枯草芽孢桿菌a053及其在制備防治植物致病真菌發酵液中的應用的制作方法
【專利摘要】枯草芽孢桿菌A053及其在制備防治植物致病真菌發酵液中的應用，涉及枯草芽孢桿菌。所述枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）A053的保藏編號為CCTCC?NO：M2010269。所述枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）A053可用于制備防治植物致病真菌發酵液。所述防治植物致病真菌發酵液的使用方法如下：將防治植物致病真菌發酵液直接用于植物致病真菌的防治。所述植物致病真菌包括：立枯絲核菌、核盤菌、宛氏擬青霉、鐮刀菌、綠色木霉、長柄鏈格孢、香蕉炭疽菌等。制備工藝簡單，抑真菌譜廣，對鐮刀菌生防效果好。
【專利說明】枯草芽孢桿菌A053及其在制備防治植物致病真菌發酵液中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及枯草芽孢桿菌，特別是涉及一種枯草芽孢桿菌A053及其在制備防治植物致病真菌發酵液中的應用。
【背景技術】
[0002]植物病原真菌引起的植物病害位居植物3類病害(真菌病害、細菌病害和病毒病害)之首，其頻繁發生成災，造成重大的農業經濟損失，是阻礙中國農業經濟發展的突出問題之一。我國既是一個農業大國，也是一個海洋大國，從海洋微生物資源中尋找具有特殊功能的活性物質應用于陸地農業是一個較新的研究方向，有著很強的創新性和巨大的應用潛力。由于試制的農用抗生素可以直接在植物體上測試，不需要經過動物間接試驗，因此研究過程較醫藥研究將大大縮短。現在也已獲得一些有價值的活性物質，有的己經應用到植物病蟲害的防治試驗中，取得較好的效果。
[0003]由于極地環境特殊性以及人們尋找新型活性物質的興趣與日俱增，近年來，極地微生物資源已越來越引起了人們的注意。北極由于其獨有的地理及氣候特征，是一個潛在的、有待開發的微生物資源庫。它不僅是獨特生態系統微生物的生存繁衍地，也是新型生物活性物質(如酶、抗生素、多糖及脂類等)和先導化合物合成菌株的潛在種源地。在這種特殊的生態多樣性環境中生存的微生物，可能具有不同于陸生微生物的獨特的遺傳和代謝多樣性。因此，北極微生物資源可能是新型化合物或新型活性代謝產物的潛在來源。
[0004]研究表明，許多海洋微生物可產生抗真菌活性物質，包括鏈霉菌屬、氣單胞菌屬、假單胞菌屬、芽抱桿菌屬、黃桿菌屬、微球菌屬、子囊菌屬、半知菌屬等以及許多未定菌(沈寅初.農用抗生素研究開發的新進展.國外醫藥抗生素分冊.1998，19(2): 155-160)。雖然已知有數種細菌具有抗真菌活`性，但是芽孢桿菌仍然是最好的選擇(Handelsman J, StabbEV.Biocontrol of soil borne plant pathogens.Plant Celll996;8:1855-1869),因為對人畜無毒無害，不污染環境，能產生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力(黃海嬋，裘娟萍.枯草芽孢桿菌防治植物病害的研究進展[J].浙江農業科學，2005，(3):213-215)，故其成為近年來植物病害防治研究的熱點。尤其是來自北極極端條件下的芽孢桿菌，其生長條件、代謝類型和產物與陸地或其他海洋來源的不同，從而有可能開發出結構新穎的生物活性物質。
【發明內容】
[0005]本發明的目的之一在于提供一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) A053。
[0006]本發明的目的之二在于提供一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)A053在制備防治植物致病真菌發酵液中的應用及其方法。
[0007]所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)A053分離自中國第三次北極科學考察期間所采集的海水樣品(N78° 57' 09.2"，E12° OOi 02.3 ");該菌已于2010年10月18日保藏于中國典型培養物保藏中心，中國典型培養物保藏中心的地址為中國，武漢，武漢大學，郵編為430072，保藏中心保藏編號為CCTCC NO:M2010269。
[0008]所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)A053通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增其16S rDNA序列，與美國國家生物技術信息中心(NCBI)GenBank數據庫中相應的序列進行比對分析，結果發現，其與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)具有99%的序列相似性。
