一種利用ssr分子標記引物體系分析柑橘黃龍病菌遺傳多樣性的方法

一種利用ssr分子標記引物體系分析柑橘黃龍病菌遺傳多樣性的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用SSR分子標記引物體系分析柑橘黃龍病菌遺傳多樣性的方法。所述SSR分子標記引物體系包括33對Las-SSR可用引物，其中18對為SSR核心引物。本發明首次提出了基于SSR分子標記并結合PAGE電泳分析柑橘黃龍病菌亞洲種（Ca.L.asiaticus）菌株多樣性的方法，該方法簡單、方便、分析效率高，為黃龍病分子流行學的研究奠定了分子基礎。
【專利說明】—種利用SSR分子標記引物體系分析柑橘黃龍病菌遺傳多樣性的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學【技術領域】。更具體地，涉及一種利用SSR分子標記引物體系分析柑橘黃龍病菌遺傳多樣性的方法。
【背景技術】
[0002]柑橘黃龍病是危及世界和我國多個柑橘產區的最主要的病害。該病害最早在我國廣東發現，至今已有近百年歷史。目前，黃龍病在亞洲和非洲廣泛分布，在大洋洲、南美洲和北美洲的部分柑橘主產區也嚴重發生，已報道在50多個國家和地區造成了巨大的損失。對黃龍病病原的認識經歷了漫長的時間，目前普遍認為黃龍病是由限制于寄主植物韌皮部、不可體外培養的革蘭氏陰性細菌Libriacter spp.)引起的。6?.L.spp包含3個亞種:亞洲種H L.asiaticus)、非洲種{Ca.L.africanus)、和美洲種H L.americanus)。其中亞洲種(6?.L.asiaticus)為世界范圍內流行范圍最廣、致病力最強的種群。我國發現的所有黃龍病相關病原均屬于亞洲種(fe.L.asiaticus)。
[0003]目前已成功地完成了 2個亞洲種(6?.L.asiaticus)菌株的全基因組測序。2009年公布了一個從攜毒柑橘木虱Psy62中獲得的大小為1.23 Mb的亞洲種(fe.L.asiaticus)全基因組序列(Genebank ID: gb I CP001677.5);2013 年，Genebank 上又公布了一個來自中國廣西的柑橘黃龍病菌亞洲種iCa.L.菌株的基因組(GenebankID: gb I CP004005.1)，大小為1.27 Mb。在Psy62菌株的全基因組序列公布以后，Liu等分析了中國云南和廣東兩個省的柑橘黃龍病菌亞洲種(Ck L.asiaticus)菌株中的前噬菌體特異引物766F/R的擴增結果，首次報道中國菌株的地區變異性(Liu et al., 2011)。咖/7基因的限制性酶切多態性也證明了菌株的多態性與地域相關(Hu et al., 201 D0Wang等分析262個分別來自中國和美國的菌株某區域(CLIBASIA_ 05640- CLIBA SIA_05650)的電泳條帶類型譜，發現2個國家之間及中國的云南和廣東兩省之間的菌株具有多態性，指出基因的插入和缺失突變是菌株遺傳多樣性的重要依據(Wang et al., 2012)。Zhou報道了基因組中的另兩個高度變異的前噬菌體基因，并利用這兩個基因分析來自不同國家的32個菌株，得出菌株多態性與地域差異相關的結論(Zhou et al., 2011)。
[0004]柑橘黃龍病菌株的地區差異性和遺傳多樣性一方面曾經引起黃龍病起源的爭議，另一方面對于該病害在不同地域間的流行和傳播也曾一度引起熱議。柑橘生產實踐者或研究者甚至發現柑橘黃龍病菌亞洲種在曾經流行過美洲種的地區大勢流行，造成嚴重的危害。因此，基于病原分子多樣性的病原流行趨勢分析具有重要的現實意義。目前常用的遺傳多樣性分析都是基于常規PCR技術、瓊脂糖凝膠電泳及序列測定來實現的。但是常規PCR通常設置較大的(20 μ L ^25 μ L)的體系，浪費大量的試劑和實驗材料(尤其是各種PCR酶價格比較昂貴，另外需要從國外取得的實驗材料更加珍貴)；并且普通瓊脂糖凝膠電泳的分辨率比較低；另外，序列測定需要用到高精度的大型測序儀，批量測序價格昂貴。因此，尋找出一種簡單、快速、經濟、高效的鑒定柑橘黃龍病菌遺傳多樣性的方法具有非常重要的理論和實踐意義。
