一種實時熒光恒溫定量檢測柑橘黃龍病的方法

一種實時熒光恒溫定量檢測柑橘黃龍病的方法
【專利摘要】本發明公開了一種實時熒光恒溫定量檢測柑橘黃龍病的方法，包括對被檢樣品進行預處理，快速提取DNA；根據HLB16SrDNA保守序列設計出2對特異性引物，包含內側引物HLB-F3、HLB-B3和外側引物HLB-FIP、HLB-BIP各一對，制備特異性引物；熒光核酸恒溫擴增檢測技術反應；熒光核酸恒溫擴增檢測標準曲線的構建，根據不同稀釋的模板pMD18-T-HLB的質粒濃度與相應的Tt值之間的關系而構建的，X軸表示起始模板濃度的對數值，Y軸表示不同濃度模板擴增達到閾值所用的時間；采用定量檢測結果判斷，在ESE-Quant?TubeScanner反應結束后，儀器自動根據標準曲線顯示定量結果，反應結束后瞬時離心將反應管內蓋上SYBRGreenI混入到反應液中，采用不開蓋顯色來判斷結果。本發明靈敏度高、高特異性、低污染、反應穩定的優點。
【專利說明】一種實時熒光恒溫定量檢測柑橘黃龍病的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于柑橘黃龍病檢測【技術領域】，尤其涉及一種實時熒光恒溫定量檢測柑橘黃龍病的方法。
【背景技術】
[0002]柑橘黃龍病(CitrusHuanglongbing,HLB)是世界柑橘生產上最具毀滅性的的病害之一，國內外植物檢疫的重要對象。目前HLB主要分布在亞洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的近50個國家和地區。柑橘黃龍病病原菌能侵染各種柑橘類植物，癥狀有斑駁型黃化、均勻型黃化、缺素型黃化和“橡皮”果等，縮短植株經濟壽命，降低產量和品質，造成巨大的經濟損失。中國19個柑橘產生產省(市、自治區)中大多數收到該病害的威海，嚴重制約柑橘產業的健康發展。
[0003]柑橘黃龍病病原菌尚不能人工培養，目前普遍認為原核生物薄壁菌門變形菌綱(Proteobacteria) α -變型菌綱(Alphaproteobacteriacea)根瘤菌目(Rhizobiales)根瘤菌科(Rhizobiaceae)韌皮部桿菌屬(‘CandidatusLiberibacter’ )是引起黃龍病的主要病原菌，其病原菌分為亞洲種(‘Ca.L.asiaticus’)、非洲種(‘Ca.L.africanus’ )和美洲種(‘Ca.L.americanus’ ),我國柑橘黃龍病病原主要是亞洲種(‘Ca.L.asiaticus’)。由于柑橘黃龍病尚無特效治療性藥劑，也沒有抗(耐)病品種可供應用。因此，嚴格的檢疫措施、種植無病苗木、及時挖除病樹，以及系統而全面防治木虱是目前防治黃龍病較為有效的方法，而快速、穩定、靈敏的檢測方法是無毒種苗生產的重要保證。
[0004]近年來，有報道證實基于PCR的方法已經成功用于HLB的檢測，PCR方法在操作時間上以及檢測的特異性和靈敏度方面較常規方法有較大提高，但是，PCR檢測技術需要特殊的儀器設備且檢測成本較高，而且它的檢測時間仍然比較長(2~3小時)，不適合田間大規模的快速應用。因此，在加強柑橘苗木檢疫監測中，迫切需要開發一種靈敏度高、操作簡便、成本低廉且結果判斷迅速的檢測方法，在一定程度上可以取代PCR的檢測方法。
