副雞嗜血桿菌的培養方法
【專利摘要】本技術發明提供了一種副雞嗜血桿菌的培養方法，將副雞嗜血桿菌（HPg）用生理鹽水5倍稀釋，接種至雞肉湯瓊脂平板,37℃含5%～10%CO2培養16～18小時,選熒光強的典型菌落接種于雞肉湯中,培養18～20小時；長出典型HPg菌落者即為種子液。取HPg種子液,分別接種于7日齡SPF雞胚卵黃囊,0.3mL/胚。雞胚于37℃、56%相對濕度孵化124小時；從死亡雞胚無菌采集發生病變的卵黃、尿囊液及絨毛膜，于研磨器中研磨，3000r/min離心20分鐘，取上清液，再次接種于雞肉湯瓊脂,當生長出典型HPG菌落且無雜菌生長者，即為HPg致病菌液，-20℃保存。本技術發明具有取材容易、效率高、速度快、簡便易行等優點。可用于副雞嗜血桿菌的分離、增殖及生產疫苗等。
【專利說明】副雞嗜血桿菌的培養方法
【技術領域】
[0001]本技術發明涉及副雞嗜血桿菌，特別涉及一種副雞嗜血桿菌的雞胚培養方法，屬于生物技術和微生物學領域。
【背景技術】
[0002]雞傳染性鼻炎是由副雞嗜血桿菌gallinarum, HPg)所引起雞的急性呼吸系統疾病。其特征是鼻腔和鼻竇炎癥，打噴嚏，流鼻液，顏面腫脹，結膜炎等。雞嗜血桿菌呈多形性，為革蘭氏陰性小球桿菌，兩極染色，不形成芽胞，無莢膜無鞭毛，不能運動，兼性厭氧，在含10%的大氣條件下生長較好。雞群感染后I~5天內開始出現癥狀，鼻青眼腫、痛苦流涕是本病的特征性癥狀，鼻腔與鼻竇發炎、流鼻涕、甩頭、臉部腫脹。育成雞感染傳染性鼻炎，輕則生長遲緩，重則淘汰率增加，死亡率上升。蛋雞感染后產蛋率明顯下降，雞只生長停滯、淘汰率增加。
[0003]目前細菌的培養常用包括需氧培養法、二氧化碳培養法和厭氧培養法，也可同時采用兩種或三種不同的培養法。對于副雞嗜血桿菌曾有人做過液體發酵培養，然而尚無關于雞胚培養方法的報道。雞胚接種培養技術比組織培養容易成功，也比接種動物的來源容易，無飼養管理及隔離等的特殊要求，且雞胚一般無病毒隱性感染，因此是常用的一種培養病毒的方法，此方法可用于某些病毒的分離、增殖、毒力滴定、中和試驗及生產疫苗等。
【發明內容】
[0004]本發明技術涉及副雞嗜血桿菌(HPg)的雞胚培養方法，包括以下步驟:
將副雞嗜血桿菌北京標準 株A型用生理鹽水進行5倍稀釋，作為原液，劃線接種至雞肉湯瓊脂平板上，置37°C含5%~10% CO2 (體積分數)培養箱中培養16~18小時，在斜射光線的顯微鏡下觀察，選擇熒光強的典型菌落接種于雞肉湯中，同樣條件下培養18~20小時；再用雞肉湯瓊脂平板進行雜菌檢驗，無雜菌且生長出典型HPg菌落者即為種子液。
[0005]取HPg種子液，分別接種于7日齡SPF雞胚卵黃囊，0.3 mL/胚。雞胚在數字智能化孵化機中37°C、56%相對濕度下孵化，3h翻蛋一次，觀察124小時；
從死亡的雞胚分別無菌采集發生病變的卵黃、尿囊液及絨毛膜，置于組織研磨器中研磨，3000r/min離心20分鐘，取上清液，再次接種于雞肉湯瓊脂平板，當生長出典型HPG菌落且無雜菌生長者，即為HPg致病菌液，_20°C保存。
[0006]按農業部頒發的獸醫微生物制品規程進行細菌計數，將病菌液以10' 10_2，10_3*“10_6六個梯度稀釋，然后取0.1mL稀釋液均勻地涂抹在雞肉湯瓊脂平板上，每個稀釋度設重復板，于37°C含5%~10% CO2的培養箱中培養18~20小時，2板的平均數即為該稀釋度的細菌數。
[0007]四、技術特點
1.雞胚的來源比自然宿主、實驗動物(易感動物)和細胞等材料更容易獲得，無飼養管理及隔離等的特殊要求，且雞胚一般，培養的成本低；
2.接種方法簡便易行，SPF雞胚無雜菌，無病毒隱性感染，培養純度高，培養時間短。
[0008]3.副雞嗜血桿菌(HPg)繁殖速度快，擴增量大。
