用于檢測gdnf剪接變異體2、4的實時熒光定量pcr專用引物及方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于檢測GDNF剪接變異體2、4的實時熒光定量PCR專用引物及方法。所述引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。所述熒光定量PCR方法，以腦組織cDNA樣品為模板，同時設立無模板對照，利用上述的引物，摸索并優化定量反應體系的條件參數，開發出可靠、靈敏的剪接變異體定量檢測方法。本發明可以檢測GDNF剪接變異體2（GenecodeNO.：NM_001190469.1）和剪接變異體4（GenecodeNO.:NM_199231.2）表達水平，具有特異性強、重復性高的優點。
【專利說明】用于檢測GDNF剪接變異體2、4的實時熒光定量PCR專用引物及方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物檢測領域，具體涉及檢測GDNF剪接變異體的實時熒光定量PCR的方法，特別涉及一種檢測⑶NF剪接變異體2 (Gene code N0.:NM_001190469.1)和剪接變異體4 (Gene code N0.:NM_199231.2)表達水平的引物。
【背景技術】
[0002]膠質細胞系源性神經營養因子(glialcell-line derived neurotrophicfactor, GDNF)是一個研究歷史較長的蛋白，最初在大鼠膠質瘤細胞株B49的培養基中分離出來，被認為可維持神經元的發育和再生，促進神經元軸突的生長(Lin et al.1993)。從蛋白質結構來看，⑶NF屬轉化生長因子_β超家族成員(transforming growthfactor- β , TGF- β ) (Airaksinen and Saarma, 2002)。距今為止，各國研究者對它的研究已接近20年，對其生物學作用也開展了多方面探索，認為該蛋白不僅僅以旁分泌途徑作用于其他細胞，也以自分泌途徑作用于自身，是一個具重要調節作用多效能營養因子。比如:在帕金森病動物模型和一些體外研究中，該因子保護多巴胺能神經元，是一個很重要的治療帕金森病的候選因子(Lin et al., 1993; Bjorklund et al., 2000;Airaksinen and
Saarma, 2002);在生殖方面的研究中，⑶NF可在支持細胞中分泌，通過旁分泌途徑對精原干細胞的增值和分化起具有決定作用(Guan et al，2006)。 [0003]人類⑶NF基因位于5號染色體pl2_pl3.1區，含2個啟動子、4個內含子和5個外顯子(Baecker PA et al，1999，結構模式圖詳見圖1)。該基因在轉錄過程中外顯子4發生5’選擇性剪切，同時由于存在兩個啟動子，可轉錄為不同的mRNA序列，其剪接模式詳見圖2。
[0004]在對基因轉錄過程中的產生的各種mRNA剪接變異體進行檢測過程中，通常采用復雜且昂貴的雜交探針，相較于雜交探針的方法，采用熒光定量PCR具有快速、廉價和精確的特點，為達到檢測基因的選擇性剪接目的，適應于熒光定量方法，篩選出合適的引物以及適當的PCR擴增條件體系是關鍵。針對現有技術的檢測發現，國內外尚未用于檢測GDNF剪接變異體2、4 (亦即pre-(i3)pix)-GDNF)的實時熒光定量PCR專用引物及方法的報道。
【發明內容】
[0005]為解決以上技術問題，需要開發專門用于檢測pre-( β )pro-GDNF mRNA表達水平的實時熒光定量PCR專用引物及方法。本發明目的之一在于提供一種特異性引物，用于人組織或細胞內剪接變異體2 (Gene code N0.:NM_001190469.1)和剪接變異體4 (Genecode N0.:NM_199231.2)熒光定量檢測(注:如【背景技術】所述，由于該兩個剪接變異體存在相同的78bp剪接片段缺失，該種類型剪接變異體被稱之為pre-W )pro-GDNF，故以下均用pre-(^ )pro-GDNF代表以上cDNA序列)。本發明的另一個目的在于提供一種用于檢測人組織或細胞內pre-(i3 )pix)-GDNF實時熒光定量檢測的實時熒光定量PCR的方法。[0006]本發明的目的是這樣實現的:
[0007]一種用于檢測pre-(i3)pro-GDNF mRNA表達水平實時熒光定量的引物，其關鍵在于:其特異性雙向引物，其核苷酸序列分別如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。
[0008]特異性序列的弓丨物序列為:
[0009]上游引物:CCGCCGGACGGGACTTTA(SEQID N0.1),
[0010]下游引物:ATATTTGCGGCGGGCAGC(SEQ ID N0.2)。
[0011]一種用于檢測人組織或細胞內檢測pre-W )pro-GDNF mRNA表達水平的實時熒光定量方法。其特征包括以下幾個步驟:
[0012]人組織或細胞cDNA標準品的制備，以樣品cDNA為模板，利用本發明提供的引物進行熒光定量PCR，建立實時熒光定量PCR的體系。
[0013]本發明提供的優選實時熒光定量擴增反應程序:
[0014]應用LightCycler? 480System Real Time PCR 擴增儀，95 °C 預變性 30 秒，ICycle ;95°C變性 5 秒，60°C退火 20 秒，72°C延伸 10 秒，40Cycles ；
[0015]本發明提供的優選配制PCR反應液，包括:SYBR? PremiX Ex Taq (TAKARADRR041A) 10 μ I, PCR Forward Primer (SEQ ID N0.1,10 μ M) 0.5 μ I, PCRReverse Primer(SEQ ID N0.2，10 μ M) 0.5 μ 1，cDNA 模板 I μ I, dH208 μ I。