[0005]日本學者Notomi等于2000年首次開發了環介導等溫核酸擴增反應(loop-mediatedisothermalamplification, LAMP),該技術依賴六條特異引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下快速、高效、高特異、高靈敏地擴增靶序列，該技術先利用兩條內引物和兩條外引物，通過鏈置換作用形成莖環狀DNA結構，然后在內引物的作用下通過環介導的自動循環鏈置換反應大量擴增靶序列，具有特異性強、敏感性高、簡便易行等特點。實時突光核酸恒溫擴增檢測技術(real-timef luorescenceloop-mediatedi sothermalamp Iificationassay,簡稱RealAmp)是將新一代的核酸恒溫擴增技術和實時突光檢測技術相結合的一種新型核酸檢測技術，可以定量檢測病原物，具有高靈敏度、高特異性、低污染、反應穩定等優點。此外，SYBRGreenI是目前LAMP產物最靈敏的檢測方法之一，但是在RealAmp中SYBRGreenI的加入可能會抑制LAMP的反應效率，因此，在實際操作中普遍采用SYT0-9熒光染料進行RealAmp反應，而把SYBRGreenI染色顏色判斷結果作為定量檢測的一種輔助判斷措施。[0006]該方法通常是按如下步驟進行:步驟一、對被檢標本進行預處理，快速提取被檢標本的DNA ;步驟二、特異性引物的制備:確定待測標本的靶基因后，取得特異性引物2對，內引物和外引物各一對；步驟三、實時熒光核酸恒溫擴增(RealAmp)反應:將經前處理的樣品、引物、反應緩沖液與BstDNA聚合酶混合，在63°C保溫1.5小時進行循環鏈置換反應；步驟四、分析判斷反應產物結果。
[0007]目前，國外 Okudaetal.(2005)黃龍病亞洲種的 tufB-secE-nusG-rplKAJL-rpoB 基因建立了 HLB亞洲種的LAMP檢測技術，其檢測靈敏度能夠檢出大約300個基因拷貝，并對日本和印度尼西亞的HLB進行了檢測分析。在國內，黃麗等(2012)采用核糖體的外膜蛋白基因(Genebank登錄號:AY842429)建立HLB的LAMP快速檢測方法，質粒DNA拷貝數為3.9 X IO1的模板仍然可以有效擴增，比Okudaetal.(2005)的LAMP檢測靈敏度更高，作者推測可能是引物擴增效率以及反應體系優化的結果。孔德英等(2013)同樣采用核糖體的外膜蛋白基因(Genebank登錄號:HQ2627229.1)為靶標建立了亞洲種的LAMP檢測方法，其靈敏度可達25pg/ μ L，與對照實時熒光PCR方法靈敏度相同。

【發明內容】

[0008]本發明實施例的目的在于提供一種實時熒光恒溫定量檢測柑橘黃龍病的方法，旨在解決現有的柑橘黃龍病檢測方法存在的靈敏度低、特異性低、高污染、反應不穩定的問題。
[0009]本發明實施例是這樣實現的，本發明實施例的實時熒光恒溫定量檢測柑橘黃龍病的方法，該實時熒光恒溫定量檢測柑橘黃龍病的方法步驟如下:
[0010]步驟一、對被檢樣品進 行預處理，提取DNA，取當季老熟葉片中脈近葉柄處5mg~IOmg置于1.5mL離心管中，在液氮中研磨至粉末狀后加入60 μ LTES緩沖液，70°C恒溫水浴7min后再加入60yL酚:氯仿:異戊醇混合液，混合液中酚:氯仿:異戊醇的重量比為25:24:1,潤旋混勻后12000rpm離心5min,取40 μ L上清液加入由SephadexG-50_80構成的微柱中，4°C、5000rpm離心4min，用一新的無菌1.5mL的離心管收集濾液，_20°C保存備用；
[0011]步驟二、根據HLB 16SrDNA保守序列設計出2對特異性引物，包含內側引物HLB-F3、HLB-B3和外側引物HLB-FIP、HLB-BIP各一對，制備特異性引物；
[0012]步驟三、熒光核酸恒溫擴增檢測反應；將經前處理的樣品、引物、反應緩沖液與BstDNA聚合酶混合，在63°C保溫90min進行循環鏈置換反應；
