基于擬南芥pri-miR828基因的植物表達載體及其構建和應用的制作方法

基于擬南芥pri-miR828基因的植物表達載體及其構建和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于擬南芥pri-miR828基因的植物表達載體pC2300-pOT2-At-pri-miR828，以及該植物表達載體的構建方法和應用，所述植物表達載體pC2300-pOT2-At-pri-miR828中含有At-pri-miR828基因以及pOT2克隆載體CaMV35s啟動子，具有SEQIDNO.5所示的核苷酸序列。本發明所構建的植物表達載體轉染植物后，可獲得高表達At-pri-miR828基因的植株，并調控植物中花青素的生物合成。
【專利說明】基于擬南芥Pr 1-mi R828基因的植物表達載體及其構建和
應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程【技術領域】，具體涉及一種擬南芥pr1-miR828基因的植物重組表達載體，以及該重組表達載體的構建及應用。
【背景技術】
[0002]MicroRNA (miRNA)，也稱微小RNA，是一類內源性的單鏈非編碼小分子RNA，長度約為21-24個核苷酸。miRNA介導了一種新的基因表達調控模式，在植物體內，主要在轉錄后水平通過與靶mRNA的互補配對來負調控靶mRNA的轉錄或翻譯。miRNA的表達比蛋白基因更迅速，并且不受翻譯過程的影響，所以對目標基因的表達調控效率更高。作為重要的調節分子，miRNA介導的基因表達調控在植物器官的形態建成、生長發育、激素分泌、信號轉導以及與環境互作等多種生理生化過程中起重要作用。
[0003]MicroRNA828 (miR828)是新近測序發現的生物學功能還未全面研究的一種miRNA。在擬南芥thaliana, At)中，通過生物信息學預測和5’ RACE體外剪切實驗發現，miR828 的靶基因為SiRNA 4)、PAP1/MYB75 琳 PAP2/MYB90 {PRODUCTION OF ANTHOCYANIN PIGMENT I and 2)以及 MYBl 13 (Rajagopalan etal., Genes Dev,2006,20:3407-3425 ;Luo et al., Plant Mol Biol,2012,80:117-129)。PAPl和#7377J屬于MYB轉錄因子，在植物發育過程中參與花青素、黃酮類、苯基丙酸類等次生代謝物的合成。Zuluaga等(Funct Plant Biol, 2008, 35:606-618)發現超表達/^/^/#7沒75轉錄因子導致轉基因番茄植株花青素合成增加。謝燁等(植物生理學報，2013年02期)的最新研究表明，miR828負調控擬南芥蔗糖誘導下花青素的生物合成。通過生物信息學方法預測，在番爺中，miR828的祀基因為乙烯不敏感基因{ethylene-1nsensitive`2,EIN2, SGN-U319128)和花青素合成相關基因 (SGN-320618)，這預示著miR828可能參與番茄花青素合成途徑的調控網絡。
[0004]在番茄植株中，通過超表達單個異源參與類黃酮合成途徑的酶基因和調芐基因，以提高果實花青素含量的方法效果欠佳。Butelli等在番茄果實中同時特異共表達由E8啟動子驅動的2個轉錄因子，即源于金魚草的(bHLH-type TF)和Rosl (R2R3MYB-type TF)，獲得了果肉組織中花青素含量顯著增加的表型(Nat Biotechnol, 2008,26:1301-1308)。但目前還未見應用miRNA調控策略提高普通番茄花青素合成積累的報道。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提供一種含有擬南芥pr1-miR828基因(At-pri_miR828基因)的植物表達載體pC2300-p0T2-At-pr1-miR828，以及該植物表達載體的構建方法。
[0006]本發明的另一發明目的在于提供上述構建的植物表達載體的應用。
[0007]為深入解析miR828的生物學功能和建立通過遺傳修飾miRNA調控番茄果實花青素含量的技術策略，本發明從擬南芥中分離到At-pr1-miR828基因，并構建過量表達載體。該載體的構建可以為miR828基因功能的研究和從miRNA角度研究番茄花青素生物合成積累機制提供重要的研究資料和研究基礎。