[0005]簡單串聯重復序列(Simple sequence repeat, SSR)也叫微衛星標記(Microsatellite),是基于某一物種已知基因組的、以一定數目核苷酸(1、個堿基對)2次以上重復排列的長達幾十到幾百個核苷酸的序列。SSR標記因重復性好、穩定性強、多態性高且在基因組中普遍存在的優點被廣泛用于植物遺傳圖譜的構建、品種鑒定、遺傳多樣性分析和分子標記輔助育種等領域。雖然遺傳標記在許多模式植物上已經廣泛應用，但在植物病原細菌上還是方興未艾。植物病原細菌的遺傳方式完全不同于植物，細菌的遺傳并不涉及菌株的雜交，另一方面，細菌核酸的獲得需要克服人工培養的障礙，因此想要利用SSR分子標記的方法來分析植物病原細菌的遺傳多樣性，還需克服一系列的技術問題。
[0006]柑橘黃龍病菌目前還不能進行體外培養，無法提取純病菌的核酸。目前還沒有簡單有效的遺傳多樣性分析方法。

【發明內容】
[0007]本發明的目的在于克服現有柑橘黃龍病菌遺傳多樣性分析的技術不足，提供一套用于柑橘黃龍病菌遺傳多樣性分析的SSR分子標記引物體系。
[0008]本發明另一目的在于提供一種利用上述SSR分子標記引物體系鑒定和分析柑橘黃龍病菌遺傳多樣性的方法。
[0009]本發明上述目的通過以下技術方案實現:
本發明提供了一種柑橘黃龍病菌遺傳多樣性分析SSR分子標記引物體系，所述SSR分子標記引物體系包括33對Las-SSR可用引物，分別為Las_ssrf Las_ssr8、Las-ssrlO~Las-ssrl4、Las-ssrl6~Las_ssr20、Las_ssr22~Las_ssr36，引物序列如 SEQ IDN0.1~16、SEQ ID N0.19~28、SEQ ID N0.31~40、SEQ ID N0.43~72 所示；
其中有 18 對為 SSR 核心引物，分別是 Las-ssrl、Las_ssr3、Las_ssr5、Las_ssr7、Las_ssrl2~14、Las_ssrl8、Las_ssr22、Las_ssr27~29、Las_ssr31 ~36，引物序列如 SEQ IDN0.1~2、SEQ ID N0.5~6、SEQ ID N0.9~10、SEQ ID N0.13~14、SEQ ID N0.23~28、SEQ IDN0.35~36、SEQ ID N0.43~44、SEQ ID N0.53~58、SEQ ID N0.61 ~72 所示。
[0010]所述SSR分子標記引物體系構建方法步驟如下:
51.柑橘黃龍病菌亞洲種(CkL.asiaticus)全基因組序列的獲得:從Genebank中下載得到2個柑橘黃龍病菌亞洲種(Ck L.asiaticus)菌株序列，Genebank ID分別為gb I CP001677.5和gb I CP004005.1，分別為采自美國佛羅里達州Psy62菌株和中國廣西gxpsy菌株的基因組序列；
52.全基因組序列中SSR位點的鑒定:利用SSR檢索軟件TandemRepeats Finder(version 4.07b)獲得了 36個含有SSR位點信息的序列；具體是利用Tandem PepeatsFinder (version 4.07b)在線軟件掃描分析候選的SSR位點信息,將得到的結果進行篩選，篩選標準:(I)若匹配率(Percent Matches)為100%，則重復單元的重復長度為2 bp^lObp ;(2)若Percent Matches介于90%和100%之間，則重復單元的最小重復長度為10 bp ；
(3)重復數大于等于2 ;
53.根據S2得到的含有SSR位點的序列,利用引物設計軟件PrimerPremier 5.0合成SSR引物，得到36對Las-SSR引物(如表1所示)，引物設計參數主要包括:引物長度為15 bp~25 bp，退火溫度為45°C~65°C，GC含量為 40%~65%，PCR擴增產物長度為100 bp~600 bp,其中Las-ssr28位點的序列總長度大于600 bp，其預測的PCR擴增產物長度為1742 bp ；
54.用普通PCR的方法驗證S3得到的36對Las-SSR引物的特異性:選取I個黃龍病柑橘葉片樣品(陽性)和I個健康柑橘樣品(陰性)，剪取0.15 g柑橘葉片中脈，磨碎后用OMEGA公司的植物DNA提取試劑盒(產品號D2485-02)提取基因組總DNA。陽性樣品中包含柑橘基因組DNA和柑橘黃龍病菌亞洲種(6?.L.asiaticus)基因組DNA。利用1% (w/v)的瓊脂糖凝膠檢測提取的DNA的質量。以上述2個DNA樣品為模板，分別用所有設計的SSR引物進行篩選；陽性樣品能擴增出目的片段而陰性樣品不能擴增出該片段的引物為可用引物。篩選得到33對具有高穩定性、高擴增效率和較強特異性的Las-SSR可用引物(如表1中所示的33對可用引物)；