[0013]步驟四、熒光核酸恒溫擴增檢測標準曲線的構建；采用HLB亞洲種特異性PCR引物OIl和012c，該引物擴增的的rDNA序列包含整個RealAmp的擴增區間，克隆該序列到PMD18-T載體測序正確后的質粒，命名為PMD18-T-HLB，用于構建標準曲線；
[0014]HLB 的 PCR 檢測反應體系的方法:2.5 μ L10XPCRbufferMg2+，2 μ L dNTPs ( 2.5mMeach)，0.25 μ LTaq 聚合酶(5U/yL)，弓 I 物 OIl(5' -GCGCGTATTTTATACGAGCGGCA-3')和 0I2c(5' -GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3 ')各
Iμ L (IOpM), I μ LDNA,補水至 25 μ L ；PCR 反應的條件:94°C 預變性 3min，94°C 變性 30s、60°C退火30s、72°C延長90s、進行35次循環；72°C延長7min，反應結束后，取5 μ L反應產物，1%瓊脂糖凝膠電泳后EB染色觀察結果，PCR擴增條帶切膠回收連接pMD-18-T載體后測序正確后，將該質粒命名為pMD18-T-HLB10ng/l.! L，10倍梯度稀釋后作為模板用于評估熒光核酸恒溫擴增的檢測靈敏度并由此構建HLBRealAmp的標準曲線；
[0015]步驟五、采用定量檢測結果的判斷,在ESE-QuantTubeScanner反應結束后，儀器自動根據標準曲線顯示定量結果，反應結束后瞬時離心將反應管內蓋上的SYBRGreenI混入到反應液中，采用不開蓋顯色來判斷結果。
[0016]進一步，在步驟一中，DNA提取液包含:IOOmMTris-HClpH8.0、20mM EDTApH8.0 和2%w/vSDS0
[0017]進一步，在步驟二中，由兩對引物構成的引物混合液，其中HLB-F3即5' -GGCCTTAGGGTTGTAAAGC-3 '和 HLB-B3 即 5 ' -CACCTCTACACTCGGAATTC-3 '為外側引物，HLB-FIP 即 5' -GGCTGCTGGCACGAAGTTACGCCGGAGAAGATAATGAC-3'和 HLB-BIP 即 5' -GCGAGCGTTGTTCGGAATAACGTTGAGCCCTGGGATTTC-3'為內側引物,外引物 HLB-F3 和所述外弓 I 物HLB-B3的濃度分別為5pmol/y I ;內引物HLB-FIP和內引物HLB-BIP的濃度均為40pmol/μ I。
[0018]進一步，在步驟三中，突光核酸恒溫擴增25 μ L反應體系為:1 μ L抽提的核酸DNA 作為模板，2.5 μ LlO X BstDNApoIymersebuffer、1.4mMdNTPs>0.8mM 甜菜喊、8mMMgS04、
0.2μΜ 的外引物 B3 和 F3、l.6μΜ 的內引物 FIP 和 ΒΙΡ、1 μ LBstDNApolymerase8U/ μ L,
0.2 μ MSYT0-9熒光染料，補水至25 μ L，然后再加入等體系的石蠟油覆蓋整個反應液；
[0019]熒光核酸恒溫擴增反應:63°C反應90min后80°C反應10min終止反應，RealAmp反應前在反應管內蓋上加如I μ L1: 10倍稀釋的SYBRGreenI熒光染料，待反應結束后瞬時離心將SYBRGreenI加入LAMP反·應液中進行顯色觀察，設置陽性對照反應時，用感染HLB的柑橘基因組總DNA代替；設置陰性對照反應時，用TE即IOOmMTris-HClpH8.0、50mMEDTA代替，將含有配制好的反應溶液的反應管置于63°C反應90min，反應結束后顯示屏上顯示擴增曲線。
[0020]進一步，在步驟四中，標準曲線是根據不同稀釋的模板PMD18-T-HLB的質粒濃度與相應的Tt值之間的關系而構建的，X軸表示起始模板濃度的對數值，Y軸表示不同濃度模板擴增達到閾值所用的時間。
