雙鏈siRNA分子及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了雙鏈siRNA分子及其應用，其中，該雙鏈siRNA分子由具有下述核苷酸序列的正義鏈和反義鏈組成：正義鏈：5′-GCAUCUCUACAUUCAAGAA-3′(SEQ?ID?NO：1)，反義鏈：5′-UUCUUGAAUGUAGAGAUGC-3′(SEQ?ID?NO：2)。該雙鏈siRNA分子能夠針對性地對survivin基因的轉錄后表達進行干擾，從而誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的有絲分裂，抑制腫瘤轉移時的血管形成和降低腫瘤細胞放化療的耐受性，進而能夠用于抗腫瘤藥物的制備。
【專利說明】雙鏈SiRNA分子及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫藥【技術領域】，具體涉及雙鏈SiRNA分子及其應用，更具體地，本發明涉及兩種雙鏈siRNA分子、質粒及其在制備抗腫瘤藥物中的應用、Survivin基因沉默試劑盒以及藥物。
【背景技術】
[0002]腫瘤的治療是長期困擾醫學界的世界性難題，盡管各種的治療方法不斷出現，但目前還沒有真正有效的根治方法。因此這也迫使科研工作者不斷尋找新的技術和方法，試圖抑制腫瘤增殖和轉移，進而從根本上攻克癌癥。
【發明內容】
[0003]本發明是基于發明人的下列發現而完成的:
[0004]腫瘤的治療是長期困擾醫學界的世界性難題，盡管各種的治療方法不斷出現，但目前還沒有真正有效的根治方法，因此這也迫使科研工作者不斷尋找新的技術和方法，試圖從根本上攻克癌癥。
[0005]RNA干擾技術是近幾年發展起來的被認為是研究功能基因組最有力工具之一。這種新興的生物技術為腫瘤分子水平的基因治療提供了新的技術和方法。RNA干擾，是由雙鏈 RNA(double stranded RNA, dsRNA)介導的轉錄后的基因沉默(post-transcriptionalgene silencing, PTGS)現象。通過在多種生物細胞內導入外源或內源的dsRNA可以使內源性mRNA發生特異性降解，從而引起相應基因轉錄的阻抑。RNAi已作為一種簡單有效的基因敲除的技術，廣泛地應用于功能基因組學研究以及抗病毒、抗腫瘤治療的研究中。
`[0006]survivin是1997年耶魯大學Aitieric.DC等人在人類基因組庫中首先篩選分離出來的IAP (凋亡抑制蛋白)家族的一個成員。它定位于17q25，全長15KB，含4個外顯子和3個內含子，基因編碼產物為由142個氨基酸組成的蛋白，分子量16.2KD，具有抑制細胞凋亡和調節細胞有絲分裂的雙重功能，是聯系細胞周期和細胞凋亡界面的重要因子。該基因幾乎在所有種類的腫瘤組織中特異性地表達，而正常組織幾乎沒有表達；該基因在腫瘤細胞中高表達后，不但促進腫瘤細胞抗凋亡、促進腫瘤細胞有絲分裂，還參與血管形成和放化療耐受:等多種功能，
[0007]進而，發明人認為，應用RNA干擾技術，以小分子RNA作為靶向藥物，有針對性地對survivin基因的轉錄后表達進行干擾，從而誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的有絲分裂，抑制腫瘤轉移時的血管形成和降低腫瘤細胞放化療的耐受性，多層次，多途徑對腫瘤進行抑制，這可能成為了一種新的腫瘤治療策略。而且survivin基因選擇性地表達在幾乎所有種類的腫瘤組織中，而正常組織幾乎不表達，則可使這種基因治療對正常組織和細胞的毒副作用降到最低，應用RNAi特異地抑制survivin等腫瘤相關基因的表達有望成為一種新的腫瘤基因治療方式。