55.利用S4篩選到的33對Las-SSR可用引物對柑橘黃龍病菌亞洲種(CkL.進行遺傳多樣性分析:以柑橘黃龍病菌亞洲種(Ck L.asiaiicm)陽性DNA樣
品為模板進行PCR擴增；預測擴增片段小于500bp的PCR產物用聚丙烯酰胺凝膠電泳，預測片段大于1500bp的PCR產物以1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析，并測序比對；篩選出多態性非常好的18對SSR核心引物，其中17對SSR核心引物的PCR擴增片段均小于600bp，用聚丙烯酰胺凝膠電泳即可分辨。只有Las-ssr28預測的PCR擴增產物長度為1742 bp，還需使用瓊脂糖凝膠電泳來分析。
[0011]步驟S3 所述 36 對 Las-SSR 引物為 Las-ssrl~Las-ssr36，序列如 SEQ ID N0.1~ 72所示。
[0012]步驟S4所述33對Las-SSR可用引物分別為Las-ssrl~Las_ssr8、Las-ssrlO~Las-ssrl4、Las-ssrl6~Las_ssr20、Las_ssr22~Las_ssr36，引物序列如 SEQ IDN0.1~16、SEQ ID N0.19~28、SEQ ID N0.31 ~40、SEQ ID N0.43~72 所示。
[0013]步驟S5 所述 18 對 SSR 核心引物分別為 Las-ssrl、Las-ssr3、Las-ssr5、Las_ssr7、Las_ssrl2~14、Las_ssrl8、Las_ssr22、Las_ssr27~29、Las_ssr31 ~36，引物序列如 SEQ IDN0.1~2、SEQ ID N0.5~6、SEQ ID N0.9~10、SEQ ID N0.13~14、SEQ ID N0.23~28、SEQ IDN0.35~36、SEQ ID N0.43~44、SEQ ID N0.53~58、SEQ ID N0.61 ~72 所示。
[0014]本發明還提供了一種上述SSR分子標記引物體系鑒定和分析柑橘黃龍病菌遺傳多樣性的方法，其具體步驟是:
51.實驗材料的準備:選取典型斑駁癥狀的柑橘葉片，提取柑橘樣品葉中脈總DNA，采用國際上通用的柑橘黃龍病菌特異引物OIl和0I2c擴增16S rDNA片段，檢測為陽性的DNA樣品用于SSR遺傳多樣性分析；
52.以SI獲得的陽性的DNA為模板，利用本發明的SSR分子標記引物體系進行PCR擴
增；
53.對S2所述PCR擴增得到的PCR產物進行電泳、顯色，顯色結束后，拍照獲取譜帶信息，比較同一 SSR標記在不同菌株中的多態性；
54.結果統計及遺傳多樣性分析:讀取S3獲得的譜帶信息，以條帶位置為依據，最小片段的帶型為“1”，依次遞增；收集所有條帶類型信息，使用分析軟件分別計算SSR標記的多態性位點頻率(PPB)、Nei’ s基因多樣性指數(h)和Shannon’s信息指數(I)，反映菌株的遺傳多樣性；采用相關軟件方法進行分析，獲得UPGMA聚類圖。[0015]其中，步驟S2所述PCR擴增的體系為15 μ L:包括9.9 μ L滅菌ddH20，1.5 μ L含Mg2+ 的 IOXTaq bufferU.5 μ L 的 2.5 mM 的 dNTPs，0.8μ L 的 10 μ M 正反向引物混合液，20 ng樣品DNA模板及0.2 μ L的2.5 M/μ L Taq DNA聚合酶；
擴增程序為:94°C預變性5 min ;94°C變性30s、56°C退火40s、72°C延伸45s，循環35次；72°C 延伸 IOmin ；
步驟S3所述電泳優選為聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE電泳)，所述顯色為銀染顯色；
步驟S4所述分析軟件優選為P0PGENE1.32軟件，所述相關軟件方法優選為PowerMarkV3.0軟件中的N-J聚類方法。
[0016]本發明具有以下有益效果:
本發明提供了柑橘黃龍病菌亞洲種iCa.L.asiaticus)的全套SSR分子標記引物體系并篩選出核心引物，結合PAGE電泳的方法為該病原的遺傳多樣性研究開辟了新的途徑。與現有技術一次只能分析一個遺傳位點多樣性，本發明一次性涉及全基因組上分布的33個位點，效率大大提高，且足以對菌株遺傳多樣性進行批量區分，方法簡單，步驟少，易于操作，也克服了批量測序價格昂貴的問題。另外，較小的PCR體系(10 μ Π5 μ L)就能實現檢測目的，節省成本和實驗材料，所用的材料均為常規試劑或裝置，耗資少；數據的統計分析借助于已開發的軟件，可一次性處理所有數據。同時，首次結合PAGE電泳的方法克服了瓊脂糖凝膠電泳分辨率低的問題。
[0017]另外，本發明采用提取感染黃龍病的葉片總DNA的方法，一并提取得到黃龍病菌DNA,設計的黃龍病菌特異性引物能避免柑橘基因組DNA的干擾，克服了黃龍病菌無法獲得純培養等技術缺陷，具有很好的推廣應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為所有36對Las-SSR可用引物的常規PCR篩選結果；其中“ + ”表示攜帶柑橘黃龍病菌亞洲種(fe.L.asiaticus)的砂糖橘葉中脈DNA，表示健康砂糖橘葉中脈DNA。
[0019]圖2為9對Las-SSR核心引物擴增來自不同地區的32個柑橘黃龍病菌亞洲種(CkL.asiaticus)菌株的PAGE電泳多態圖。
[0020]圖3為9對Las-SSR核心引物擴增來自不同地區的32個柑橘黃龍病菌亞洲種(CkL.asiaticus)菌株的PAGE電泳多態圖。
[0021]圖4為我國6省的32個柑橘黃龍病菌亞洲種(Ck L.asiaticus)菌株基于SSR分析的條帶多樣性的聚類圖。
【具體實施方式】
[0022]以下結合附圖和具體實施例來進一步說`明本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明，本發明采用的試劑、設備及方法為本【技術領域】常規試劑、設備及方法。
[0023]實施例1本發明Las-SSR分子標記引物體系的篩選
1、利用Genebank數據庫中的Genome數據庫，查找得到gb I CPOO1677.5和gb I CP004005.1兩個柑橘黃龍病菌亞洲種(Ck L.asiaticus)全基因組序列，核苷酸全長分別為1.23 Mb和1.27 Mb。
[0024]本實施例所用分析軟件為SSR信息查找軟件Tandem Repeats Finder (version
4.07b)在線分析系統(http://tandem, bu.edu/trf/trf.html)和引物合成軟件 PrimerPremier 5.0。
[0025]實驗方法為常規PCR、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE )。
[0026]2、利用 SSR 檢索軟件 Tandem Repeats Finder (version 4.07b)查找 2 個基因組中的所有2-500個堿基重復基序的所有SSR位點信息,經篩選后得到36個SSR位點，篩選標準:(I)若匹配率(Percent Matches)為100%，則重復單元的重復長度為4 bp-10 bp ；
(2)若Percent Matches介于90%和100%之間，則重復單元的最小重復長度為10 bp ；(3)重復數大于等于2。
[0027]用Primer Premier 5.0軟件對這36個位點設計相應的SSR引物,設計得到36對Las-SSR引物(如表1所示)。引物設計參數主要包括:引物長度為15 bp~25 bp，退火溫度為450C~65。。，GC含量為40%~65%，PCR擴增產物長度為100 bp~600 bp，其中Las-ssr28位點的序列總長度大于600 bp，其預測的PCR擴增產物長度為1742 bp。
[0028]表1本發明中設計合成的柑橘黃龍病菌Las-SSR引物序列
【權利要求】
1.一種用于柑橘黃龍病菌遺傳多樣性分析的SSR分子標記引物體系，其特征在于，包括 33 對 Las-SSR 可用引物，分別為 Las-ssrl~Las_ssr8、Las-ssrlO~Las_ssrl4、Las_ssrl6~Las_ssr20、Las_ssr22~Las-ssr36,引物序列如 SEQ ID N0.1~16、SEQ IDN0.19~28、SEQ ID N0.31~40、SEQ ID N0.43~72 所示。