[0021]本發明提供的實時熒光恒溫定量檢測柑橘黃龍病的方法，采用實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術是將新一代的核酸恒溫擴增技術和實時熒光檢測技術相結合的一種新型核酸檢測技術，可以定量檢測病原物，克服了第一代LAMP檢測方法的不足，具有高靈敏度、高特異性、低污染、反應穩定的優點，采用不開蓋不易受污染物的影響且能現場檢測土壤樣品，分析判斷反應產物的方法極為簡單，適宜于廣泛地推廣應用；通過采用核糖體16SrDNA為靶標序列建立HLB亞洲種的LAMP檢測體系，檢測靈敏度為Ipg/ μ L質粒DNA，同時改進SYBRGreenI染色方法防止污染，適合高通量的田間檢測分析。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是本發明實施例提供的實時熒光恒溫定量檢測柑橘黃龍病的方法流程圖；
[0023]圖2是本發明實施例提供的柑橘HLBRealAmp檢測的特異性分析示意圖；
[0024]圖3是本發明實施例提供的柑橘HLBRealAmp檢測的靈敏性性分析示意圖；
[0025]圖4是本發明實施例提供的柑橘HLBRealAmp標準曲線的構建示意圖；
[0026]圖5是本發明實施例提供的田間部分樣品定量檢測分析示意圖。【具體實施方式】
[0027]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0028]下面結合附圖及具體實施例對本發明的應用原理作進一步描述。
[0029]如圖1所示，本發明實施例的實時熒光恒溫定量檢測柑橘黃龍病的方法包括以下步驟:
[0030]SlOl:對被檢樣品進行預處理，快速提取DNA ；
[0031]S102:根據HLB16SrDNA保守序列設計出2對特異性引物，包含內側引物HLB-F3、HLB-B3和外側引物HLB-FIP、HLB-BIP各一對，制備特異性引物；
[0032]S103:熒光核酸恒溫擴增檢測技術反應；
[0033]S104:熒光核酸恒溫擴增檢測標準曲線的構建，根據不同稀釋的模板PMD18-T-HLB的質粒濃度與相應的Tt值之間的關系而構建的，X軸表示起始模板濃度的對數值，Y軸 表示不同濃度模板擴增達到閾值所用的時間；
[0034]S105:采用定量檢測結果的判斷，在ESE-QuantTubeScanner反應結束后，儀器自動根據標準曲線顯示定量結果，反應結束后瞬時離心將反應管內蓋上的SYBRGreenI混入到反應液中，采用不開蓋顯色來判斷結果。
[0035]本發明的具體步驟為:
[0036]步驟一、對被檢樣品進行預處理，提取DNA，取當季老熟葉片中脈近葉柄處5mg~IOmg置于1.5mL離心管中，在液氮中研磨至粉末狀后加入60 μ LTES緩沖液，70°C恒溫水浴7min后再加入60yL酚:氯仿:異戊醇混合液，混合液中酚:氯仿:異戊醇的重量比為25:24:1,潤旋混勻后12000rpm離心5min,取40 μ L上清液加入由SephadexG-50_80構成的微柱中，4°C、5000rpm離心4min，用一新的無菌1.5mL的離心管收集濾液，_20°C保存備用；DNA 提取液包含:IOOmMTris-HClpH8.0、20mMEDTApH8.0 和 2%w/vSDS。
