專利名稱：一種誘導煙草疫霉產生致病性分泌蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及植物保護技術領域，具體地說是一種誘導煙草疫霉產生致病性分泌蛋白的方法。
背景技術：
傲Phytophthora parasiticavar. nicotiana引起的煙草黑脛病是煙草生產上毀滅性病害之一，世界各地的煙草種植區均有發生，每年可造成數百億美元的損失，因此受到世界各國煙草育種學家、植物病理學家、遺傳學家的廣泛關注。煙草疫霉同時還是遺傳學和分子生物學的良好實驗材料，該病害系統是真菌-植物互作研究的模式系統，近年來的研究獲得了許多與該病原菌侵染相關的形態分化和致病因子的遺傳資源與信息，為煙草疫霉菌基因組學研究打下了良好基礎。通過致病相關基因的功能研究，可深入了解煙草疫霉菌的致病機制、并以此為途徑尋找煙草中與該病原菌致病基因相對應的抗性基因，研究寄主-病原物互作機制和抗病機制，預測該病菌群體中致病基因分布、多樣性栽培條件下致病基因的表達和變化、誘導過敏反應的功能域與致病功能域的關系，預測煙草中相應抗病基因的抗性持久性。通過鑒定致病基因控制的致病相關因子，可以尋找殺菌劑的作用靶點，最終為有效控制煙草黑脛病提出新的策略。但是多年研究結果表明，目前還沒有能夠誘導煙草疫霉菌產生致病性分泌蛋白的方法，從而無法確定其致病相關因子，限制了對其致病機理的深入研究。
發明內容
本發明的目的是克服煙草疫霉菌在固體培養條件下無法產生分泌蛋白的不足，提供一種能夠誘導煙草疫霉病菌產生致病性分泌蛋白的方法。本發明的誘導煙草疫霉菌產生致病性分泌蛋白的方法是按以下步驟進行
(1)將煙草黑脛病樣用自來水沖洗干凈病株莖稈表面，待風干后從病健交界處取 0. 4cmX0. 4cm髓部組織塊置于燕麥培養基，置于黑暗條件下培養3 4天，再接種到燕麥培養基上，置于黑暗條件下培養3 4天；形成較大的菌落；
(2)形成較大的菌落后，將菌絲塊轉接到300mL分泌蛋白液體誘導培養基；分泌蛋白液體誘導培養基由以下部分組成酵母浸膏0.5 -lmg/L、葡萄糖25-30g /L、NaH2PCM 0. 5 -0. 75g/L、MgS04 ·7Η20 0. 25 — 0. 4g/L、天門冬酰胺 1· 5 — 2g/L、VBl 1· 5 — 2mg/L、H20 1L, 于，120rpm振蕩培養2周；
(3)用雙層滅菌濾紙濾去菌絲體，濾液經5000rpm離心20min，上清液加入100%飽和硫酸銨溶液，于10000 rpm離心30min，沉淀經IKD (透析帶截流范圍)透析帶處理，凍干后獲得煙草疫霉致病性分泌蛋白提取物，-20°C保存；
(4)將得到的蛋白提取物用ΙΟΟμΙ除離子水溶解后，在成株期煙草葉片上進行接種實驗，驗證所提取蛋白的特性。本發明的有益效果是解決了煙草疫霉菌在人工培養條件下不產生致病性分泌蛋白的問題，通過對液體培養基配方調整，加入少量無機鹽及氨基酸，從而誘導煙草疫霉菌大量產生致病性分泌蛋白。通過對這些分泌蛋白的分離和提純，可以深入研究煙草疫霉與寄主之間在蛋白質水平上的相互作用，最終揭示二者在基因水平上的相互識別、信號傳導等機理，對于煙草黑脛病致病機理的研究具有重要意義。
具體實施例方式將分離得到的煙草疫霉菌在燕麥固體培養基上培養，然后轉入致病性分泌蛋白液體誘導培養基中培養，最后提取煙草疫霉菌致病性分泌蛋白，蛋白提取物在煙草葉片上接種，調查壞死斑。實施例1