[0008]本發明提供的植物表達載體pC2300-p0T2-At-pr1-miR828中含有At-pri_miR828基因以及P0T2克隆載體CaMV35s啟動子，具有SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列，其中，所述At-pr1-miR828基因連接于p0T2克隆載體CaMV35s啟動子下游，p0T2-At-pri_miR828基因連接于起始表達載體PC2300的I單酶切位點處。
[0009]所述At-pr1-miR828基因來源于擬南芥，含有AT4G27765.1所示的核苷酸序列(SEQ ID N0.3) ο所述起始表達載體為PCAMBIA2300，簡稱pC2300，由美國密歇根理工大學
唐貴良教授惠贈。
[0010]本發明還提供了一種構建上述植物表達載體pC2300-p0T2-At-pr1-miR828的方法，是先以At-pr1-miR828基因片段連接p0T2克隆載體，得到p0T2-At-pri_miR828重組質粒；再連接線性化的PC2300表達載體和p0T2-At-pr1-miR828重組質粒，得到植物表達載體pC2300-p0T2-At-pr1-miR828 重組質粒。
[0011]具體的，所述植物表達載體pC2300-p0T2-At-pr1-miR828的構建方法包括如下步驟:
1)以At-pr1-miR828基因片段連接歷/2dIII和&oR I雙酶切的p0T2克隆載體，重組產物轉化疋colimb α感受態細胞，得到p0T2-At-pr1-miR828重組質粒；
2)重組質粒p0T2-At- pr1-miR828和起始表達載體pC2300備PacI單酶切，用T4DNA連接酶連接線性化的pC2300表達載體和p0T2-At-pri_miR828質粒，酶連產物轉化E.coliDm α感受態細胞，得到植物表達載體pC2300-p0T2-At-pr1-miR828重組質粒。
[0012]本發明所構建的植物表達載體pC2300-p0T2-At-pr1-miR828可以用于調控植物花青素的生物合成。其中，所述的植物包括番茄、擬南芥、小麥、水稻等。
[0013]將上述構建得到的植物表達載體pC2300-p0T2-At-pr1-miR828應用農桿菌介導法轉染到番茄的子葉外植體中，獲得過表達轉基因植株。移栽成活后，用CTAB法提取嫩葉DNA，進行At-pr1-miR828基因的PCR擴增。對PCR鑒定結果為陽性的miR828過表達轉基因植株及野生型植株分別進行則7--貨及其靶基因Sly-myb-likel表達水平的熒光定量PCR分析。結果顯示，轉基因植株中的表達量增加，而靶基因Sly-myb-likel的表達量下降。觀察轉基因番茄植株與野生型植株的生長情況發現，過表達轉基因番茄植株較野生型顏色發綠。提取葉片中的花青素，計算其相對含量，結果顯示，-7?&貨過表達轉基因番茄植株的花青素含量均明顯低于野生型。
[0014]本發明構建了能夠高表達At-pri_miR828基因的植物表達載體pC2300-p0T2-At-pr1-miR828,以本發明所構建的表達載體轉染植物后，可獲得則7?貨過表達轉基因植株，且該At-pr1-miR828基因能夠調控植物中花青素的生物合成。
[0015]本發明以植物表達載體pC2300-p0T2-At-pr1-miR828構建的則7?貨過表達植株還可以用于檢測何種因子對miR828的表達量和代謝途徑有影響的實驗研究。
[0016]相對于轉錄因子直接參與花青素合成的調控，植物體內MicroRNA抑制靶基因表達為我們提供了一種全新的花青素合成調控機理，對完善花青素代謝途徑及其調控機制具有非常重要的生物學意義。本發明提供了植物表達載體pC2300-p0T2-At-pr1-miR828在調控植物(包括番茄、擬南芥、小麥、水稻等)花青素合成上的應用。花青素生物合成的調控，將為植物花色改造、農作物品質改良等提供更多的有效途徑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為At-pr1-miR828基因PCR擴增產物的電泳鑒定。
[0018]圖中，M:Tans2K? Plus II DNA Marker ；miR828:野生型擬南芥At-pri_miR828基因PCR擴增產物。
[0019]圖2為p0T2-At-pr1-miR828質粒PCR擴增產物的電泳鑒定。
[0020]圖中，M:DL1000 DNA Marker ；1:p0T2-At-pri_miR828 質粒陽性對照；2:陰性對照；3 ~6:p0T2-At-pr1-miR828 質粒 PCR 擴增產物。[0021]圖3為p0T2-At-pr1-miR828質粒雙酶切后的電泳鑒定。