[0037]步驟二、根據HLB16SrDNA保守序列設計出2對特異性引物，包含內側引物HLB-F3、HLB-B3和外側引物HLB-FIP、HLB-BIP各一對，制備特異性引物；由兩對引物構成的引物混合液，其中HLB-F3即5 ' -GGCCTTAGGGTTGTAAAGC-3 '和HLB-B3即5 ' -CACCTCTACACTCGGAATTC-3 '為外側引物，HLB-FIP 即 5 ' -GGCTGCTGGCACGAAGTTACGCCGGAGAAGATAATGAC-3 '和 HLB-BIP 即 5 ' -GCGAGCGTTGTTCGGAATAACGTTGAGCCCTGGGATTTC-3'為內側引物，外引物HLB-F3和所述外引物HLB-B3的濃度分別為δρπιο?/μ I ;內引物HLB-FIP和內引物HLB-BIP的濃度均為40pmol/y I。
[0038]步驟三、熒光核酸恒溫擴增檢測反應；將經前處理的樣品、引物、反應緩沖液與BstDNA聚合酶混合，在63 °C保溫90min進行循環鏈置換反應；熒光核酸恒溫擴增25 μ L反應體系為:1 μ L抽提的核酸DNA作為模板，2.5 μ LlO XBstDNApolymersebuffer、1.4mMdNTPs、0.8mM 甜菜堿、8mMMgS04、0.2 μ M 的外引物 Β3 和 F3、l.6μΜ 的內引物 FIP 和ΒΙΡ、I μ LBstDNApolymerase8U/ μ L，0.2 μ MSYT0-9 熒光染料，補水至 25 μ L，然后再加入等體系的石臘油覆蓋整個反應液；
[0039]熒光核酸恒溫擴增反應:63°C反應90min后80°C反應10min終止反應，RealAmp反應前在反應管內蓋上加如I μ L1: 10倍稀釋的SYBRGreenI熒光染料，待反應結束后瞬時離心將SYBRGreenI加入LAMP反應液中進行顯色觀察，設置陽性對照反應時，用感染HLB的柑橘基因組總DNA代替；設置陰性對照反應時，用TE即IOOmMTris-HClpH8.0、50mMEDTA代替，將含有配制好的反應溶液的反應管置于63°C反應90min，反應結束后顯示屏上顯示擴增曲線。
[0040]步驟四、熒光核酸恒溫擴增檢測標準曲線的構建；采用HLB亞洲種特異性PCR引物OIl和012c，該引物擴增的的rDNA序列包含整個RealAmp的擴增區間，克隆該序列到PMD18-T載體測序正確后的質粒，命名為PMD18-T-HLB，用于構建標準曲線；
[0041]HLB 的 PCR 檢測反應體系的方法:2.5 μ L10XPCRbufferMg2+，
2μ L dNTPs ( 2.5mMeach)，0.25 μ LTaq 聚合酶(5U/yL)，弓 I 物 OIl(5' -GCGCGTATTTTATACGAGCGGCA-3')和 0I2c(5' -GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3 ')各I μ L (IOpM), I μ LDNA,補水至 25 μ L ；PCR 反應的條件:94°C 預變性 3min，94°C 變性 30s、60°C退火30s、72°C延長90s、進行35次循環；72°C延長7min，反應結束后，取5 μ L反應產物，1%瓊脂糖凝膠電泳后EB染色觀察結果，PCR擴增條帶切膠回收連接pMD-18-T載體后測序正確后，將該質粒命名為pMD18-T-HLB10ng/l.! L，10倍梯度稀釋后作為模板用于評估熒光核酸恒溫擴增的檢測靈敏度并由此構建HLBRealAmp的標準曲線；標準曲線是根據不同稀釋的模板PMD18-T-HLB的質粒濃度與相應的Tt值之間的關系而構建的，X軸表示起始模板濃度的對數值，Y軸表示不同濃度模板擴增達到閾值所用的時間。
[0042]步驟五、采用定量檢測結果的判斷,在ESE-QuantTubeScanner反應結束后，儀器自動根據標準曲線顯示定量結果，反應結束后瞬時離心將反應管內蓋上的SYBRGreenI混入到反應液中，采用不開蓋顯色來判斷結果。
