一種高效表達米曲霉脯氨酰內肽酶的基因工程菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種高效表達米曲霉脯氨酰內肽酶的基因工程菌及其應用，是將基因S2導入畢氏酵母（Pichia?pastoris）進行高效表達；所述基因S2編碼一種新的脯氨酸特異性內切蛋白酶，核苷酸序列如以下1）或2）所示：1）其核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1，SEQ?ID?NO.2所示核苷酸序列；2）在1）限定的核苷酸序列基礎上經堿基的缺失、取代、插入或突變而成且具有編碼有活性的脯氨酸特異性內切蛋白酶的核苷酸序列。所得重組酶具有脯氨酸特異性內切蛋白酶活性以及耐酸性環境等優點，對提高啤酒，葡萄酒，果汁飲品等非生物穩定性具有明顯效果，具有重大應用潛力。
【專利說明】一種高效表達米曲霉脯氨酰內肽酶的基因工程菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種高效表達脯氨酸特異性內切蛋白酶的酵母工程菌及其應用，屬于生物工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]蛋白酶是具有催化蛋白水解生成胨、腙、多肽、氨基酸的一大類酶。蛋白酶按作用方式可分為內外肽酶；按活性中心分為絲氨酸蛋白酶，巰基蛋白酶，金屬蛋白酶和羧基蛋白酶；按照蛋白酶來源分為植物，動物，微生物蛋白酶。其中絲氨酸蛋白酶是一類以絲氨酸為活性中心的重要的蛋白水解酶，在生物有機體中起著重要而廣泛的生理作用。絲氨酸蛋白酶家族成員非常龐大，分為81類，例如胰臟分泌的消化胰酶蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、糜蛋白酶、血液凝固中的凝血酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶以及氨肽酶等都屬于絲氨酸蛋白酶家族。絲氨酸蛋白酶活性部位都含有Ser、His、Asp,并具有相同的催化機制,但是他們與底物結合部位的差異決定了各自對底物的專一性，正由于這種結構上微小變化，從而引起其在功能上的差異。并且，由于絲氨酸蛋白酶在結構上全為β蛋白，核心結構由兩個非常相似的結構域(N結構域和C結構域)，這兩個結構域在結構上的差異導致它們在功能和進化上的作用差異。脯氨酸特異性內切蛋白酶，也稱脯氨酰內肽酶(proline specificendoprotease, prolyl endopeptidase,簡稱PEP) [EC.3.4.21.26]或腦氨酸寡妝酶，屬于絲氨酸蛋白酶中一種新的家族，該家族能專一性地水解多肽中脯氨酸殘基的羧基端肽鍵，含有典型的絲氨酸蛋白酶家族的G-X-S-X-G/A高度保守序列，但是活性位點Ser周圍的氨基酸殘基和其他典型的絲氨酸蛋白不同，而且與已知的絲氨酸蛋白酶家族(包括胰蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶，羧肽酶Y)相比，在一級結構上同源性很低。
[0003]脯氨酸(Pro)是唯一具有亞氨結構的氨基酸，其環狀結構影響了與其它氨基酸形成肽鍵時的空間構象。脯氨酸特異性內切蛋白酶對Pro在多肽中的位置和成鍵的構型都有很強的專一性，且能夠特異性`水解小分子量多肽中脯氨酸羧基端肽鍵。因此，可以應用于食品工業、醫藥、多肽工業等領域；同時可以作為一種分子生物學的工具酶，應用于蛋白質序列測定，肽譜分析、特異位點的酶切、肽鏈的修飾以及加工等。