[0022]圖中，M:DL5000 DNA Marker ;1、3、5:沒有酶切的p0T2-At-pri_miR828質粒；2、4、6 -.Hind III 和 EcoR I 雙酶切的 p0T2-At-pri_miR828 質粒。
[0023]圖4為重組質粒p0T2-At-pri_miR828構建示意圖。
[0024]圖5為植物表達載體pC2300-p0T2-At-pri_miR828的PacI酶切后電泳鑒定。
[0025]圖中，M:Tans2KTM Plus II DNA Marker ; 1、3、5:未酶切的pC2300-p0T2-pr1-miR828 質粒；2、4、6 -.Pacl 酶切的 pC2300-p0T2-pri_miR828 質粒。
[0026]圖6為植物表達載體pC2300-p0T2-At-pr1-miR828構建示意圖。
[0027]圖7為帶有愈傷組織的番茄子葉外植體圖。
[0028]圖8為番茄子葉外植體抗性芽的誘導、伸長(左)及生根(右)圖。
[0029]圖9為抗性植株的盆栽培育圖。
[0030]圖10為At-pr1-miR828轉基因番茄植株的PCR檢測電泳圖。其中A為目的基因At-pr1-miR828的檢測；B為載體上Cmr基因的檢測。
[0031]圖中，M:DL1000 DNA Marker ；1:野生型番茄；2 ~10:miR828_l ~miR828_9 轉基
因番爺植株。
[0032]圖11為心7--?過表達轉基因番茄的心7--貨和》知-7/知7基因的熒光定量PCR結果。
[0033]圖12為轉基因番茄植株的表型圖，MIR828-1、MIR828-2 -jniR828過表達轉基因番茄；Wt:野生型番茄。
[0034]圖13為轉基因番茄葉片中的花青素含量圖。
[0035]圖中，Wt:野生型番茄；1~6:轉基因番茄植株。
【具體實施方式】
[0036]為使本發明的技術方案便于理解，以下結合具體實施例對植物表達載體pC2300-p0T2-At-pr1-miR828的構建以及At-pri_miR828基因在調控花青素生物合成中的應用作進一步的說明。
[0037]本發明利用質粒的體外酶切及連接技術，將線性化的克隆載體P0T2與At-pr1-miR828基因連接，轉化疋co7iDH5 α感受態細胞進行擴增，所得重組質粒可通過Chl篩選出，并通過質粒大小和限制性內酶切分析鑒定。繼而，用I內切酶分別單酶切帶有I單酶切位點的pC2300表達載體和p0T2-At-pr1-miR828重組質粒，并連接，轉化E.colimb α感受態細胞進行擴增，所得植物表達載體可通過Chl和Kan篩選出，并通過雙酶切分析鑒定。
[0038]實施例1:植物表達載體pC2300-p0T2-At-pr1-miR828的構建。
[0039]植物材料:哥倫比亞生態型(Columbia-O)野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)種子及野生型番爺{Solanum lycopersicum L.Ailsa Craig)種子。
[0040]菌株和質粒:大腸桿菌(疋coli)菌株DH5 α，農桿菌菌株GV3101，改造后帶有35s啟動子的克隆載體P0T2，以及改造后帶有I單酶切位點的表達載體PC2300。
[0041]酶和化學試劑:LA Taq DNA聚合酶、普通7? DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、純化回收試劑盒、質粒提取試劑盒、反轉錄試劑盒、突光定量試劑盒、Marker DL2000和MarkerDL2000均購自中國TakaRa公司；Tans2K? Plus II DNA Marker購自北京全式金公司；DNA限制性內切酶IIUcoR l、Pac I購自英國NEB公司；TRizol購自美國Invitrogen。PCR引物在生工生物工程(上海)有限公司合成，其它藥品、試劑均為生工生物工程(上海)有限公司的BBI系列產品。
[0042]一、At-pri_miR828原始轉錄本序列的獲得及引物設計與PCR擴增。
[0043]查詢擬南芥基因組數據庫TheArabidopsis Information Resource,獲得miR828的原始轉錄本序列AT4G27765.1。借助Primer 3.0軟件對基因序列及載體序列進行分析，并設計如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的擴增引物。為了便于miR828過表達載體的構建，在上下游引物的5'端分別引入歷id III酶切位點和I酶切位點(下劃線部分)及保護堿基。