[0009]所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)A053可用于制備防治植物致病真菌發酵液。其制備方法如下:
[0010]首先將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)A053在含有IOml LB培養基的試管中進行活化培養，然后將活化的菌株接種到5L發酵罐(培養基3L)中進行發酵培養，得到防治植物致病真菌發酵液。
[0011]所述LB 培養基的組成如下:葡萄糖 20g/L，KH2P046g/L, K2HPO414g/L, MgSO40.2g/L, (NH4)2S044g/L, 2ml 微量元素，0.1MPa 滅菌 30min,所述微量元素包括 FeSO4.4H20,CaCl2.2H20, MnSO4.4H20, ZnCl2各ImM，過濾除菌后放入無菌試劑瓶中備用。
[0012]所述活化培養的時間為8~12h ;所述發酵培養的條件可為:溫度為30~37°C，pH為6.0~8.0,時間為36~72h。
[0013]所述防治植物致病真菌發酵液的使用方法如下:
[0014]將防治植物致病真菌發酵液直接噴灑在植物上。
[0015]在棉花枯萎病菌(鐮刀菌感染引起)防治的盆栽實驗中，A053發酵液具有較好的生物防治效果。 [0016]所述植物致病真菌包括:立枯絲核菌、核盤菌、宛氏擬青霉、鐮刀菌、綠色木霉、長柄鏈格孢、香蕉炭疽菌等。在棉花枯萎病菌(鐮刀菌)防治的盆栽試驗中，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) A053發酵液具有較好的生物防治效果，處理7天后，對照組的發病呈上升趨勢，發病率從36.67%升高到69.23% ;而實驗組的發病趨勢得到遏制，發病率從45.95% 下降至Ij 37.93%。
[0017]與現有技術相比，本發明具有以下優點:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)A053發酵液的制備工藝簡單，抑真菌譜廣，對鐮刀菌生防效果好。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) A053的菌落形態。
[0019]圖2為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)A053的發酵上清液對不同植物致病真菌的抑菌效果圖。在圖2中:A，立枯絲核菌，B，核盤菌，C，宛氏擬青霉，D，鐮刀菌，E，綠色木霉，F,長柄鏈格孢，G,香蕉炭疽菌
[0020]圖3為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)A053的發酵液防治棉花枯萎病菌的盆栽試驗生防效果。在圖3中，實驗組:枯草芽孢桿菌(Bacillus sUbtilis)A053發酵液處理過棉花植株；對照組:發酵培養基處理過棉花植株(作為陰性對照)。
【具體實施方式】
[0021 ] 下面結合實施例對本發明作進一步描述。
[0022]實施例1:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) A053的分離篩選[0023]本發明涉及枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)A053來源于本 申請人:來自中國第三次北極科學考察期間所采集的海水樣品(N78° 57' 09.2"，E12° 00' 02.3")中所分離獲得，該菌在LB培養基上生長，30°C培養24h后，菌體呈淺黃色，菌落較大，見圖1。
[0024]實施例2:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) A053菌種鑒定
[0025]利用16S rDNA 通用引物 27F 和 1495R(27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAT ；1495R:ACGGCTACCTTGTTACGACTT)對枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) A05316S rDNA 序列進行PCR (聚合酶鏈式反應)擴增。以北極來源枯草芽孢桿菌A053總DNA為PCR擴增模板，在Eppendorf PCR擴增儀上進行PCR反應。反應條件為:94°C變性Imin ;55°C退火lmin;72°C延長1.5min，30個循環。擴增基因送測序公司測序，獲得該菌株16S rDNA序列后，將該序列通過美國國家生物技術信息中心(NCBI) BLAST搜索引擎(http://ncb1.nlm.nih.gov/blast)與GeneBank中核酸數據進行對比分析。結果發現，枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis) A05316S rDNA 序列與 Bacillus subtilis (CP002905.1)、Bacillus subtilis(EU047884.1)、Bacillus subtilis(HQ327126.1)、Bacillussubtilis (AB325584.1)等菌株的序列相似性為99%，因此，將其命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) A053。
