55型腺病毒的特異性檢測用引物探針組合和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種采用熒光PCR技術，特異性檢測樣品中55型腺病毒核酸存在的寡核苷酸序列組合，以及包括該組合的試劑盒。該試劑盒能夠靈敏地檢測并鑒別樣品中存在的55型腺病毒核酸，其檢測下限均為20拷貝每反應體系，在疾病監測、臨床診斷等領域具有重要的應用價值。
【專利說明】55型腺病毒的特異性檢測用引物探針組合和試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種采用熒光PCR技術，特異性檢測樣品中55型腺病毒核酸存在的寡核苷酸序列組合，以及包括該組合的試劑盒。
【背景技術】
[0002]腺病毒是一種無包膜、線狀的雙鏈DNA病毒，對呼吸道、胃腸道、尿道和膀胱、眼、肝臟等均可感染。
[0003]腺病毒引起的呼吸道感染暴發疫情在國內外時有報道，主要發生于封閉環境內的人群，如寄宿制學校，托幼機構。臨床癥狀除發熱、寒戰、頭痛、咳嗽外，常有明顯的咽痛及咽喉部潰瘍；在臨床上，腺病毒呼吸道感染分為以下幾種類型:急性發熱性咽喉炎、咽結膜炎、急性支氣管炎和肺炎4中臨床類型。
[0004]目前，腺病毒共有55型，腺病毒4、7和21型是部隊入伍新兵及其他在封閉環境內的人群，如寄宿制學校、托幼機構急性呼吸道疾病暴發的常見病原體，55型腺病毒在我國發現，是腺病毒11型與15型基因重組而成的新型病毒，曾于2006年在我國北方學校學生群體中引起呼吸道暴發疫情，以輕型病例為主。
[0005]在實驗室檢測中 ，PCR法由于其快速簡便的特點逐漸呈現出要替代以細菌培養和血清學檢測為主的傳統檢測方法的趨勢。而對于PCR方法來說，引物的特異性是其檢測的特異性和敏感性的基礎。本發明針對55型腺病毒特異的靶序列設計引物和Taqman探針，利用real-time PCR的方法，用來鑒別檢測樣品中55型腺病毒核酸，可以快速獲得特異性檢測結果。
【發明內容】
[0006]為了更加準確地檢測樣品55型腺病毒核酸存在，本發明提供一種特異性檢測樣品中55型腺病毒的寡核苷酸序列組合和包含該組合的試劑盒，其特征在于序列組合或試劑盒的PCR反應液中用于核酸擴增的引物為:
Pl:5'-CAGGATGCTTCGGAGTACCT-3',
P2:5'-CTTATTTCCCAGATTGAAGTAGGT-3'。
[0007]Pl和P2為針對55型腺病毒基因組特異性序列設計并經預實驗篩選出的特異性引物。
[0008]本發明的特征還在于，序列組合或試劑盒的PCR反應液中用于熒光信號監測的寡核苷酸探針為:
Probel:5'-XfCCGGGTCTGGTGCAGTTTGCC-YfS'。
[0009]X1為熒光報告基團，Y1為熒光淬滅基團。Probel為針對55型腺病毒基因組特異性序列設計并經預實驗篩選出的特異性探針。
[0010]本發明的特征還在于，試劑盒包括PCR反應液、酶混合液、陰性質控品和陽性質控品。其中PCR反應液主要含有上述的引物和探針、反應緩沖液、Mg2+和dNTP等，酶混合液主要含有熱啟動Taq酶，陰性質控品為去離子水，陽性質控品為含有檢測靶序列的核酸。
[0011]本發明的一優選實施方案為:序列組合或試劑盒的PCR反應液中用于突光信號監測的寡核苷酸探針的熒光基團分，其中Probel熒光報告基團X1為Fam，熒光淬滅基團Y1為 Eclipse。
[0012]本發明的另一優選實施方案為:試劑盒的PCR反應液包含上述特異性引物和特異性探針，屬于實時熒光單重PCR檢測，可在同一個反應體系中對百55型腺病毒核酸進行檢測。
[0013]本發明的另一優選實施方案為:試劑盒的PCR反應循環參數為94°C，2min;進入循環階段:94°C變性10s，56°C退火50s，72°C延伸15s，共反應40個循環。
[0014]本發明的另一優選實施方案，試劑盒選用的PCR反應體系為20 μ 1，包括2XPCR緩沖液 10 PlUOmmol/L dNTP 1.0μ1、25Μπιο1/1 引物各 0.5 μ1、10Μπιο1/1 探針 0.2 μ?、熱啟動Taq酶混合液0.4μ1、樣品DNA 2μ1，加滅菌水至終體系20 μ?。