[0044]引物序列如下:
miR828-PF:5/ -CCGAIAGCTTTGGTAGCCTGGGTTGGTG-3'；
miR828-PR:5/ -CCCGIAATTC TTAAAGGCTTGACTCATACGACA-3'。
[0045]參照常規CTAB法從幼嫩的野生型擬南芥葉片中提取DNA。以提取的擬南芥DNA為模板，用上下游引物進行PCR擴增，得到長度467bp的At-pr1-miR828 DNA片段(SEQ IDN0.3) JCR反應體系:擬南芥基因組DNA I μ L, IOXLA PCR緩沖液 5 μ L，2.5mmol.1/1 dNTPs5 μ L, 10 μ mo I.L-1 上下游引物各 5 μ L，5U.μ L-1 LA Taq 酶 0.5 μ L，ddH20 28.5 μ L。擴增條件如下:94°C 2min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin，30 個循環；72°C IOmin0
[0046]PCR反應結束后，取2 μ L反應液進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測反應產物，擴增出約467bp的At-pr1-miR828基因特異條帶，如圖1所示。PCR產物經PCR產物純化試劑盒回收后送華大基因公司測序，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。結果表明已成功擴增出擬南芥miR828的原始轉錄本At-pri_miR828序列。
[0047]二、重組質粒 p0T2-At-pri_miR828 的構建。
[0048]用高保真限制性內切酶歷fld III和&oR I對p0T2克隆載體和At-pri_miR828基因的純化產物分別進行雙酶切。將At-pr1-miR828基因的酶切產物進行PCR產物純化，P0T2載體的酶切產物進行凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收大片段。回收產物用T4 DNA連接酶16°C連接過夜，轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞。在含有Chloramphenicol (Chl)的LB平板上挑選陽性單克隆，采用At-pr1-miR828基因的擴增引物進行質粒PCR，Hind III和EcoR I雙酶切和測序驗證后命名為p0T2-At-pr1-miR828，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，圖4為p0T2-At-pr1-miR828重組質粒的構建示意圖。[0049]采用At-pr i-miR828基因擴增引物miR828_PF和miR828_PR進行質粒的PCR擴增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1, HinA III和I雙酶切后凝膠電泳檢測結果顯示目標基因片段大小正確(圖3)，說明重組質粒pOT2-At-pr1-miR828構建成功。
[0050]三、植物表達載體pC2300-p0T2-At-pr1-miR828 的構建。
[0051]用高保真限制性內切酶I分別單酶切帶有I單酶切位點的起始表達載體PC2300和重組質粒p0T2-At-pr1-miR828，分別用PCR產物純化試劑盒純化。純化產物用T4DNA連接酶連接，16°C過夜，獲得核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示的At-pri_miR828過表達的植物表達載體，命名為pC2300-p0T2-At-pr1-miR828。載體構建示意圖如圖6所示。轉化DH5 α感受態細胞，在含有Chl和Kanamycin (Kan)的雙抗生素LB平板上挑選單克隆，提取質粒，進行I酶切，凝膠電泳檢測結果如圖5，測序結果說明，實驗所得序列與GenBank中 At-pr1-miR828 (AT4G27765.1)序列一致，說明 pC2300-p0T2-At-pri_miR828 植物表達載體構建成功。
[0052]實施例2:植物表達載體pC2300-p0T2-At-pr1-miR828對番茄的遺傳轉化。
[0053]一、農桿菌介導的葉盤法轉化番爺。