[0008]本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在于公開一種高效的針對survivin基因的廣譜小分子干擾RNA(siRNA)。因而,根據本發明的一個方面，本發明還提出了一種雙鏈siRNA分子。根據本發明的實施例，該雙鏈siRNA分子由具有下述核苷酸序列的正義鏈和反義鏈組成:
[0009]正義鏈:5'-GCAUCUCUACAUUCAAGAA-3' (SEQ ID NO:1)，
[0010]反義鏈:5'-UUCUUGAAUGUAGAGAUGC-3' (SEQ ID NO:2)。
[0011]根據本發明的另一方面，本發明還提出了一種雙鏈siRNA分子。根據本發明的實施例，該雙鏈siRNA分子由具有下述核苷酸序列的正義鏈和反義鏈組成:
[0012]正義鏈:5'-GCAUCUCUACAUUCAAGAAX-3'，
[0013]反義鏈:5'-UUCUUGAAUGUAGAGAUGCX-3'，
[0014]其中X代表tt、TT或UU，t代表脫氧胸腺嘧啶。即X代表兩個脫氧胸腺嘧啶、兩個T或兩個U。在本發明的一個優選的實施方式中，上述序列中3'端的“X”為tt，即兩個脫氧胸腺嘧啶。
[0015]需要說明的是，該雙鏈siRNA分子的主干序列即為SEQ ID NO:1和2所示的核苷酸序列，即前面所述的正 義鏈和反義鏈分別具有SEQ ID NO:1和2所示核苷酸序列的雙鏈siRNA分子。
[0016]體外實驗證明,本發明的兩種雙鏈siRNA分子的反義鏈能夠特異性地與survivin基因的mRNA結合，降解其mRNA，從而能夠干擾轉錄后翻譯過程，誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞分裂、抑制腫瘤血管的生成。進一步，本發明的雙鏈siRNA分子能夠用于抗腫瘤藥物的制備，從而利用制備獲得的抗腫瘤藥物對患者進行給藥后，能夠有效實現Survivin基因沉默，誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤增殖及轉移，以及降低腫瘤細胞放化療的耐受性，達到治療腫瘤的目的。
[0017]為方便起見，在下文中，術語“siRNA”、“siRNA序列”或“siRNA分子”可以互換，它們表不的意思和范圍相同。
[0018]其中，根據本發明的實施例，siRNA序列可以是單鏈結構，也可以是雙鏈結構。
[0019]根據本發明的實施例,本發明的siRNA分子來源于針對survivin基因開放閱讀框的功能保守區，其優點在于所制備得到的siRNA隨機分布于survivin開放閱讀框區段，長度可控性分布于19-23bp，可以提高有效靶位點的命中率。
[0020]根據本發明的實施例，siRNA的制備可采用多種方法進行，比如:化學合成法、體外轉錄、酶切長鏈dsRNA、載體表達siRNA、PCR合成siRNA表達元件等，這些方法為研究者提供了可選擇的空間，從而能夠更好地獲得基因沉默效率。
[0021]根據本發明的又一方面，本發明還提出了一種質粒。根據本發明的實施例，所述質粒包含前面所述的任意一種雙鏈siRNA分子的脫氧核糖核酸序列。由此，利用該質粒轉染動物細胞，能夠使該動物細胞的Survivin基因沉默，進而誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞分裂、抑制腫瘤血管的生成，從而能夠有效治療腫瘤。進一步，該質粒能夠有效用于抗腫瘤藥物的制備，從而利用制備獲得的抗腫瘤藥物對患者進行給藥后，能夠有效實現Survivin基因沉默，誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞分裂、抑制腫瘤血管的生成，從而能夠有效治療腫瘤。
[0022]根據本發明的又一方面，本發明還提出了一種Survivin基因沉默試劑盒。根據本發明的實施例，所述試劑盒包含前面所述的任意一種雙鏈siRNA分子，或者質粒。發明人發現，利用本發明的試劑盒能夠有效將腫瘤患者的細胞進行Survivin基因沉默，誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞分裂、抑制腫瘤血管的生成，從而能夠有效治療腫瘤。