[0004]特別地，在食品工業方面，由于蛋白質水解產物可以為特定人群提供營養補充，因此有廣泛的市場效應。來自乳清產品特別受歡迎的原因在于其極好的口感及良好的可溶性。但是，目前這些酪蛋白水解產物還未獲得廣泛的流行，缺乏市場滲透力的主要原因在于酪蛋白水解過程中所產生的苦味，這種出現苦味的情況代表了一個技術問題，目前在食品工業上還沒有解決。但是可以確定的是苦味通常是很多蛋白質的水解產物，研究表明，苦味和幾個特別的苦味肽相關，而不是大量的普遍的苦味肽。Matoba發現水解氨基酸C末端或N末端位置的肽類可以出現較少的苦味，而水解氨基酸涉及肽鍵兩端的肽類的苦味則更多。酪蛋白富含疏水性氨基酸尤其是脯氨酸，Caprralla發現水解產物顯著脫苦味伴隨著疏水肽類出現的選擇性降解。眾所周知，包含脯氨酸殘基的肽鍵很難被已知可購買的工業用酶切開。脯氨酸殘基在肽的羧基末端的高發生率與低的苦味相關，并且證明了羧基末端脯氨酸殘基預期的高發生率只能用高濃度的脯氨酸特異性內切蛋白酶來實現。
[0005]因此，在食品工業中，脯氨酸特異性內切蛋白酶不僅在解除直接與抑制苦味相關的苦味肽獲得優質的蛋白質水解產物應用顯示出了無以倫比的優越性，還在不直接與抑制苦味相關，比如將減少食物蛋白質的變應原性；減緩所得生面團制作面包的腐敗；生成富含脯氨酸的肽作為各種食物或營養產品的理想添加劑，以增強蛋白質利用。尤其引人注目的是，該酶還可以用于啤酒釀造，解決啤酒實際生產過程中的冷混濁問題。主要是因為大麥蛋白質中富含脯氨酸序列很豐富，且在他們非發芽的形式時谷類蛋白質是極其難以降解成生產適當的可發酵的麥芽汁所必需的游離氨基酸。
[0006]目前已經發現的脯氨酸特異性內切蛋白酶主要有:一是來自于動物的脯氨酸特異性內切蛋白酶類。二是來自于植物的脯氨酸特異性內切蛋白酶類。它們主要存在于菠菜，蘑菇菌類等，主要是雙孢子蘑菇。三是來自于微生物的脯氨酸特異性內切蛋白酶。目前已在細菌如腦膜敗血性黃桿菌屬，黃單胞菌屬，嗜水氣單胞菌，產氣單胞菌屬，假單胞菌屬，假平胞菌莢膜，鹽生鹽桿菌和曲霉中發現該酶的存在，并且克隆得到編碼腦膜敗血性黃桿菌屬(Genbank:M81461.1),嗜水氣單胞菌(Genbank:D14005.1),產氣單胞菌(Genbank:AF065429)，假平胞菌莢膜(Genbank:ABO10298)，黃色粘球菌(Genbank: ABF89794)以及煙曲霉(Genbank: XM744168 )和黑曲霉(Genbank: AX458699 )的核苷酸序列，然而，除假平胞菌屬，鹽生鹽桿菌和黑曲霉外，其他六種微生物都屬于病原性微生物。
[0007]近年來，脯氨酸特異性內切蛋白酶的研究成為熱點，因其在食品行業上具有誘人的應用前景毋庸置疑，已經引起了越來越多國內外食品研究工作者們的青睞。國外已有商業酶應用在啤酒行業中，以抑制瓶裝啤酒中混濁的形成，雖然商品酶價格十分昂貴，但在國內仍舊處于壟斷地位。究其原因在于食品安全級微生物產脯氨酸特異性內切蛋白酶自然酶活較低，分離純化困難，基因工程菌研究很少，從而限制了對其生理功能和性質的研究，相應地，國內對該酶的研究也非常滯后，并未建立相關的研究體系。
[0008]米曲霉是美國食`品藥品管理機構認定的生物安全菌，從米曲霉中提取脯氨酸特異性內切蛋白酶應用于藥品食品行業安全可靠。然而，迄今為止，即使在95年有日本專利顯示從產醬油米曲霉菌株中發現具有脯氨酸特異性內切蛋白酶活性，但是國內外有關米曲霉脯氨酸特異性內切蛋白酶編碼序列和制備方法的未見任何報道。因此，研究新型米曲霉脯氨酸特異性內切蛋白酶基因并實現規模化生產具有重要研究意義和應用價值。