[0054]無菌苗培養:先用75%乙醇浸泡番爺種子5min,倒掉乙醇后用無菌水沖洗一遍；再用飽和Na3PO4.12H20溶液浸泡20min，無菌水沖洗一次；最后用50%NaC10溶液浸泡lOmin，用無菌水沖洗4-6次。將滅好菌的種子均勻接種于MSR3培養基(4.4g.L-1 MS+30g.L-1蔗H +ImL.L-1 R3 vitamins+lOg.L-1 瓊脂粉，ρΗ5.9)上，置于 26°C (16h 光照)/18°C (8h 黑暗)的培養箱中培養大約8-10d。
[0055]預培養:待無菌苗長至子葉完全展開但真葉沒有長出時，將子葉切下并切掉子葉的兩個尖端，置于MS+2-4D液體培養液(4.4g.L—1 MS+30g.L—1蔗糖+0.2g.L—1KH2PO4+1mL.L-1 R3 vitamins+0.1mg.L-1 Kinetin+0.2mg.L-1 2_4D, pH5.7)中浸泡，然后將浸泡后的子葉外植體放置在Ml預培養基(MSR3培養基+0.87mg.L—1 IAA+1.75mg.L—1Zeatin)上弱光(用布遮蓋)下預培養ld，培養皿要倒置以防止水凝聚流出。
[0056]制備農桿菌:使用熱激法將構建的pC2300-p0T2-At-pr1-miR828質粒轉化進農桿菌菌株GV3101中，并篩選陽性菌株。取轉染pC2300-p0T2-At-pr1-miR828的農桿菌菌種，于裝有5mL液體LB的50mL離心管中過夜培養。
[0057]侵染與共培養:將培養好的農桿菌4200rpm離心5min，用等體積的LB重懸后再次4200rpm離心5min，用約50mL液體MS培養基重懸至OD6tltl=0.2-0.3。將預培養的子葉外植體轉移到農桿菌懸液中侵染，振蕩培養15min。倒掉侵染液,用MS+2-4D液體培養基沖洗殘留的農桿菌，用滅菌濾紙吸去多余菌液，取一張滅菌濾紙鋪在原來的預培養基上，將侵染過的子葉外植體置于其上，弱光下與農桿菌共培養I天，第二天換到新鮮的預培養基上，繼續弱光培養I天。
[0058]選擇培養:將共培養2天的子葉外植體轉移到M13篩選培養基(MSR3培養基+0.87mg.L-1 IAA+1.75mg.L-1 Zeatin+75mg.L-1Kana+400mg.L-1 Augment in)上篩選培養，每個培養皿上大約15片，7天后轉到新鮮的選擇培養基上，并去掉遮布正常光照，每兩個星期換一次，以保持抗生素的抗性，直到長出愈傷組織。
[0059]芽誘導及伸長和根誘導的培養:將長出直徑l-2cm大愈傷組織的子葉外植體經過常規芽誘導、生根培養 后，移栽成活長成具有卡那霉素抗性的At-pr1-miR828轉基因番茄植株(圖9)。
[0060]參照常規CTAB法從幼嫩的番茄葉片中提取DNA。以轉基因番茄葉片的基因組DNA為模板，以野生型番茄葉片的基因組DNA為陰性對照模板，以pC2300-p0T2-At-pri-miR828質粒為陽性對照模板，分別PCR擴增At-pri-miR828目的基因及pC2300載體上的氯霉素抗性基因Cmr，進行陽性轉基因植株的鑒定。
[0061]目的基因的擴增引物為miR828-PF和miR828_PR，擴增片段長度467bp。
[0062]擴增Cmr基因的上游引物為Cmr-PF:5' -TGGAAGCCATCACAAACG-3'，下游引物為Cmr-PR:5/ -ATCGCTCTGGAGTGAATACC-3'，擴增片段長度 291bp。
[0063]圖10為9棵轉基因番茄植株miR828-l~miR828_9的PCR檢測結果，除野生型及轉化株miR828-8外，其它轉基因番茄植株均擴增出約467bp的At-pri_miR828基因特異條帶和約291bp的Cmr基因特異條帶，表明At-pri_miR828基因已整合進番茄基因組。
[0064]實施例3:轉基因番茄植株的實時熒光定量PCR分析。
[0065]從兩個PCR鑒定結果為陽性的miR828過表達轉基因番爺株系中各選取一棵轉基因植株的嫩葉，用TRizol提取總RNA，并用DNase I進行處理。RNA濃度和質量用核酸蛋白檢測儀(Nanodrop ND-1000，thermo)和電泳鑒定。以番茄sly-U6為內參基因，用實時熒光定量法檢測miR828基因表達量；以番茄Sly-CAC為內參基因，檢測miR828靶基因Sly-myb-likel (SGN320618)表達量。