[0015]本發明提供的試劑盒對55型腺病毒核酸的檢測下限為20個拷貝每反應體系。
[0016]本發明分別根據55型腺病毒基因組保守區分別設計特異性引物和探針，提供的試劑盒可以檢出55型腺病毒的核酸，但不能檢出非55型腺病毒病原體的核酸，說明試劑盒具有很好的特異性。
[0017]本發明提供的試劑盒2小時內即可完成檢測，可為55型腺病毒的疾病監測和臨床診斷提供實驗依據。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為單重實時熒光PCR檢測55型腺病毒核酸靈敏度的擴增曲線圖。從左至右的5條曲線分別為55型腺病毒特異性PCR片段構建質粒梯度稀釋(IO5-1O1)后擴增結果。橫坐標為反應循環數，縱坐標為不同循環數熒光檢測信號的DRn值。
圖2為實時熒光單重PCR檢測體系對55型腺病毒核酸檢測特異性擴增曲線圖。55型腺病毒出現S型擴增曲線，而其他病原微生物質控菌均未出現S型擴增曲線。橫坐標為反應循環數，縱坐標為不同循環數熒光檢測信號的DRn值。
【具體實施方式】
[0019]下面結合具體實施例詳細說明本發明的優選實施方式。需要指出的是，這里列出的實施例僅僅為示例性說明的目的，而不應將其解釋為對本發明范圍的任何限制。其中使用的試劑盒、緩沖液等試劑僅僅為該具體實施例中具體選擇的試劑，應理解，本領域技術人員可根據需要選擇其他公司的相應試劑以實現本發明的目的。
[0020]1、引物和TaqMan探針的設計與合成
利用Blast工具對Genbank和國內外文獻中的所有的55型腺病毒基因組序列進行分析，分別選擇其穩定的保守區域作為檢測靶序列，并針對這測靶序列設計和合成引物和探針(見表1 )。引物和探針均由日本TaKaRa大連寶生物公司合成，其中55型腺病毒的檢測探針5’端標記FAM熒光基團，3’端標記Eclipse熒光淬滅基團。
[0021]2、檢測菌種的準備
本實施例中所使用 的55型腺病毒以及其他陰性對照菌株(腺病毒3型、7型、流感病毒AH1N1、AH3N2、肺炎鏈球菌、b型流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎衣原體和卡他莫拉菌)均購買于中國藥品生物制品檢定所。
[0022]3、菌株DNA的抽提
選用Qiagen公司QIAamp DNA Mini Kit (貨號:51306)提取菌株DNA。具體步驟試劑盒參考操作說明書。
[0023]4、引物和探針的篩選
采用設計的引物和探針分別檢測提取的55型腺病毒和陰性對照菌株細菌的基因組DNA，經反復實驗，篩選出靈敏度、特異性和重復性最佳的引物探針組合(見序列表，55型腺病毒正向引物pl、反向引物P2和探針probeDo
[0024]5、標準品的構建與制備
分別利用PU P2引物，PCR擴增55型腺病毒特異性基因片段，將PCR產物克隆至PMD-18T載體，轉化DH5a大腸桿菌，利用堿裂解法提取陽性克隆質粒，利用紫外可見分光光度計分別測定在波長260nm處、280nm處DNA的吸光率，然后計算質粒濃度與純度。然后10倍梯度稀釋至10個拷貝每微升。
[0025]6、反應條件優化
對引物、探針、酶等要素逐 一優化，確定的反應體系為:2XPCR緩沖液10 μ?UOmmol/L dNTP 1.0μ1、25Μπιο1/1 引物各 0.5 μ1、10Μπιο1/1 探針 0.2 μ?、Takara 聚合酶混合物
0.4μ1、模板2ul，加滅菌水至終體系20 μ?。
[0026]根據擴增片段長、引物和探針的退火溫度以及酶的特性，主要對反應退火溫度和延伸時間進行了優化，最終確定的循環參數為:94°C，2min;進入循環階段:94°C變性10s，56°C退火50s，72°C延伸15s，40個循環，每個循環在退火階段采集熒光信號。
[0027]在擴增結束后按同一條件分析數據，確定各樣品的Ct值。
[0028]7、檢測限的評價
以上述5中的陽性標準品評價本發明的提供的試劑盒的檢測限，陽性標準品濃度為:I X IO5Copies/ μ I，I X IO4Copies/ μ I, I X IO3Copies/ μ I, I X IO2Copies/ μ I，I X IO5Copies/μ 1，I X IO5Copies/μ 1，本發明提供的試劑盒對55型腺病毒核酸的檢測下限為20個拷貝每反應體系。