[0023]此外，根據本發明的實施例，本發明的SiRNA分子能夠作為抗腫瘤藥物的有效成分。其中，所述腫瘤包括肝癌、肺癌、白血病、胃癌、宮頸癌、多發性骨髓瘤、皮膚鱗癌、結腸癌、黑色素瘤、膀胱癌及骨肉瘤。
[0024]因而，根據本發明的又一方面，本發明還提出了前面所述的任意一種雙鏈SiRNA分子、或者質粒在制備抗腫瘤藥物中的應用。
[0025]根據本發明的實施例，所述腫瘤為選自肝癌、肺癌、宮頸癌、膀胱癌、白血病、皮膚鱗癌、胃癌、結腸癌、多發性骨髓瘤、骨肉瘤和黑色素瘤中的至少一種。
[0026]進而，根據本發明的再一方面，本發明還提供了一種抗腫瘤藥物。根據本發明的實施例，該抗腫瘤藥物包含前面所述的任意一種雙鏈siRNA分子，或者質粒。發明人驚奇地發現，利用該抗腫瘤藥物能夠誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞分裂、抑制腫瘤血管的生成，從而能夠有效治療腫瘤。
[0027]根據本發明的實施例，本發明的藥物的劑型可以為多種形式，只要適合于相應疾病的給藥、并且恰當地保持siRNA分子的活性即可。比如，對于注射用給藥系統，劑型可以是凍干粉。
[0028]根據本發明的實施例，所述藥物還包含藥學可接受的輔助劑。具體地，上述藥物劑型中可以包含任何藥學可 接受的輔助劑，只要其適合于相應的給藥體系、并且恰當地保持siRNA分子的活性即可。
[0029]根據本發明的實施例，所述腫瘤為選自肝癌、肺癌、宮頸癌、膀胱癌、白血病、皮膚鱗癌、胃癌、結腸癌、多發性骨髓瘤、骨肉瘤和黑色素瘤中的至少一種。
[0030]此外，根據本發明的另一些實施例，出于應用目的，還可以將本發明的SiRNA分子、表達該siRNA分子的DNA表達框、或者包含該siRNA分子表達框的質粒作為藥物直接給藥于受藥者身上特定部位，比如腫瘤組織。同樣能夠達到誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖和轉移，進而治療腫瘤的目的。
[0031]本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0032]本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0033]圖1顯示了根據本發明一個實施例,化學合成的siRNA對survivin基因沉默效果的檢測結果，其中，
[0034]圖1a顯示了 siRNA對癌細胞MGC-803的survivin基因沉默效果的檢測結果，
[0035]圖1b顯示了 siRNA對癌細胞Hep G2的survivin基因沉默效果的檢測結果，
[0036]圖1c顯示了 siRNA對癌細胞A549的survivin基因沉默效果的檢測結果，
[0037]圖1d顯示了 siRNA對癌細胞SMMC-7721的survivin基因沉默效果的檢測結果；
[0038]圖2顯示了根據本發明一個實施例，本發明的siRNA分子對癌細胞MGC-803、HepG2和SMMC-7721的survivin蛋白質表達的影響的Westernblot檢測結果,其中，[0039]圖2a顯示了 siRNA對癌細胞MGC-803的survivin蛋白質表達的影響的Westernblot檢測結果，
[0040]圖2b顯示了 siRNA對癌細胞Hep G2的survivin蛋白質表達的影響的Westernblot檢測結果，
[0041]圖2c顯示了 siRNA對癌細胞SMMC-7721的survivin蛋白質表達的影響的Westernblot檢測結果。
【具體實施方式】
[0042]下面詳細描述本發明的實施例。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。
