一種兩棲動物非傷害性取樣dna提取方法
【專利摘要】本發明公開了一種兩棲動物非傷害性樣品采集DNA提取方法，通過剪去兩棲動物蹼和/或趾并進行DNA提取。采用本發明的方法，提取快速而且所提取的DNA純度高的兩棲動物，對兩棲動物沒有傷害，不影響其進一步繁殖。
【專利說明】一種兩棲動物非傷害性取樣DNA提取方法
發明領域
[0001]本發明涉及一種分子生物學方法，具體是發明了一種DNA提取的具體方法，用于非傷害性取樣后提取(有尾目和無尾目)兩棲動物DNA。
【背景技術】
[0002]兩棲動物作為低等四足動物，現有種類4000余種，但其種類和數量遠不如其它的陸生脊椎動物，在3個目中，無尾目種類最為繁多，分布最廣泛。兩棲動物雖然也能適應多種生活環境，但是其適應力遠不如更高等的其它陸生脊椎動物，既不能適應海洋的生活環境，也不能生活在極端干旱的環境中，在寒冷和酷熱的季節則需要冬眠或者夏蜇。兩棲動物作為生態系統中的重要組成部分，因生活環境的喪失、環境的污染、過度獵捕等使其種群數量急劇減少。目前，涉及兩棲動物的分子生態學與保護遺傳學方面的研究已成為現代生物學研究的熱點之一，作為其研究基礎的DNA提取質量成為影響實驗結果的一個重要因素。[0003]常用的獲得動物DNA的取樣方法有3種，即傷害性取樣、非傷害性取樣和非損傷性取樣。傷害性取樣是指通過獲得研究對象的新鮮肌肉、肝臟等組織提取DNA，此取樣方式對于物種的破壞性較大，特別是對于珍稀瀕危物種而言，其破壞是毀滅性的。非傷害性取樣主要通過采集動物毛發、羽毛、耳、尾、趾或抽取動物的血液等來提取DNA。非損傷性取樣是在不觸及或不傷害動物本身的前提下，通過收集脫落的毛發或羽毛、糞便、尿液、食物殘渣等樣品進行遺傳分析的取樣方法，該方法不會對動物本身產生傷害，但卻很難獲得完整的DNA。
[0004]一直以來，對于兩棲動物遺傳多樣性等方面的研究多采用傷害性取樣，往往導致動物死亡，不利于對其進行保護；采用非傷害性取樣或非損傷性取樣提取動物DNA的提取研究較多，但對兩棲類動物采用非傷害性取樣或非損傷性取樣提取DNA的研究較少。因此，非常有必要探討兩棲類非傷害性取樣DNA提取的可行性。
【發明內容】
[0005]本發明是為了解決兩棲動物樣品DNA提取質量的問題，提供一種操作簡單，提取快速而且所提取的DNA純度高的兩棲動物(主要包括有尾目和無尾目兩棲動物)非傷害性DNA提取方法。為了實現本發明的目的，擬采用如下技術方案:
[0006]本發明一方面涉及兩棲動物(主要包括有尾目和無尾目兩棲動物)非傷害性樣品采集DNA提取方法，其特征在于包括步驟:
[0007](I)取活有尾目或無尾目兩棲動物蹼和/或趾，剪碎后置于勻漿器中，加入勻漿液后冰浴研磨，研磨碎裂后置離心管中；
[0008](2)加入I % -3%的P -巰基乙醇溶液，混勻后60_70°C水浴0.5-lh,每隔3-5分鐘取出搖勻一次；
[0009](3) 10000-15000rpm離心3_7min,離心后，移出上清于另一無菌離心管中，棄沉淀；[0010](4)向上清中加入等體積的按體積比20-30:1的氯仿:異戊醇的混合溶劑，混勻后,8000-12000rpm離心5_15min,取上清至另一無菌離心管中；
[0011](5)加入等體積的氯仿,混勻后8000-12000rpm離心5_15min,再取上清；
[0012](6)向上清中加入0.8-1.2倍體積的2-4M NaAC溶液，混勻后再加入1.5-2.5倍體積預冷的無水乙醇，充分混勻后_18°C以下放置30min以上；
[0013](7) 10000-15000rpm離心3_7min，棄上清，所得DNA沉淀在室溫下晾干；
[0014](8)用70-80%的乙醇對DNA沉淀進行洗滌，干燥后沉淀溶于TE (TE是一種弱堿性的緩沖液，對DNA的堿基有保護性，提取好的DNA主要放在TE緩沖液是保存；其配方為:IOmmoI/L Tris-HCl (pH8.0)和 ImmoI/L EDTA(pH8.0))中，加 RNase A，37°C消化20_40min，之后于_20°C保存。
[0015]在本發明的一個優選的實施方式中，其特征在于所述方法還包括DNA的擴增步驟，所述步驟為以步驟⑶所得的DNA為模板，以16S rDNA特異性引物Pf:5’ -CGCCTGTTTACCAAAAACAT-3’ 和 Pr:5’ -CCGGGCTGAACTCAGATCACGT-3’ 擴增。
[0016]在本發明的一個優選的實施方式中，其特征在于有蹼的兩棲動物使用手術剪無傷害的剪取其展開的蹼，無蹼的兩棲動物使用手術剪無傷害的剪取其趾端。
[0017]在本發明的一個優選的實施方式中，所述的勻漿液的特征在于按以下配方配制:IOOmM Tris-HClU.4M NaCl、20mM EDTA、2% CTAB、I %-4% PVP-40，使用前在 60_70°C下預熱。
[0018]在本發明的一個優選的實施方式中，其特征在于所述的(6-巰基乙醇溶液的加入量為總體積的1% _3%，并單獨加到懸液中。
[0019]在本發明的一個優選實施方式中，所述的兩棲動物選自大鯛、蛾眉樹娃。
[0020]采用本發明的方法，提取快速而且所提取的DNA純度高的兩棲動物，對兩棲動物沒有傷害，不影響其進一步繁殖。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021 ] 圖1:電泳分析結果照片。
