgagggtga attggatcaa ctgttccgcg atggcaagcg agtgaacaat
[0053]1141atcgcttaa / /
[0054]pCom8空載體和PCR產物經Sal I和Nde I酶切，酶切條件為37 °C，6h。酶切產物過柱回收，回收的空載體和PCR產物經T4連接酶連接，連接條件為4°C，過夜。連接產物轉導入大腸桿菌DH5 α，經LB平板培養過夜，挑取單克隆，抽提質粒，根據目的基因序列，設計上下游引物對提取的重組質粒進行PCR鑒定，引物序列為:上游引物5’ TTGCTTGATGCGATGTTT3';下游引物 5’ AGTCCGTTCACGATACCC3’ ；根據酶切位點，通過 SalI和Nde I酶切鑒定質粒；根據質粒大小，通過瓊脂糖凝膠電泳，鑒定質粒，具體結果如圖3所示，結果表明重組質粒pCom8-alkB2PCR片段大小為150bp，酶切產物全長為1150bp。電泳鑒定后，質粒又交由生物技術公司測序，經blast表明，各目的基因與genebank登錄序列一致，證明重組質粒構建成功。
[0055]實施例7.Y8-alkB2菌株的構建與鑒定
[0056]pCom8_alkB2質粒通過電轉化的方式導入土著菌Y8，完成基因工程菌Y8_alkB2構建。陽性菌克隆通過對抽提的質粒進行酶切和PCR鑒定，結果如圖4所示:質粒PCR片段大小為150bp，酶切產物全長為1150bp，與pCom8-alkB2相同，證明質粒成功導入Y8。為了進一步驗正pCom8-alkB2質粒在土著菌Y8中能否表達AlkB2蛋白，我們通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測alkB2基因在Y8中的表達。結果表明:alkB2基因在1%柴油誘導時，在Y8中能夠正確表達，表達的目的蛋白分子量與預期一致，條帶大小約為49KD。
[0057]實施例8.Y8-alkB2菌株的柴油降解率檢測
[0058]檢測基因工程菌Y8_alkB2和土著菌Y8在1%柴油濃度的海水培養基中培養3d后的柴油降解率。結果如圖5所示:土著菌Y8和基因工程菌Y8-alkB2的降解率分別為9.64%
20.64% (2 天);11.26%和 51.94% (4 天);1L33%和 72.16% (6 天)，提示基因工程菌Y8-alkB2能顯著提高土著菌的降解效率。 [0059]本發明，本領域技術人員可通過借鑒本文，明顯能不脫離本
【發明內容】
、精神和范圍內，適當改變動物模型、輻射劑量和檢測方法實現本應用。特別需要指出的是，所有相類似的替換和改動，都被視為在本發明精神、范圍和內容中。
【權利要求】
1.一株能降解海水柴油污染物的基因工程細菌Y8-alkB2SK2，其特征是土著菌Y8轉入一種焼徑末端單加氧酶基因(alkane monooxygenase, alkB)片段，并能在以柴油為唯一碳源的海水培養基中生長繁殖，提高土著菌Y8的柴油降解率。
2.權利要求1所述的土著菌Y8，其特征為Y8屬于變形菌綱、腸桿菌目、腸桿菌科、克雷伯氏菌屬，其中 Y8 的 16s rDNA 序列 BLAST 比對與 Klebsiella oxytoca strain ATCC13182相似度達到99%。
3.權利要求1所述的alkB2SK2目的基因片段具有如下的序列: latgttcgaga atacgaatcc tgatgtaatg ctaaaaatga aaaaatatgg ctacctggct 61ttttgggcaa ttatggtgcc gcttgttcct ttttctgcct tcgtgggggt ggaaagtggc 121acgcaggatt attgggcctg gtttatgtat gccttcatct tcgggattat cccggtactg 181gattatttgg tgggtaaaga tccgactaat cccagtgaag atgtgcaggttcccactatg 241agtgaggaag ttttttaccg ggtctctgca atcgccatgg gcttcgtatg gatcgcggta 301ttgttctatg ctggtcatat tttcatgaac aatggctacg gtctgctggg caaaatcggt 361tggattgtct ctattggcac cgtaggtggc attatcgcaa tcaatttggg gcatgagttg 421atccacaaag atcccaaagtggaaaattgg atgggtggtt tgttgctgtc tagcgtcacc 481tatgcgggtt tcaaggtgga gcatgtgcgg ggtcatcacg tccacgtatc taccccggat 541gacgcatcgt ccagccgtta taaccaaagt ctgtataact ttcttcccaa ggcgtttgta 601cataacttca ttaacgcctg gagtctggaa aaaaaatacc tggagcgtaa agggaagaag 661aacattagtg ttcataatga acttatctgg tggtacagca tttctgcgtt gttcgcggcc 721acattcggac tgctttgggg ttggcagggg gtggtgttct ttctggggca gagtttcttt 781gccgccctag ccttagagat cattaactac attgaacact acggtttgca tcgccgtgtg 841aatgacaagg ggcgtttcga gcgggtgaca cctgcacata gctggaactc caacttcttg 901ttaactaact tggccctgtt tcaactacag cgccacagtg accaccatgc ttacgccaag 961cgtcgttatc aggtcttgcg ccattatgaa gaaagtccgc agttgccggc aggttacgcc 1021accatgtatg tgttggcctt gataccgcca ctgtggagaa aggtgatgaa tcctcgagta 1081gaagcgtatt acgagggtga attggatcaa ctgttccgcg atggcaagcg agtgaacaat 1141atcgcttaa / / 。
4.按照權利要求1所述，所說的提高土著菌Y8的柴油降解率，其特征為:在以柴油為唯一碳源的海水培養基中培養2天、4天和6天，Υ8和Y8-alkB2的降解率分別為:9.64%和.20.64% (2 天);11.26%和 51.94% (4 天);1L33%和 72.16% (6 天)。
【文檔編號】C12R1/22GK104031871SQ201310522030
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年1月3日 優先權日:2014年1月3日
【發明者】劉瓊, 何穎, 沈先榮, 李珂嫻, 王慶蓉, 侯登勇, 蔣定文, 劉玉明, 陳偉 申請人:中國人民解放軍海軍醫學研究所