[0066]miR828的3個引物序列如表1所不，即miR828 stem-loop RT引物、miR828正向引物和miR828通用反向引物。cDNA第一鏈的合成按PrimeScript? 1st Strand cDNASynthesis試劑盒(TaKaRa,中國)方法合成。合成體系包括dNTP mixture (1OmM),miR828 stem-loop RT 引物(10 μ mol.L-1)和 U6 反向引物(10 μ mol.L-1)各 1 μ L，RNA1μ g, RNase free H2O補足到10yL。65°C溫育5min，迅速冰上冷卻。然后在冰上按順序加入 5XPrimeScript II Buffer 4μ L, RNA 酶抑制劑(RNasin) (40 U.μ L_1)0.5μ L,PrimeScript II RTase (200U/ μ L) 1 μ L, RNase free H2O 補足到 20 μ L。反轉錄條件為:50°C 30min ；95°C 5min。熒光定量分析用 SYBR Premix Ex Taqw (Tli RNaseH Plus)試劑盒在 Stratagene Mx3005P system PCR 儀上完成。體系為 25 μ L，包含 SYBR位Taq? 12.5 μ L、2.5mmol.171 dNTPs 5 μ L, Stratagene Mx3005P system PCR miR828 正反向引物和 50XR0X Reference Dye II 各 0.5 μ L，cDNA I μ L，RNase free H2O 補足到 20 μ L。擴增條件如下:95°C 30s ；95°C 5s, 58°C 20s, 72°C 15s，35 個循環；95°C Imin ；55°C 30s,95°C 30s。數據分析根據Livak和Schmittgen(2001)方法進行，即ΔCt=Ct,目標基因_ Ct,內參基因目標基因的相對表達量(相對于內參基因)為2 ΔCT"，轉基因植株基因表達的變化表不為對照的2_ΔCT記為1時目標基因2_ΔcT的相對值(即2_ΔΔcT)，各基因表達量用均值土標準差表示。結果顯示，兩顆轉基因番茄植株中，表達量分別增加為對照的52倍和14倍，而Sly-myb-likel表達量分別下降為對照的7%和28% (圖11)。
【權利要求】
1.基于擬南芥pr1-miR828基因的植物表達載體，所述植物表達載體pC2300-p0T2-At-pr1-miR828 中含有 At-pri_miR828 基因以及 pOT2 克隆載體 CaMV35s 啟動子，具有SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列，其中，所述At-pr1-miR828基因連接于pOT2克隆載體CaMV35s啟動子下游，pOT2-At-pri_miR828基因連接于起始表達載體pC2300的I單酶切位點處。
2.權利要求1植物表達載體pC2300-p0T2-At-pr1-miR828的構建方法，是以At-pr1-miR828基因片段連接pOT2克隆載體，得到pOT2-At-pri_miR828重組質粒，再連接線性化的PC2300表達載體和pOT2-At-pr1-miR828重組質粒，得到植物表達載體pC2300-p0T2-At-pr1-miR828。
3.根據權利要求2所述的植物表達載體pC2300-p0T2-At-pr1-miR828的構建方法，包括以下步驟: 1)以At-pr1-miR828基因片段連接歷/2dIII和&oR I雙酶切的pOT2克隆載體，重組產物轉化疋colimb α感受態細胞，得到pOT2-At-pr1-miR828重組質粒； 2)重組質粒pOT2-At-pr1-miR828和起始表達載體pC2300備PacI單酶切，用T4DNA連接酶連接線性化的pC2300表達載體和pOT2-At-pri_miR828質粒，酶連產物轉化E.coliDm α感受態細胞，得到植物表達載體pC2300-p0T2-At-pr1-miR828重組質粒。
4.權利要求1植物表達載體pC2300-p0T2-At-pr1-miR828在調控植物花青素生物合成上的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其中所述植物為`番茄、擬南芥、小麥或水稻。
【文檔編號】C12N15/66GK103614412SQ201310571014
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月17日 優先權日:2013年11月17日
【發明者】賈小云, 賀立恒, 丁娜, 劉慧 , 沈潔, 金雷皓, 李芳 , 唐貴良 申請人:山西農業大學