本研究根據黑曲霉(Genbank:AX458699)和煙曲霉(Genbank:EDP53789)來源的脯氨酸特異性內切蛋白酶蛋白質序列設計引物，從篩選獲得的米曲霉中成功調取獲得米曲霉的脯氨酸特異性內切蛋白酶基因序列，發現其與黑曲霉(Genbank: AX458699 )和煙曲霉(Genbank:EDP53789)來源的脯氨酸特異性內切蛋白酶蛋白序列的同源性分別僅為19.5%和21%，并驗證了其脯氨酸特異性內切蛋白酶功能與應用價值。進一步通過在NCBI上進行BLASTp相似性檢索,發現已報道全基因組測序的米曲霉Aspergillus oryzae RIB40中機器自動注釋的基因Genbank:ΧΜ_001825944.2與本研究調取基因序列一致，但是該條目基因Genbank:ΧΜ_001825944.2被預測為絲氨酸蛋白酶，未做其它任何相關研究。
【發明內容】
[0009]本發明要解決的技術問題是提供一種高效表達米曲霉脯氨酸特異性內切蛋白酶的酵母工程菌，是將蛋白酶基因S2導入Pichia pastoris得到的酵母工程菌；
[0010]所述基因S2的序列一種新的脯氨酸特異性內切蛋白酶基因以及基于畢赤酵母密碼子偏愛性的重組內切脯氨酸特異性內切蛋白酶基因序列，其特征在于其核苷酸序列如以下I)或2)所示:
[0011]I)其核苷酸序列為SEQ ID N0.1，SEQ ID N0.2所示核苷酸序列；
[0012]2)在I)限定的核苷酸序列基礎上經堿基的缺失、取代、插入或突變而成且具有編碼有活性的脯氨酸特異性內切蛋白酶的核苷酸序列。
[0013]所述畢氏酵母為GS115，KM71或SMD1168，其中優選GS115。
[0014]所述基因編碼的蛋白質及含有所述基因的轉基因細胞系、基因工程菌、表達載體或克隆載體均屬于本發明保護的范圍。
[0015]本發明要解決的第二個技術問題是提供一種高產脯氨酸特異性內切蛋白酶的重組畢赤酵母工程菌及其構建、表達方法。
[0016]所述高產脯氨酸特異性內切蛋白酶的重組畢赤酵母的構建方法為選取重組畢赤酵母表達載體PPIC9，構建重組表達載體pPIC9-S2，以畢赤酵母GSl 15為宿主進行表達，具體步驟如下:
[0017](I)提取米曲霉A.0ryzae (中國微生物菌種庫保藏編號:CICC40214)總RNA，進行反轉錄獲取cDNA，以所獲得cDNA為模板，利用簡并引物gl和g2進行PCR擴增保守區，經過NCBI，EMBL數據庫比對，找 出同源性最高的序列；然后以所得序列為模板，利用引物g3和g4通過PCR擴增得到1743bp的米曲霉全長脯氨酸特異性內切蛋白酶；
[0018](2)設計引物g5和g6,利用PCR向A.0ryzae脯氨酸特異性內切蛋白酶的DNA編碼框5’和3’兩側分別引入SnaBI和Not I限制性酶切位點(不帶信號肽)；(下劃線顯示)；
[0019](3)選取畢赤酵母表達載體PPIC9，構建重組表達載體pPIC9-S2，將重組表達質粒PPIC9-S2轉化畢赤酵母GSl 15，通過G418抗生素平板篩選陽性轉化子并測序驗證；
[0020]所述PCR引物
[0021]gl:5-RASMTWSRYATYASGGRA-3
[0022]g2:5-SVBYCBCYMBRGRKMANRNTB-3
[0023]g3:5/ -ATGAACCTAGAAAAATTTGTTGACGAGCTG-3/ ，
[0024]g4:5' -TTACTGGATGATATCCATCGGCCGCATC-3,
[0025]g5:5’-CGGTACGTATTGGGGT TGTTTAGAGG-3’
[0026]g6:5，-CCGCGGCCGCCTACATCACCGCCCCCTTTG-3，