[0026]實施例3:植物致病真菌抗菌譜的測定
[0027]采用濾紙片法測定枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) A053對7種植物致病真菌的抑制活性。用直徑為6mm無菌打孔器將受試致病真菌制成菌塊，用牙簽挑取一菌塊于馬鈴薯固體培養基(PDA)平板中央，28°C的條件下培養I~2天，等待受試致病真菌菌絲體擴散生長后，在每個菌塊的四周放置若干滅菌的直徑6mm的雙層濾紙片，濾紙片距離菌塊中心0.5~1cm，再在每 個濾紙片上加50 μ L的無菌發酵上清液，繼續培養2~3天，通過與對照培養的比較，觀測菌絲體的生長是否會受到抑制，如果受試致病真菌的菌絲體受到抑制時，菌絲體會形成月牙型或者線型邊緣。結果如圖2所示，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) A053發酵上清液對立枯絲核菌、核盤菌、宛氏擬青霉、鐮刀菌、綠色木霉、長柄鏈格孢、香蕉炭疽菌等7種受試植物致病真菌具有抑制活性。
[0028]實施例4:棉花枯萎病菌(鐮刀菌感染引起)的生物防治盆栽試驗
[0029]在棉花發病較明顯時每缽澆枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) A053發酵菌液50mL，共6缽，設為實驗組；另設對照組6缽，澆清水。處理前，實驗組的發病率達45.95%，對照發病率為36.67%，實驗組的發病程度較對照組重。處理后7天，對照組的發病呈上升趨勢，發病率達69.23% ;而實驗組的發病趨勢得到遏制，發病率為37.93%，見圖3。實驗結果表明，在棉花發病后用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) A053發酵菌液澆根能在一定程度遏制枯萎病的加重，從而有利于棉花后期的恢復生長。
【權利要求】
1.枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)A053,已于2010年10月18日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏中心保藏編號為CCTCC NO:M2010269。
2.如權利要求1所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) A053在制備防治植物致病真菌發酵液中的應用。
3.如權利要求2所述應用，其特征在于所述防治植物致病真菌發酵液的制備方法如下: 首先將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)A053在含有IOml LB培養基的試管中進行活化培養，然后將活化的菌株接種到5L發酵罐中進行發酵培養，得到防治植物致病真菌發酵液。
4.如權利要求3所述應用，其特征在于所述LB培養基的組成如下:葡萄糖20g/L，KH2P046g/L，K2HP0414g/L，MgSO40.2g/L，(NH4) 2S044g/L，2ml 微量元素，0.1MPa 滅菌 30min,所述微量元素包括FeSO4.4H20, CaCl2.2H20, MnSO4.4H20, ZnCl2各ImM，過濾除菌后放入無菌試劑瓶中備用。
5.如權利要求3所述應用，其特征在于所述活化培養的時間為8~12h。
6.如權利要求3所述應用，其特征在于所述發酵培養的條件為:溫度為30~37°C，pH為6.0~8.0，時間為36~72h。
7.如權利要求3所 述應用，其特征在于所述防治植物致病真菌發酵液的使用方法如下: 將防治植物致病真菌發酵液直接噴灑在植物上。
8.如權利要求3所述應用，其特征在于植物致病真菌包括:立枯絲核菌、核盤菌、宛氏擬青霉、鐮刀菌、綠色木霉、長柄鏈格孢、香蕉炭疽菌。
【文檔編號】C12R1/125GK103589673SQ201310636419
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年12月2日 優先權日:2013年12月2日
【發明者】陳新華, 陳志騰, 崔鵬飛 申請人:國家海洋局第三海洋研究所