一種具有胰脂肪酶抑制作用的兒茶素氧化聚合物的制備工藝的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種具有胰脂肪酶抑制作用的兒茶素氧化聚合物的制備工藝，采用生物體外酶催化氧化模型，模擬茶葉發酵時發生的催化氧化反應，制備具有胰脂肪酶抑制作用的兒茶素氧化聚合物，包括以下步驟：兒茶素溶液的制備、梨汁混懸液的制備、兒茶素氧化聚合物的制備、兒茶素氧化聚合物的精制。本發明的反應速度易于人工控制，兒茶素氧化聚合物也易于檢測，具有較強的實踐應用價值及市場前景。
【專利說明】一種具有胰脂肪酶抑制作用的兒茶素氧化聚合物的制備工
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種聚合物的制備工藝，具體涉及采用生物體外酶催化氧化模型，模擬茶葉發酵時發生的催化氧化反應，制備具有胰脂肪酶抑制作用的兒茶素氧化聚合物的制備工藝。
【背景技術】
[0002]近年來隨著生活水平的提高，飲食結構以及生活習慣的變化，肥胖人群數量不斷增加，并且呈上升趨勢。目前，肥胖是人類最容易被忽視，但發病率卻急劇上升的一種慢性疾病，它與許多疾病的發生發展具有密切的相關性，如腦卒中、II型糖尿病、高血壓病、冠心病等。肥胖的根本原因是脂肪在體內積累過多，肥胖癥是營養代謝障礙性疾病，目前大部分肥胖的發生是由于機體營養過剩而導致能量攝入大于能量消耗而形成的單純性肥胖，其臨床特征是脂肪細胞的增多和體積的增大。研究表明，肥胖癥及其引起的多種疾病都伴隨著脂肪代謝及脂肪細胞功能的障礙。肥胖人群的脂肪代謝特點是血漿游離脂肪酸升高，膽固醇、甘油三酯、總脂等血脂成分普遍增高，機體對游離脂肪酸的動員利用減少，血中的游離脂肪酸積累，血脂容量升高。因此，如何干預防止脂肪在體內的過度積累和脂肪細胞的變化是預防和治療肥胖癥的關鍵。脂肪酶抑制劑作為一種控制腸道脂肪吸收的藥物，可以有效的控制脂肪過度攝取，預防肥胖癥，因此以天然產物為原料研發具有安全、高效的脂肪酶抑制劑類醫藥保健品具有良好的市場和開發前景。茶葉作為我國的傳統保健飲料有著三千多年的飲用歷史，其植物來源茶的葉片中主要化學成分是以表沒食子兒茶素沒食子酸酯(簡稱EGCg)為代表的一類兒茶素類化合物，是茶的主要生物活性成分。近年來多項研究表明，經過發酵處理的烏龍茶以及紅茶所含有的多酚類提取物對脂肪酶有著良好的抑制活性，可以有效的控制脂肪吸收，這類成分主要是兒茶素經過多酚氧化酶氧化反應形成的氧化聚合物。但是由于茶葉的發酵是一種茶葉片的內部自然發酵氧化過程，其反應速度不易人工控制，兒茶素氧化聚合物的生成也不易檢測。
【發明內容】
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[0003]本發明的目的是提供一種兒茶素氧化聚合物的制備方法，采用生物體外酶催化氧化模型，模擬茶葉發酵時發生的催化氧化反應，制備具有胰脂肪酶抑制作用的兒茶素氧化聚合物，其反應速度易于人工控制，兒茶素氧化聚合物也易于檢測，具有較強的實踐應用價值及市場前景。
[0004]為達到上述目的，本發明一種具有胰脂肪酶抑制作用的兒茶素氧化聚合物的制備工藝包括以下步驟:
[0005]I)兒茶素溶液的制備:在21_25°C下，將兒茶素含量為98%綠茶提取物與蒸餾水按lmg/0.2ml混合，攪拌至全部溶解，使其呈現透明澄清液體狀態；
[0006]2)梨汁混懸液的制備:稱取梨，梨與兒茶素含量為98%的綠茶提取物的質量比為50:1，使用粉碎機對梨進行充分粉碎，得到粉碎的梨汁，四層紗布濾去沉淀物，得到梨汁混懸液；
[0007]3)兒茶素氧化聚合物的制備:將步驟I)制得的兒茶素溶液與步驟2)制得的梨汁混懸液混合，通入空氣或氧氣，同時攪拌，使兒茶素溶液與梨汁混懸液混勻，在21-25°C下反應3-5個小時，通過薄層色譜法(TLC)或高效液相色譜法(HPLC)確認兒茶素被充分氧化及兒茶素氧化聚合物產生； [0008]4)兒茶素氧化聚合物的精制:將步驟3)所得的液體冷卻并過濾、濃縮后，逐漸加ADlOl大孔吸附樹脂層析柱中，用蒸餾水進行洗脫至無渾濁液體流出，再用95%乙醇進行洗脫至FeCl3顯色劑在洗脫液TLC薄層層析板不顯色，收集乙醇洗脫液進行減壓濃縮蒸餾，冷凍干燥處理，即得紅褐色兒茶素氧化聚合物干燥粉末。
[0009]所述的梨為新鮮果實，DlOl大孔吸附樹脂層析柱為醫藥級。
[0010]三氯化鐵的乙醇溶液為多酚類化合物的顯色劑，使用其對產品的TLC薄層層析板進行噴涂可以判斷是否洗脫液中存在兒茶素氧化聚合物。
[0011]由于采取了以上技術方案，本發明的優點在于:(1)本發明使用的兒茶素含量為98%綠茶提取物主要化學成分經高效液相色譜法(HPLC)分析，結果顯示其主要化學成分是兒茶素類化合物，是日常飲用茶葉的主要化學成分，這類化合物具有高度的生物安全性，未見任何毒性及副作用報道，同時具有抗氧化等多種生物學功能，將其作為原料用于胰脂肪酶抑制劑的研發具有高度的安全性和可靠性。(2)本發明涉及的氧化酶是一類來源于天然水果梨中的多酚氧化酶，它們大量地存在于新鮮的梨果實中，是一種來源穩定、氧化作用良好的多酚氧化酶。經過多項研究表明，新鮮梨汁在不加入任何物質的條件下，可以在室溫條件下穩定高效的催化氧化兒茶素類化合物。新鮮梨汁適合催化氧化具有酚羥基的多酚類化合物，兒茶素正是一類這樣的化合物。(3)利用新鮮梨汁中的多酚氧化酶進行催化的反應，反應底物及催化酶均來自天然產物，反應介質為水，反應過程中不產生其他具有毒副作用的化學副產物。同時在處理得到的兒茶素氧化聚合物時使用的大孔吸附樹脂層析柱為醫藥級，洗脫溶劑為蒸餾水和95%乙醇，符合食品及醫藥原料制備標準。(4)利用本發明的制備方法制備的兒茶素氧化聚合物經過實驗驗證具有較好的胰脂肪酶抑制活性。
【具體實施方式】
[0012]實施例1:
[0013]I)將Ig兒茶素含量為98%的綠茶提取物和200ml蒸餾水加入帶有攪拌磁子的燒杯中，在21-25°C下使用磁力攪拌器均勻攪拌，攪拌至其呈現澄清透明液體狀態；
[0014]2)在粉碎機中加入50g梨新鮮果實及300ml蒸餾水，充分粉碎，得到粉碎的梨汁，四層紗布濾去沉淀物，得到梨汁混懸液；
[0015]3)將步驟2)制得的梨汁混懸液加入到步驟I)配置好的溶液中，在燒杯中通入氧氣，同時用磁力攪拌器攪拌，使梨汁均勻分布于燒杯液體中，在21-25°C下反應3小時，通過薄層色譜法(TLC)或高效液相色譜法(HPLC)確認兒茶素完全被氧化，及兒茶素氧化聚合物
產生；