將煙草黑脛病樣帶回實驗室，用自來水沖洗干凈病株莖稈表面。待風干后從病健交界處取0. 4cmX0. 4cm髓部組織塊置于燕麥培養基，置于黑暗條件下培養3 4天。燕麥培養基由以下部分組成燕麥片30g，瓊脂20g，蒸餾水IOOOml ；將分離獲得的煙草疫霉病菌弱致病性菌株Yl接種到由燕麥片30g，瓊脂20g，蒸餾水IOOOml組成的普通固體培養基上，置于黑暗條件下培養3 4天；形成較大的菌落后，將菌絲塊轉接到300mL致病性分泌蛋白液體誘導培養基中，該培養基由以下部分組成酵母浸膏0.5 mg/L、葡萄糖25g /L、NaH2P04 0. 5g/L、MgS04 · 7H20 0. 25g/L、天門冬酰胺 1. 5g/L、VBl 1. 5mg/L、H2O 1L,于 28°C，120rpm振蕩培養2周；用雙層滅菌濾紙濾去菌絲體，濾液經5000rpm離心20min，上清液加入100%飽和硫酸銨溶液，10000 rpm離心30min，沉淀經IKD透析帶處理，凍干后獲得煙草疫霉分泌蛋白提取物，-20°C保存。實施例2
將分離獲得的煙草疫霉病菌強致病性菌株Y2、Y3接種到由燕麥片30g，瓊脂20g，蒸餾水IOOOml組成的普通固體培養基上，置于黑暗條件下培養3 4天；形成較大的菌落后，將菌絲塊轉接到300mL由致病性分泌蛋白液體誘導培養基中，該培養基由以下部分組成酵母浸膏 1 mg/L、葡萄糖 30g /L、NaH2PCM 0. 75g/L、MgS04 · 7H20 0. 4g/L、天門冬酰胺 2g/L、VBl 2mg/L,H20 1L，于，120rpm振蕩培養2周；用雙層滅菌濾紙濾去菌絲體，濾液經5000rpm離心20min，上清液加入100%飽和硫酸銨溶液，10000 rpm離心30min，沉淀經 IKD透析帶處理，凍干后獲得煙草疫霉分泌蛋白提取物，-20°C保存。將上述實施例1、實施例2所提取、保存的分泌蛋白接種到煙草品種1(3 上，接種 7天后調查壞死斑大小，結果表明壞死病斑由內至外，依次形成灰白斑、水漬圈和褐斑圈的感病癥狀，而且菌株致病性越強，誘導蛋白致病性也越強。壞死斑大小見下表
權利要求
1. 一種誘導煙草疫霉產生致病性分泌蛋白的方法，其特征在于按以下步驟進行(1)將煙草黑脛病樣用自來水沖洗干凈病株莖稈表面，待風干后從病健交界處取 0. 4cmX0. 4cm髓部組織塊置于燕麥培養基，置于黑暗條件下培養3 4天，獲得的煙草疫霉病菌致病性菌株，再接種到燕麥培養基上，置于黑暗條件下培養3 4天；形成較大的菌落；(2)形成較大的菌落后，將菌絲塊轉接到300mL分泌蛋白液體誘導培養基；分泌蛋白液體誘導培養基由以下部分組成酵母浸膏0. 5 -lmg/L、葡萄糖25-30g /L、NaH2PCM 0. 5 一 0. 75g/L、MgS04 ·7Η20 0. 25 — 0. 4g/L、天門冬酰胺 1. 5 — 2g/L、VBl 1· 5 — 2mg/L、H20 1L, 于，120rpm振蕩培養2周；(3)用雙層滅菌濾紙濾去菌絲體，濾液經5000rpm離心20min，上清液加入100%飽和硫酸銨溶液，于10000 rpm離心30min，沉淀經透析帶IKD處理，凍干后獲得煙草疫霉致病性分泌蛋白提取物，-20°C保存。
全文摘要
本發明涉及一種誘導煙草疫霉產生致病性分泌蛋白的方法。其方法是將煙草黑脛病樣帶回實驗室，用自來水沖洗干凈病株莖稈表面。待風干后從病健交界處取0.4cm×0.4cm髓部組織塊置于燕麥培養基，置于28℃黑暗條件下培養3～4天，形成較大的菌落后，將菌絲塊轉接到300mL分泌蛋白液體誘導培養基中，于28℃，120rpm振蕩培養2周，用雙層滅菌濾紙濾去菌絲體，濾液經5000rpm離心10min，上清液加入硫酸銨，10000rpm離心20min，沉淀經透析處理，凍干后獲得煙草疫霉的分泌蛋白，-20℃保存。此方法可以誘導煙草疫霉菌大量產生致病性分泌蛋白，填補了國內外煙草疫霉致病機理研究中不能獲得分泌蛋白的空白，具有重大意義。
文檔編號C12P21/00GK102321711SQ20111025506
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月31日 優先權日2011年8月31日
發明者周曉罡, 常壽榮, 徐潔, 王紹坤, 羅華元 申請人:云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所, 紅云紅河煙草(集團)有限責任公司