[0043]結合具體實施例對本發明做進一步的說明:·[0044]步驟一、對被檢樣品進行預處理，快速提取被檢樣品的DNA ；
[0045]核酸提取方法:取當季老熟葉片中脈近葉柄處5-10mg置于1.5mL離心管中，在液氮中研磨至粉末狀后加入60 μ LTES緩沖液，70°C恒溫水浴7min后再加入60 μ L酚:氯仿:異戊醇混合液(25:24:1)，渦旋混勻后12000印111離心51^11，取401^上清液加入由SephadexG-50-80構成的微柱中，4°C、5000rpm離心4min,用一新的無菌1.5mL的離心管收集濾液，_20°C保存備用；
[0046]DNA 提取液包含:IOOmMTris-HCl (pH8.0)、20mMEDTA (ρΗ8.0)和 2% (w/v) SDS ；
[0047]步驟二、特異性引物的制備
[0048]根據HLB16 SrDNA保守序列設計出2對特異性引物，包含內側引物(HLB-F3和HLB-B3)和外側引物(HLB-FIP和HLB-BIP)各一對，由兩對引物構成的引物混合液，其中HLB-F3 (5' -GGCCTTAGGGTTGTAAAGC-3')和 HLB_B3(5' -CACCTCTACACTCGGAATTC-3')為外側引物，HLB-FIP (5' -GGCTGCTGGCACGAAGTTACGCCGGAGAAGATAATGAC-3')和 HLB-BIP(5' -GCGAGCGTTGTTCGGAATAACGTTGAGCCCTGGGATTTC-3')為內側引物，外引物 HLB-F3 和所述外引物HLB-B3的濃度分別為δρπιο?/μ I ;內引物HLB-FIP和內引物HLB-BIP的濃度均為40pmol/μ I ；
[0049]表1HLBRealAmp特異性檢測引物序列
[0050]
【權利要求】
1.一種實時突光恒溫定量檢測柑橘黃龍病的方法，其特征在于，該實時突光恒溫定量檢測柑橘黃龍病的方法步驟如下: 步驟一、對被檢樣品進行預處理，提取DNA，取老熟葉片中脈近葉柄處5mg~IOmg置于1.5mL離心管中，在液氮中研磨至粉末狀后加入60 μ LTES緩沖液，70°C恒溫水浴7min后再加入60 μ L酚:氯仿:異戊醇混合液，混合液中酚:氯仿:異戊醇的重量比為25:24:1，渦旋混勻后12000rpm離心5min,取40 μ L上清液加入由SephadexG-50-80構成的微柱中，4°C、5000rpm離心4min，用一新的無菌1.5mL的離心管收集濾液，_20°C保存備用； 步驟二、根據HLB16SrDNA保守序列設計出2對特異性引物，包含內側引物HLB-F3、HLB-B3和外側引物HLB-FIP、HLB-BIP各一對，制備特異性引物； 步驟三、熒光核酸恒溫擴增檢測反應；將經前處理的樣品、引物、反應緩沖液與BstDNA聚合酶混合，在63°C保溫90min進行循環鏈置換反應； 步驟四、熒光核酸恒溫擴增檢測標準曲線的構建；采用HLB亞洲種特異性PCR引物OIl和0I2c，引物擴增的的rDNA序列包含整個RealAmp的擴增區間，克隆序列到pMD18_T載體測序正確后的質粒，命名為PMD18-T-HLB，用于構建標準曲線； HLB 的 PCR 檢測反應體系的方法:2.5μ L10XPCRbufferMg2+，2y LdNTPs(2.5mMeach),·0.25 μ LTaq 聚合酶(5U/ μ L)，引物 OII (5 ' -GCGCGTATTTTATACGAGCGGCA-3 ')和 OI2c(5' -GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3')各 IyL (ΙΟρΜ)，I μ LDNA，補水至 25 μ L ;PCR 