[0027]所述重組菌生產脯氨酸特異性內切蛋白酶的步驟為:將電轉化線性化重組表達質粒pPIC9-S2的陽性重組畢赤酵母GS115/pPIC9-S2在20-30 V、100-250rpm條件下培養至0D6QQ=2.0-6.0,隨后轉入10-28°C培養并加入終濃度為0.1-2.0%的甲醇，誘導表達30-120h，轉速 100-250rpm。
[0028]本發明首次從A.0ryzae中分離、鑒定了脯氨酸特異性內切蛋白酶基因，由于A.0ryzae野生菌株的脯氨酸特異性內切蛋白酶表達水平低，遠遠達不到工業化應用要求，因此選用畢赤酵母重組表達系統生產脯氨酸特異性內切蛋白酶能大幅提高其產量，使更易達到工業化應用要求。本發明利用畢赤酵母GS115成功構建了一株高可溶性表達A.0ryzae脯氨酸特異性內切蛋白酶蛋白的酵母工程菌，并對表達的脯氨酸特異性內切蛋白酶蛋白進行了純化。所得重組酶對酸性、高溫和酶抑制劑均有很好的耐受性。
[0029]本發明對純化獲得的重組脯氨酸特異性內切蛋白酶進行了最適作用pH、pH穩定性、最適作用溫度及溫度穩定性分析。結果表明該脯氨酸特異性內切蛋白酶以Z-Gly-Pro-pNA為底物時,最適作用pH為5.0,最適作用溫度為40°C ;結果還顯示該脯氨酸特異性內切蛋白酶PH穩定性及溫度穩定性都非常好。
[0030]本發明要解決的另外一個技術問題是提供上述重組脯氨酸特異性內切蛋白酶在提高啤酒，葡萄酒，果汁飲品等非生物穩定性中的應用，尤其是對提高啤酒非生物穩定性的應用。
[0031]本發明分析了純化的脯氨酸特異性內切蛋白酶對啤酒非生物穩定性的影響，數據表明試驗樣(添加脯氨酸特異性內切蛋白酶)的非生物穩定性指標(冷混濁)優于對照樣，6+1冷熱混濁實驗結果能夠達到相應的貨架期要求，并且成品啤酒貯存期間(六周)對照組的起始濁度和貯存過程中的濁度增加明顯高于試驗組。以上數據表明該重組脯氨酸特異性內切蛋白酶具有很好提高啤酒非生物穩定性的效果，具有較大應用潛力。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0032]圖1為PCR擴增的A.0ryzae脯氨酸特異性內切蛋白酶基因S2、蛋白質序列的功能區預測及BLASTp相似性檢索部分結果；(A)M:DL2000Marker ；1:脯氨酸特異性內切蛋白酶基因S2 ;(B) A.0ryzae脯氨酸特異性內切蛋白酶蛋白序列保守功能區預測。
[0033]圖2是本發明實施例2的信號肽預測結果圖；
[0034]圖3是本發明實施例2的利用“同源建模”法預測及其軟件分析的米曲霉脯氨酸特異性內切蛋白酶功能結構圖示；
[0035]圖4是本發明實施例3的pPIC9-S2酶切鑒定圖；
[0036]圖5是本發明實施例3的pPIC9-S2SDS-PAGE及native-SDS-PAGE電泳結果圖。
[0037]圖6是脯氨酸特異性內切蛋白酶應用于提高啤酒非生物穩定性的結果圖。
【具體實施方式】
[0038]在本發明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。
[0039]下面結合具體的制備實施例和應用實施例，并參照數據進一步詳細地描述本發明。應理解，這些 實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。
[0040]在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。
[0041]實施例1A.0ryzae脯氨酸特異性內切蛋白酶基因的獲得
[0042]根據產氣單胞菌(Genbank:AF065429)，假平胞菌莢膜(Genbank: AB010298)，黃色粘球菌(Genbank:ABF89794)以及煙曲霉(Genbank:XM744168)和黑曲霉(Genbank:AX458699)來源的脯氨酸特異性內切蛋白酶蛋白質序列設計簡并引物如下:
[0043]gl:5-RASMTWSRYATYASGGRA-3 ；
[0044]g2:5-SVBYCBCYMBRGRKMANRNTB-3 ；
[0045]以米曲霉cDNA為模板，gl和g2為引物進行PCR后，得到1000bp的產物片段，將產物進行測序后，在NCBI比對后，發現其均與A.0ryzae蛋白酶基因(Sequence ID:ΧΜ_001825944.2)的保守序列同源性較高。
[0046]進而，我們根據GenBank數據庫中已公開的A.0ryzae蛋白酶基因(Sequence ID:ΧΜ_001825944.2)序列，重新設計引物，進行PCR，其步驟如下:
[0047]根據NCBI公共數據庫的序列信息設計5’端和3’端引物，以米曲霉I號菌株的cDNA為模板，采用RT-PCR的方法獲得米曲霉脯氨酸內切蛋白的全長編碼序列S2。
[0048]1.引物設計(下劃線為酶切位點，酶切位點為保護堿基，有效序列為酶切位點后序列)
[0049]g3:5 ’ -CGGTACGTAATGCGTTTCGACCTCTTTCTAAT-3，(SEQ ID.3)
[0050]g4:5? -CCGCGGCCGCCTACTACATCACCGCCCCCTTTGTTAT-3，(SEQ ID.4)
[0051]2.RT-PCR
[0052]
【權利要求】
1.一種高效表達脯氨酸特異性內切蛋白酶的酵母工程菌，其特征在于是將基因S2導入畢氏酵母(Pichia pastoris)進行高效表達；所述基因S2編碼一種新的脯氨酸特異性內切蛋白酶，核苷酸序列如以下I)或2)所示: 1)其核苷酸序列為SEQID N0.1，SEQ ID N0.2所示核苷酸序列；
2)在I)限定的核苷酸序列基礎上經堿基的缺失、取代、插入或突變而成且具有編碼有活性的脯氨酸特異性內切蛋白酶的核苷酸序列。
2.權利要求1所述的酵母工程菌，其特征在于所述畢氏酵母為GS115，KM71或SMDl168。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述畢氏酵母優選GS115。
4.一種構建權利要求1所述酵母工程菌的方法，其步驟如下: (1)設計引物，利用PCR獲得基因S2序列，并對其密碼子進行改造； (2)通過雙酶切、連接將蛋白酶基因S2插入到表達質粒pPIC9，pPIC3K，pPIC9K，PA0815和或pPICZ α系列及其類似載體； (3)將步驟2)獲得的載體轉化畢赤酵母GS115，ΚΜ71或SMDl168，獲得酵母工程菌，通過G418抗生素平板篩選陽性轉化子并進行測序驗證。
5.權利要求4所述的方法，其特征在于優選載體及宿主組合為PPIC9和畢赤酵母GS115。
6.以權利要求1所述酵母工程菌生產脯氨酸特異性內切蛋白酶的方法，其步驟如下: Cl)將權利要求1獲得的酵母工程菌在20-30 °c、100-250rpm條件下培養至OD600=2.0-6.0 ； (2)隨后轉入20-30°C培養并加入終濃度為0.1-1.0%的甲醇，誘導表達30-120h，轉速100-250rpmo
7.—種權利要求1所述酵母工程菌在提高啤酒，葡萄酒，果汁飲品及其他非生物穩定性產品的應用。
【文檔編號】A23L2/84GK103602605SQ201310568071
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月14日 優先權日:2013年11月14日
【發明者】喻曉蔚, 徐巖, 康超 申請人:江南大學