[0043]實施例1:化學合成的siRNA對survivin基因沉默效果的檢測實驗
[0044]1.主要儀器、試劑和材料.[0045]1.1儀器:核酸合成儀(GE公司)、PCR儀(ABI公司);實時定量PCR儀(Bio-Rad)；細胞培養箱(Thermo)等。
[0046]1.2 材料和試劑=RFect siRNA 轉染試劑(BIO-TRAN)，DMEM 培養基(Gibco)，TurboCapture mRNA 試劑盒 (QIAGEN), SensiMix? one-step 試劑盒(Quantace)等。其他生化試劑均購于上海生工生物工程技術服務有限公司。
[0047]1-3PCR 引物:
[0048]survivin 正向引物:5' -cagtgtttcttctgcttcaagg-3'，
[0049]survivin 反向引物:5' -CTTTTTATGTTCCTCTATGGGGTC-3'，
[0050]GAPDH 正向引物；5' -CATCAGCAATGCCTCCTGCAC-3'，
[0051]GAPDH 反向引物:5' -TGAGTCCTTCCACGATACCAAAGTT-3'。
[0052]2.化學合成法制備siRNA
[0053]根據survivin基因的核苷酸序列設計小分子干擾RNA(s_siRNA_l),具體序列如下:
[0054]正義鏈:5'-GCAUCUCUACAUUCAAGAAdTdT-3' (SEQ ID NO:3)，
[0055]反義鏈:5'-UUCUUGAAUGUAGAGAUGCdTdT-3' (SEQ ID NO:4)，
[0056]其中，“dT”表示脫氧胸腺嘧啶。
[0057]將該序列在人類EST數據庫中比對，確定沒有與它相同的其它基因序列。
[0058]3.沉默效率驗證
[0059]3.1細胞培養:癌細胞MGC-803和H印G2在含10% FBS的DMEM培養基中，37°C、
5% CO2培養箱培養。
[0060]A549 和 SMMC-7721 在含 10% FBS 的 RPM1-1640 培養基中，37°C、5% CO2 培養箱培養。
[0061]3.2細胞鋪板并轉染:將細胞按IXlO4 /孔接種到24孔細胞培養板中，在37°C、5% CO2培養箱細胞培養24小時，在無雙抗含10% FBS的DMEM培養基中，轉染按照RNAiMAX?的說明書轉染，實驗分為未轉染組、陰性對照組和實驗組(12.5nM、25nM、50nM)，其中陰性對照組siRNA為通用對照RNA,與survivin基因的序列無同源性,濃度為50nM /孔。同時分別轉染 MGC-803、Hep G2、A549 和 SMMC-7721 細胞。[0062]3.3實時定量PCR檢測survivin基因mRNA水平:用mRNA提取純化試劑盒TurboCapture mRNA kit提取純化細胞RNA,操作按試劑盒說明書進行,用80 μ L無RNA酶水/孔溶解RNA，取4 μ LRNA為模板進行實時定量PCR反應。
[0063]用基因特異性引物檢測樣本中survivin mRNA表達水平，同時擴增看家基因GAPDH作為內參對照。每個反應做3個平行。建立如下25 μ L反應體系:4 μ L模板RNA，12.5 μ L2X SensiMix one-step，I μ L5'正向引物(6 μ Μ)，0.5 μ L50X SYBR Green I，用無RNA酶水補足體系至25 μ L。反應條件:40°C反轉錄30min，95°C預變性7分，95°C變性20秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，循環45次。