反應的條件:94 V預變性3min，94 V變性30s、60 V退火30s、72°C延長90s、進行35次循環；72°C延長7min，反應結束后，取5 μ L反應產物，1%瓊脂糖凝膠電泳后EB染色觀察結果，PCR擴增條帶切膠回收連接pMD-18-T載體后測序正確后，將質粒命名為pMD18-T-HLB10ng/ μ L，10倍梯度稀釋后作為模板用于評估·熒光核酸恒溫擴增的檢測靈敏度并構建HLB RealAmp的標準曲線； 步驟五、采用定量檢測結果的判斷，在ESE-QuantTubeScanner反應結束后，儀器自動根據標準曲線顯示定量結果，反應結束后瞬時離心將反應管內蓋上的SYBRGreenI混入到反應液中，采用不開蓋顯色來判斷結果。
2.如權利要求1所述的實時熒光恒溫定量檢測柑橘黃龍病的方法，其特征在于，在步驟一中，DNA 提取液包含:IOOmMTris-HClpH8.0、20mMEDTA pH8.0 和 2%w/vSDS。
3.如權利要求1所述的實時熒光恒溫定量檢測柑橘黃龍病的方法，其特征在于，在步驟二中，由兩對引物構成的引物混合液,其中HLB-F3即5' -GGCCTTAGGGTTGTAAAGC-3;和HLB-B3 即 5' -CACCTCTACACTCGGAATTC-3'為外側引物，HLB-FIP 即 5' -GGCTGCTGGCACGAAGTTACGCCGGAGAAGATAATGAC-3'和 HLB-BIP 即 5' -GCGAGCGTTGTTCGGAATAACGTTGAGCCCTGGGATTTC-3'為內側引物，外引物HLB-F3和所述外引物HLB-B3的濃度分別為δρπιο?/μ I ;內引物HLB-FIP和內引物HLB-BIP的濃度均為40pmol/y I。
4.如權利要求1所述的實時熒光恒溫定量檢測柑橘黃龍病的方法，其特征在于，在步驟三中，熒光核酸恒溫擴增25μ L反應體系為:1 μ L抽提的核酸DNA作為模板，·2.5 μ LlOXBstDNApolymersebuffer>1.4mMdNTPs、0.8mM 甜菜喊、8mMMgS04、0.2 μ M 的外引物 Β3 和 F3、1.6 μ M 的內引物 FIP 和 ΒΙΡ、I μ LBstDNApolymerase8U/ μ L，0.2 μ MSYT0-9 熒光染料，補水至25 μ L，然后再加入等體系的石蠟油覆蓋整個反應液； 熒光核酸恒溫擴增反應:63°C反應90min后80°C反應10min終止反應，RealAmp反應前在反應管內蓋上加如I μ L1: 10倍稀釋的SYBRGreenI熒光染料，待反應結束后瞬時離心將SYBRGreenI加入LAMP反應液中進行顯色觀察，設置陽性對照反應時，用感染HLB的柑橘基因組總DNA代替；設置陰性對照反應時，用TE即IOOmMTris-HClpH8.0、50mMEDTA代替，將含有配制好的反應溶液的反應管置于63°C反應90min，反應結束后顯示屏上顯示擴增曲線。
5.如權利要求1所述的實時熒光恒溫定量檢測柑橘黃龍病的方法，其特征在于，在步驟四中，標準曲線是根據不同稀釋的模板PMD18-T-HLB的質粒濃度與相應的Tt值之間的關系而構建的，X軸表示起始模板濃度的對數值，Y軸表示不同濃度模板擴增達到閾值所用的時間。
【文檔編號】C12Q1/06GK103589794SQ201310536458
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月4日 優先權日:2013年11月4日
【發明者】彭軍, 郭建榮, 曾凡云, 龍海波, 裴月令 申請人:中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所