【具體實施方式】
[0022]a.取采自某養殖場的大鯢肌肉、蹼或趾各30mg，剪碎后置于勻漿器中，加入500 u L勻漿液后冰浴研磨，研磨碎裂后置1.5或2ml離心管中；勻漿液的特征在于按以下配方配制:IOOmM Tris-HClU.4M NaCl、20mM EDTA,2% CTABU % -4% PVP-40，使用前須在60-70°C下預熱。
[0023]b.加入I % -3%的P -巰基乙醇溶液，混勻后60_70°C水浴0.5-lh,每隔幾分鐘取出搖勻一次；(6-巰基乙醇溶液的特征在于:其為總體積的1% _3%，且要單獨加到懸液中；
[0024]c.12000rpm離心5min,離心后，移出上清于另一無菌1.5或2ml離心管中，棄沉淀；
[0025]d.向上清中加入等體積的按體積比24:1的氯仿:異戊醇，混勻后，10，OOOrpm離心IOmin,取上清至另一無菌1.5或2ml離心管中；[0026]e.加入等體積的氯仿,混勻后于10, OOOrpm離心IOmin,再取上清；
[0027]f.向上清中加入0.1倍體積的3M NaAC,混勻后再加入2倍體積預冷的無水乙醇，充分混勻后_20°C放置30min以上；
[0028]g.12000rpm離心5min,棄上清，所得DNA沉淀在室溫下晾干；
[0029]h.用75 %的乙醇對DNA沉淀進行洗滌，干燥后沉淀溶于100 y L TE中，加RNase A至終濃度為20ii g/mL，37°C消化30min，之后于_20°C保存，備用；
[0030]1.以步驟⑶所得的DNA為模板，以16S rDNA特異性引物Pf:5’ -CGCCTGITTACCAAAAACAT-3’ 和 Pr:5’ -CCGGGCTGAACTCAGATCACGT-3’ 擴增出 16S rDNA 特異性條帶并進行電泳檢測。
[0031]電泳分析結果如圖1所示，試驗結果表明:大鯢和蛾眉樹蛙的蹼和趾樣本與肌肉樣本一樣均能獲得明顯的PCR擴增產物，且產物條帶清晰，產量高，能夠很好地滿足分子生物學遺傳分析的需要。圖中I為大鯢肌肉、蹼和趾樣品，2為蛾眉樹蛙肌肉、蹼和趾樣品。
[0032]以上所述，僅為本發明的【具體實施方式】，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何不經過創造性勞動想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此，本發明的保護范圍應該以權利要求書所限定的`保護范圍為準。
【權利要求】
1.一種兩棲動物非傷害性樣品采集DNA提取方法，其特征在于包括步驟: (1)取活有尾目或無尾目兩棲動物蹼和/或趾，剪碎后置于勻漿器中，加入勻漿液后冰浴研磨，研磨碎裂后置離心管中； (2)加入I% -3%的P -巰基乙醇溶液，混勻后60-70°C水浴0.5-lh，每隔3_5分鐘取出搖勻一次； (3)10000-15000rpm離心3_7min,離心后,移出上清于另一無菌離心管中，棄沉淀； (4)向上清中加入等體積的按體積比20-30:1的氯仿:異戊醇的混合溶劑，混勻后，8000-12000rpm離心5_15min，取上清至另一無菌離心管中； (5)加入等體積的氯仿,混勻后8000-12000rpm離心5_15min,再取上清； (6)向上清中加入0.8-1.2倍體積的2-4M NaAC溶液，混勻后再加入1.5-2.5倍體積預冷的無水乙醇，充分混勻后_18°C以下放置30min以上； (7)10000-15000rpm離心3_7min，棄上清，所得DNA沉淀在室溫下晾干； (8)用70-80%的乙醇對DNA沉淀進行洗滌，干燥后沉淀溶于TE (是什么)中，加RNaseA，37°C消化20-40min，之后于_20°C保存。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法還包括DNA的擴增步驟，所述步驟為以步 驟⑶所得的DNA為模板，以16S rDNA特異性引物Pf:5，-CGCCTGTTTACCAAAAACAT-3’ 和 Pr:5’ -CCGGGCTGAACTCAGATCACGT-3’ 擴增。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于有蹼的兩棲動物使用手術剪無傷害的剪取其展開的蹼，無蹼的兩棲動物使用手術剪無傷害的剪取其趾端。
4.根據權利要求1所述的方法，所述的勻漿液的特征在于按以下配方配制:100mMTris-HClU.4M NaCl、20mM EDTA,2% CTABU % ~4% PVP-40，使用前在 60_70°C下預熱。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的(6-巰基乙醇溶液的加入量為總體積的1% _3%，并單獨加到懸液中。
6.根據權利要求1-5任意一項所述的方法，所述的兩棲動物選自大鯢、蛾眉樹蛙(可以補充其它適用的動物)。
【文檔編號】C12N15/10GK103614372SQ201310612204
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月28日 優先權日:2013年11月28日
【發明者】徐敬明, 樊汶樵 申請人:重慶文理學院