[0064]3.4結果分析:以GAPDH內參，用實時定量PCR2-A Δ。'法確定survivin mRNA表達量，并作出柱狀圖，結果見圖1。如圖1各圖所示，縱坐標表示survivin相對于GAPDH的mRNA表達水平；橫坐標表示五個處理實驗組，其中“未轉染”為未經任何處理的細胞樣品，NC-siRNA為濃度為50nM的陰性對照，其他三組為本發明siRNA轉染實驗組，濃度分別為
12.5nM、25nM、50nM。如圖1所示，a、b、C、d各圖分別顯示了 siRNA在癌細胞MGC-803、H印G2、A549和SMMC-7721里沉默survivin基因的效果，即轉染前后survivin的mRNA表達水平的變化，結果顯示本發明的siRNA靶標survivin基因的沉默效果明顯。
[0065]實施例2:survivn基因沉默對腫瘤細胞的抑制情況
[0066]按照以下步驟，利用MTT法檢測實施例1中制備的siRNA分子s-siRNA_l對腫瘤細胞的抑制情況:
[0067]細胞的生長情況通過MTT法進行檢測。將細胞按I X IO4 /孔接種到24孔細胞培養板中，在37°C、5% CO2培養箱細胞培養24小時，在無雙抗含10% FBS的DMEM培養基中，轉染按照RNAiMAX?的說明書轉染。接著37°C下孵育48h后，每孔加30μ--tΤ(5π^ / mL)，37°C下繼續孵育4h。吸取含有MTT的培養基，加入200 μ L 二甲基亞礬(DMSO)溶解甲攢晶體。然后，于492nm處測定其吸光度值。
[0068]小分子干擾RNA(s-siRNA-l)在25nM至IOOnM濃度，作用48小時后，MTT法檢測的對腫瘤細胞的抑制率情況，結果見表1。
[0069]表ls-siRNA-Ι作用于腫瘤細胞48小時的抑制率
[0070]
【權利要求】
1.一種雙鏈SiRNA分子，其特征在于，由具有下述核苷酸序列的正義鏈和反義鏈組成: 正義鏈:5' -GCAUCUCUACAUUCAAGAA-3' (SEQ ID NO:1)， 反義鏈:5' -UUCUUGAAUGUAGAGAUGC-3' (SEQ ID NO:2)。
2.一種雙鏈SiRNA分子，其特征在于，由具有下述核苷酸序列的正義鏈和反義鏈組成: 正義鏈:5' -GCAUCUCUACAUUCAAGAAX-3'， 反義鏈:5, -UUCUUGAAUGUAGAGAUGCX-3,， 其中X為tt、TT或UU，t代表脫氧胸腺嘧啶。
3.根據權利要求2所述的雙鏈SiRNA分子，其特征在于，所述正義鏈和反義鏈序列中3'端的X為tt。
4.一種質粒,其特征在于,所述質粒包含權利要求1-3任一項所述的雙鏈siRNA分子的脫氧核糖核酸序列。
5.一種Survivin基因沉默試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權利要求權利要求1-3任一項所述的雙鏈siRNA分子，或者權利要求4所述的質粒。
6.權利要求1-3任一項所述的siRNA分子、或者權利要求4所述的質粒在制備抗腫瘤藥物中的應用。
7.根據權利要求6所述`的應用，其特征在于，所述腫瘤為選自肝癌、肺癌、宮頸癌、膀胱癌、白血病、皮膚鱗癌、胃癌、結腸癌、多發性骨髓瘤、骨肉瘤和黑色素瘤中的至少一種。
8.一種抗腫瘤藥物，其特征在于，包含權利要求1-3任一項所述的雙鏈siRNA分子,或者權利要求4所述的質粒。
9.根據權利要求8所述的藥物，其特征在于，所述藥物還包含藥學可接受的輔助劑。
10.根據權利要求8所述的藥物，其特征在于，所述腫瘤為選自肝癌、肺癌、宮頸癌、膀胱癌、白血病、皮膚鱗癌、胃癌、結腸癌、多發性骨髓瘤、骨肉瘤和黑色素瘤中的至少一種。
【文檔編號】C12N15/113GK103695420SQ201310545856
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年11月7日 優先權日:2013年11月7日
【發明者】王天有, 余波, 唐鎖勤, 張曉敏, 張棪, 曲奎堯 申請人:首都兒科研究所, 杭州普施康生物科技有限公司, 中國人民解放軍總醫院