[0029]8、檢測特異性的評價
以上述2中的菌株DNA為模板評價了本試劑盒的特異性。對55型腺病毒DNA進行檢測時均可見明確的擴增曲線，對上述9種其他咽部常見病原微生物DNA檢測時，未產生陽性擴增曲線，說明我們使用的探針和引物與我們選定的其他菌株之間不存在交叉反應。
[0030]盡管上文中以優選的方式，通過具體實施例示例性說明了本發明的某些實施方式，但是本領域技術人員應了解，本發明并不限于上面所公開的實施方式，而是可以根據本發明所屬【技術領域】的知識對其進行修改，所作修改不會超出本發明要求保護的范圍。例如，本發明所使用的熒光實時PCR也可以根據需要采用說明書中所列出的實施例中指出的熒光基團和熒光淬滅基團以外的標記物質，如Tet、FAM、HEX、TAMRA, ROX、Cy3、TxRd、JOE等標記物；或使用Taqman技術之外的其他標記體系,例如MGB探針、分子信標MB探針、蝎形探針、熒光雙雜交探針等熒光探針標記技術；或使用染料嵌合法如SYBR Green I等不飽和染料與LC Green等飽和染料，只要其使用了本發明所述的特異性引物序列，即可定性或定量檢測目的基因的存在，進而特異性地檢測55型腺病毒的存在。所以，這些本領域技術人員所了解的改變和慣用手 段的替換也落入本發明的保護范圍內。本發明的保護范圍應由所附的權利要求書所限定。
【權利要求】
1.一種用于特異性檢測樣品中55型腺病毒核酸的引物組合，這套序列組合特征在于包括下列引物:
Pl:5'-CAGGATGCTTCGGAGTACCT-3',
P2:5'-CTTATTTCCCAGATTGAAGTAGGT-3'。
2.一種用于特異性檢測樣品中55型腺病毒核酸的引物和寡核苷酸探針組合，其中引物為權利要求1所述的引物，寡核苷酸探針為:
Probel:5'-XfCCGGGTCTGGTGCAGTTTGCC-YfS' ； X1為熒光報告基團，Y1為熒光淬滅基團。
3.如權利要求2所述，這套序列組合特征還在于，其中Probel熒光報告基團X1為Fam，熒光淬滅基團Y1S Eclipse。
4.如權利要求2所述，這套序列組合特征還在于，可用于單重實時熒光聚合酶鏈反應檢測，即一個反應體系可檢測出55型腺病毒核酸。
5.一種用于特異性檢測樣品中55型腺病毒核酸的試劑盒，其中包括PCR反應液、酶混合液、陰性質控品和陽性質控品， 其特征在于PCR反應液中用于核酸擴增反應的引物序列如下:
Pl:5'-CAGGATGCTTCGGAGTACCT-3',
P2:5'-CTTATTTCCCAGATTGAAGTAGGT-3'。
6.如權利要求5所述的試劑盒,其特征在于PCR反應液中用于突光信號監測的寡核苷酸探針的序列如下:
Probel:5'-XfCCGGGTCTGGTGCAGTTTGCC-YfS'， X1為熒光報告基團，Y1為熒光淬滅基團。
7.如權利要求5所述的的試劑盒，其特征還在于PCR反應液中用于熒光信號監測的寡核苷酸探針:其中Probel熒光報告基團X1為Fam，熒光淬滅基團Y1為Eclipse。
8.如權利要求5所述的的試劑盒，其特征還在于PCR反應體系為20μ 1，包括2XPCR緩沖液 10 Pl、10mmol/L dNTP 1.0μ1、25Μπιο1/1 引物各 0.5 μ1、10Μπιο1/1 探針 0.2 μ?、熱啟動Taq酶混合液0.4μ1、樣品DNA 2μ1，加滅菌水至終體系20 μ?。
9.如權利要求5所述的的試劑盒，其特征還在于PCR反應循環參數為: 94°C,2min;進入循環階段:94°C變性10s，56°C退火50s，72°C延伸15s，共反應40個循環。
【文檔編號】C12Q1/70GK103642936SQ201310535934
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月4日 優先權日:2013年11月4日
【發明者】丁小靜, 其他發明人請求不公開姓名 申請人:江蘇和創生物科技有限公司