[0009]總之，本技術發明具有取材容易、效率高、速度快、簡便易行等優點。可用于副雞嗜血桿菌的分離、增殖及生產疫苗等。
[0010]五、【專利附圖】
【附圖說明】
圖1是本技術“副雞嗜血桿菌的培養方法”的流程圖
圖2是副雞嗜血桿菌(HPg)雞胚接種后的主要病變，可見絨毛膜變渾濁、變厚及形成的痘斑。
[0011]六、【具體實施方式】
1.副雞嗜血桿菌的雞胚培養
1.1種子液的培育將副雞嗜血桿菌北京標準株A型培養液進行5倍稀釋，作為原液，劃線接種至雞肉湯瓊脂平板上，置37°C含5%~10% CO2 (體積分數)培養箱中培養16~18小時，在斜射光線的顯微鏡下觀察，選擇突光強的典型菌落接種于雞肉湯中，同樣條件下培養18~20小時。
[0012]1.2用雞肉湯瓊脂平板進行雜菌檢驗，無雜菌而生長出典型HPg菌落者即為種子液。
[0013]1.3雞胚接種與收獲取繁殖好的HPg種子液，接種于7日齡SPF雞胚卵黃囊，0.3 mL/胚。雞胚在數字智能化孵化機中37°C、56%相對濕度下孵化，3h翻蛋一次，觀察124小時。
[0014]從死亡的雞胚分別無菌采集發生病變的卵黃、尿囊液及絨毛膜，置于組織研磨器中研磨，3000r/min離心20分鐘，取上清液，再次接種于雞肉湯瓊脂平板，進行雜菌檢驗，當生長出典型HPG菌落且無雜菌生長者，即為HPg致病菌液，-20°C保存。
[0015] 1.4細菌計數細菌計數按農業部頒發的獸醫微生物制品規程進行，以10' IO-2, 10_3……10_6稀釋，然后取0.1mL稀釋液均勻地涂抹在雞肉湯瓊脂平板上，每個稀釋度做I個重復板，置于37°C含5%~10% C02的培養箱中培養18~20小時，兩板的平均數即為該稀釋度的細菌數。
[0016]2.雞胚半數致死量(ELD50)測定
取死亡雞胚的卵黃、尿囊液及絨毛膜的離心上清液，按10'10_2、10_3、10_4、10_5的梯度稀釋后接種雞胚。
[0017]采用FT-K數字智能化孵化機。所用SPF雞胚為自行孵化，取7日齡雞胚50枚。每個雞胚分別接毒^^、^^、川人川氣^^梯度的稀釋液匕2mL，每個稀釋梯度用10枚雞胚37°C，56%相對濕度下孵化，3h翻蛋一次。棄去48h內死亡雞胚，觀察124h，詳細記錄死亡與存活數。無菌收集72-148h死亡雞胚，3500r/min離心，取上清液，-20°C保存待用。
[0018]按Reed-Menuch氏法計算HPg雞胚半數致死量(ELD50)。
[0019]表1.HPg的ELD50測定結果
【權利要求】
1.本技術發明涉及一種“副雞嗜血桿菌的培養方法”，包括以下步驟: 將副雞嗜血桿菌(HPg)北京標準株用生理鹽水進行5倍稀釋，劃線接種至雞肉湯瓊脂平板上，置37°C含5%~10% CO2培養箱中培養16~18小時后，在斜射光線的顯微鏡下觀察，選擇突光強的典型菌落接種于雞肉湯中，同樣條件下培養18~20小時；再用雞肉湯瓊脂平板進行雜菌檢驗，無雜菌且生長出典型HPg菌落者即為種子液。
2.取HPg種子液，分別接種于7日齡SPF雞胚卵黃囊，0.3 mL/胚；雞胚在數字智能化孵化機中37°C、56%相對濕度下孵化，3h翻蛋一次，觀察124小時；從死亡的雞胚分別無菌采集發生病變的卵黃、 尿囊液及絨毛膜，置于組織研磨器中研磨，3000r/min離心20分鐘，取上清液，再次接種于雞肉湯瓊脂平板，當生長出典型HPG菌落且無雜菌生長者，即為HPg致病菌液，_20°C保存。
【文檔編號】C12R1/21GK103667115SQ201310570995
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月18日 優先權日:2013年11月18日
【發明者】魏鎖成, 鞏轉娣, 魏黎敏 申請人:魏鎖成, 鞏轉娣, 魏黎敏