[0016]4)將步驟3)所得的液體冷卻并過濾、濃縮后，逐漸加入裝有醫藥級DlOl大孔吸附樹脂的層析柱中，用3倍柱體積蒸餾水進行洗脫，至無渾濁液體流出，再加入95%乙醇進行洗脫至至FeCl3顯色劑在洗脫液TLC薄層層析板不顯色，收集乙醇洗脫液進行減壓濃縮蒸餾，冷凍干燥處理，即得紅褐色兒茶素氧化聚合物干燥粉末，其產率為89%。
[0017]實施例2:
[0018]I)將2g兒茶素含量為98%的綠茶提取物和400ml蒸餾水加入帶有攪拌磁子的燒杯中，在21-25°C下使用磁力攪拌器均勻攪拌，攪拌至其呈現澄清透明液體狀態；
[0019]2)在粉碎機中加入100g梨新鮮果實及600ml蒸餾水，充分粉碎，得到粉碎的梨汁，四層紗布濾去沉淀物，得到梨汁混懸液；
[0020]3)將步驟2)制得的梨汁混懸液加入到步驟I)配置好的溶液中，在燒杯中通入氧氣，同時用磁力攪拌器攪拌，使梨汁均勻分布于燒杯液體中，在21-25°C下反應4小時，通過薄層色譜法(TLC)或高效液相色譜法(HPLC)確認兒茶素完全被氧化，及兒茶素氧化聚合物
產生；
[0021]4)將步驟3)所得的液體冷卻并過濾、濃縮后，逐漸加入裝有醫藥級DlOl大孔吸附樹脂的層析柱中，用3倍柱體積蒸餾水進行洗脫，至無渾濁液體流出，再加入95%乙醇進行洗脫至FeCl3顯色劑在洗脫液TLC薄層層析板不顯色，收集乙醇洗脫液進行減壓濃縮蒸餾，冷凍干燥處理，即得紅褐色兒茶素氧化聚合物干燥粉末，其產率為84%。
[0022]實施例3:
[0023]I)將5g兒茶素含量為98%的綠茶提取物和1000ml蒸餾水加入帶有攪拌磁子的燒杯中，在21-25°C下使用磁力攪拌器均勻攪拌，攪拌至其呈現澄清透明液體狀態；
[0024]2)在粉碎機中加入250g梨新鮮果實及1000ml蒸餾水，充分粉碎，得到粉碎的梨汁，四層紗布濾去沉淀物，得到梨汁混懸液；
`[0025]3)將步驟2)制得的梨汁混懸液加入到步驟I)配置好的溶液中，在燒杯中通入氧氣，同時用磁力攪拌器攪拌，使梨汁均勻分布于燒杯液體中，在21-25°C下反應5小時，通過薄層色譜法(TLC)或高效液相色譜法(HPLC)確認兒茶素完全被氧化，及兒茶素氧化聚合物
產生；
[0026]4)將步驟3)所得的液體冷卻并過濾、濃縮后，逐漸加入裝有醫藥級DlOl大孔吸附樹脂的層析柱中，用3倍柱體積蒸餾水進行洗脫，至無渾濁液體流出，再加入95%乙醇進行洗脫至FeCl3顯色劑在洗脫液TLC薄層層析板不顯色，收集乙醇洗脫液進行減壓濃縮蒸餾，冷凍干燥處理，即得紅褐色兒茶素氧化聚合物干燥粉末，其產率為80%。
[0027]實驗例:將上述實施例1~實施例3制備的兒茶素氧化聚合物與胰脂肪酶抑制劑藥物奧利司他和98%茶多酚的胰脂肪酶抑制效果進行比較。
[0028]將實施例1~實施例3制備的兒茶素氧化聚合物分別精密稱量lmg/ml，并分別稀釋至0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml,以浙江海正藥業股份有限公司生產的胰脂肪酶抑制劑藥物奧利司他作為對照品，分別配置同等濃度溶液，動物來源的胰脂肪酶由sigma公司提供，進行體外酶活性抑制研究，實驗步驟如下:
[0029]I)緩沖液的配制:精確稱取7880mg的Tris-HCl置于燒杯中，加500ml超純水，用2mol / L 的 NaOH 調 pH=8.2。
[0030]2)底物溶液的配制:8.4mg乙酸鈉溶于20ml的l%Triton X-100,加入40mgpNP_Laurate,得 0.2%pNP-Laurate。
[0031]3)酶液的配制:100mg 的胰脂肪酶(CAS:9001-62_1，sigma_L3126)溶于 IOml 的緩沖液中，離心lOOOOg，5min,上清液即為酶液。
[0032]4.分3組分別加入如下體積的上述1，2，3步驟中配制的溶液
[0033]Blank組:100u I緩沖液，100 U I樣品溶液(抑制劑)，100 U I底物；
[0034]Control 組:100u I 酶液，100 U I 緩沖液，100 U I 底物；
[0035]Sample組:100u I酶液，100 U I樣品溶液(抑制劑)，100 U I底物。
[0036]5.各實驗組均在37°C下孵育45min,離心lOOOOg, 5min,于405nm下用酶標儀測OD值。
[0037]6.抑制率及各成分IC5tl的計算:
[0038]抑制率=(ODcontrol— ODsafflple) / ODcontrol X 100% Cblanlt 組調零)
[0039]用excel軟件計算各組分對胰脂肪酶的抑制率和IC5tl值，進行比較分析。其抑制活性結果如下:
[0040]1、實施例1 [0041]
【權利要求】
1.一種具有胰脂肪酶抑制作用的兒茶素氧化聚合物的制備工藝，其特征在于包括以下步驟: 1)兒茶素溶液的制備:在21~25°C下，將兒茶素含量為98%綠茶提取物與蒸餾水按lmg/0.2ml混合，攪拌至全部溶解，使其呈現透明澄清液體狀態； 2)梨汁混懸液的制備:稱取梨，梨與兒茶素含量為98%的綠茶提取物的質量比為50:1，使用粉碎機對梨進行充分粉碎，得到粉碎的梨汁，四層紗布濾去沉淀物，得到梨汁混懸液； 3)兒茶素氧化聚合物的制備:將步驟I)制得的兒茶素溶液與步驟2)制得的梨汁混懸液混合，通入空氣或氧氣，同時攪拌，使兒茶素溶液與梨汁混懸液混勻，在21~25°C下反應3~5個小時，通過薄層色譜法或高效液相色譜法確認兒茶素被充分氧化及兒茶素氧化聚合物產生； 4)兒茶素氧化聚合物的精制:將步驟3)所得的液體冷卻并過濾、濃縮后，逐漸加入DlOl大孔吸附樹脂層析柱中，用蒸餾水進行洗脫至無渾濁液體流出，再用95%乙醇進行洗脫至FeCl3顯色劑在洗脫液TLC薄層層析板不顯色，收集乙醇洗脫液進行減壓濃縮蒸餾，冷凍干燥處理，即得紅褐色兒茶素氧化聚合物干燥粉末。
2.根據權利要求1所述的一種具有胰脂肪酶抑制作用的兒茶素氧化聚合物的制備工藝，其特征在于:所述的梨為新鮮果實。
3.根據權利要求1所述的一種具有胰脂肪酶抑制作用的兒茶素氧化聚合物的制備工藝，其特征在于:D101大孔吸附樹脂層析柱為醫藥級。
【文檔編號】C12P17/16GK103642866SQ201310551801
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月8日 優先權日:2013年11月8日
【發明者】李巖, 段靜雨, 么煥開, 崔文, 李勇, 艾鳳偉 申請人:徐州醫學院