2.根據權利要求1所述SSR分子標記引物體系，其特征在于，所述33對Las-SSR可用引物中有18對為SSR核心引物，分別是Las-ssrl、Las_ssr3、Las_ssr5、Las_ssr7、Las_ssrl2~14、Las_ssrl8、Las_ssr22、Las_ssr27~29、Las_ssr31 ~36，引物序列如 SEQ IDN0.1~2、SEQ ID N0.5~6、SEQ ID N0.9~10、SEQ ID N0.13~14、SEQ ID N0.23~28、SEQ IDN0.35~36、SEQ ID N0.43~44、SEQ ID N0.53~58、SEQ ID N0.61 ~72 所示。
3.—種權利要求1或2所述SSR分子標記引物體系的構建方法，其特征在于，包括如下步驟: S1.柑橘黃龍病菌亞洲種全基因組序列的獲得:從Genebank中下載得到2個柑橘黃龍病菌亞洲種菌株序列，Genebank ID: gb I CP001677.5 和 gb I CP004005.1 ； S2.全基因組序列中SSR位點的鑒定:利用SSR檢索軟件獲得了36個含有SSR位點信息的序列； S3.根據S2得到的36個含有SSR位點的序列設計得到36對Las-SSR引物； S4.用普通PCR的方法驗證S3得到引物的特異性，篩選得到33對Las-SSR可用引物； S5.利用S4篩選到的33對Las-SSR可用引物對柑橘黃龍病菌亞洲種進行遺傳多樣性分析，篩選得到18對SSR核心引物； 其中，步驟S3所述36對Las-SSR引物為Las-ssrl~Las_ssr36，序列如SEQ ID N0.1~72所示； 步驟S4所述33對Las-SSR可用引物分別為Las-ssrl~Las_ssr8、Las-ssrlO~Las-ssrl4、Las-ssrl6~Las_ssr20、Las_ssr22~Las_ssr36，引物序列如 SEQ IDN0.1~16、SEQ ID N0.19~28、SEQ ID N0.31 ~40、SEQ ID N0.43~72 所示； 步驟 S5 所述 18 對 SSR 核心引物分別為 Las-ssrl、Las_ssr3、Las_ssr5、Las_ssr7、Las_ssrl2~14、Las_ssrl8、Las_ssr22、Las_ssr27~29、Las_ssr31 ~36，引物序列如 SEQ IDN0.1~2、SEQ ID N0.5~6、SEQ ID N0.9~10、SEQ ID N0.13~14、SEQ ID N0.23~28、SEQ IDN0.35~36、SEQ ID N0.43~44、SEQ ID N0.53~58、SEQ ID N0.61 ~72 所示。
4.一種利用權利要求1或2所述SSR分子標記引物體系分析柑橘黃龍病菌遺傳多樣性的方法，其特征在于，包括如下步驟: S1.實驗材料的準備:選取典型斑駁癥狀的柑橘葉片，提取柑橘樣品葉中脈總DNA，采用國際上通用的柑橘黃龍病菌特異引物OIl和0I2c擴增16S rDNA片段，檢測為陽性的DNA樣品進行SSR遺傳多樣性分析； S2.以SI獲得的陽性的DNA為模板，利用本發明的SSR分子標記引物體系進行PCR擴增； S3.對S2所述PCR擴增得到的PCR產物進行電泳、顯色，顯色結束后，拍照獲取譜帶信息，比較同一 SSR標記在不同菌株中的多態性； S4.結果統計及遺傳多樣性分析:讀取S3獲得的譜帶信息，以條帶位置為依據，最小片段的帶型為“1”，依次遞增；收集所有條帶類型信息，使用分析軟件分別計算SSR標記的多態性位點頻率、Nei's基因多樣性指數和Shannon’s信息指數，反映菌株的遺傳多樣性；采用相關軟件方法進行分析，獲得UPGMA聚類圖。
5.根據權利要求 4所述方法，其特征在于，步驟S3所述電泳為聚丙烯酰胺凝膠電泳。
【文檔編號】C12R1/01GK103667452SQ201310564327
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月14日 優先權日:2013年11月14日
【發明者】許美容, 鄧曉玲, 鄭正, 李昕昱, 洪紅霞, 朱青 申請人:華南農業大學