[0016]該方法的有益效果主要體現在:本發明通過設計特異性引物，用于特異性檢測人組織或細胞中pre- ( β ) pro-GDNF mRNA表達水平，通過摸索并優化實時熒光定量PCR反應體系的條件參數等，建立一種快速有效的熒光定量PCR檢測方法，可對人組織或細胞中的pre-(^)pro-GDNF mRNA表達水平進行準確的定量檢測。通過融解曲線、擴增效率等驗證，結果表明該體系特異性強、重復性好、操作簡單，可作為準確檢測pre-(P )pro-GDNF mRNA表達水平檢測樣品的手段。
[0017](I)特異性強:結果顯示，該熒光定量PCR引物僅對pre-W)pro-GDNF mRNA進行特異性擴增，而對其他GDNF剪接變異體如pre- ( a ) pro-GDNF mRNA均未見擴增。
[0018](2)重復性好:同樣樣品PCR模板與Ct值之間具有良好的線性函數關系，操作簡單大大縮短檢測周期。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1為人類⑶NF基因示意圖注:1、據EMBL-bank、GenBank中數據修訂，原圖自Baecker et al.(1999)，黑色方框表示外線子，黑色實線表示內含子；2、虛線內所示區域為外顯子I至外顯子4序列結構，基因在轉錄過程中該區域發生的選擇性剪接，可轉錄為不同的mRNA序列。
[0020]圖2為⑶NF基因選擇性剪接位點及引物設計位點示意圖。(A)由于⑶NF基因在轉錄過程中在外顯子4和5之間存在選擇性剪接，導致對應轉錄為不同的mRNA，其Genecode N0.分別為:ΝΜ_000514.3、ΝΜ_001190469.1、ΝΜ_001190468.1、ΝΜ_199231.2。由于ΝΜ_001190469.1和ΝΜ_199231.2都存在5’選擇性剪接，兩個剪接變異體存在相同的78bp剪接片段缺失，該種類型剪接變異體被稱之為pre-( β )pix)-GDNF，78bp剪接片段沒有缺失的 NM_000514.3 和 ΝΜ_001190468.1 稱之為 pre- ( a ) pro-GDNF ; (B)該 SEQ ID N0.1 和 SEQIDN0.2的引物對組合可特異性擴增pre-W )pro-GDNF。[0021]圖3為該熒光定量引物的特異性評價。其中，A為采用該引物獲得的目的基因的電泳圖譜，I為DNA Marker，2-7為PCR產物，采用該對引物獲得目的片段，其大小為lOObp，符合設計要求為熒光定量產物熔解曲線，多個重復的熔解曲線具有單一峰值。
[0022]圖4為引物擴增效率標準曲線:采用該引物，熒光定量體系條件下，采用標準品cDNAlO倍系列稀釋的擴增效率曲線，誤差為0.00817，擴增效率為1.968，斜率為:-3.400，截距為:26.93，相關系數為:0.999。
[0023]圖5為引物精確度評價:采用該引物，熒光定量體系條件下，采用標準品cDNAlO倍系列稀釋及陰性對照的擴增曲線。
[0024]圖6為在60°C條件采用熒光定量體系和引物檢測，神經膠質細胞中SYBRGreen I實時熒光定量PCR檢測pre-(i3)pro-GDNF表達量。A為Ct值曲線；B為Ct值數值；C為熔解曲線檢測整個過程中熒光實時信號。
【具體實施方式】
[0025]以下實施例進一步說明本方法的內容，但不以任何形式限制本發明。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領技術人員所熟知的常規手段。
[0026]實施例1
[0027]pre-( β ) pro-GDNF表達檢測特異性引物的設計，針對研究背景所述pre_(3 )pro-⑶NF mRNA的特殊序列,應用Primer Premier5.0軟件設計引物序列。交由上海生工生物有限公司合成。
[0028]本發明得到的引物序列為:
[0029]上游引物:CCGCCGGACGGGACTTTA(SEQID N0.1),
[0030]下游引物:ATATTTGCGGCGGGCAGC(SEQ ID N0.2)。
[0031]實施例2RNA提取
[0032]在培養U251細胞的培養板中加入TRIzol (Invitrogen公司)裂解細胞，每IOcm2面積加入Iml Trizol，移液器吸打后，室溫靜置5min，加入0.2ml氯仿，顛倒混勻15s，靜置2min后，4°C條件下1000Og離心lOmin，吸取上層水相至另一干凈EP管中，加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置IOmin后，4°C條件下1000Og離心lOmin，棄上清；加入lml85%乙醇洗滌沉淀。4°C，5000g離心30s，棄上清；晾干，加入30 μ I的DEPC H2O溶解。
[0033]實施例3mRNA 反轉錄:按照 1st strand cDNA synthesis kit (TAKARA D6210S)試劑盒說明進行反轉錄。
[0034]Ist-Strand cDNA 合成反應
[0035]1.在 Microtube 中配制下列反應混合液:01igo dT Primer (50 μ Μ) I μ I, dNTPMixture (IOmM each) I μ I, Total RNA:5 μ g 以下，加入 RNase free dH20 至 10μ1。
[0036]2.65°C保溫5min后，冰上迅速冷卻。
[0037]3.在上述Microtube管中配制下列反轉錄反應液,總量為20 μ I。上述變性后反應液 10 μ I, 5XPrimeScript II Buffer4 μ I, RNase Inhibitor (40U/ μ I) 0.5 μ I (20U),PrimeScript II RTase (200U/μ I) I μ I (200U)，加入 RNase free dH20 至 20μ1。緩慢混勻。
[0038]4.按下列條件進行反轉錄反應:30°C IOmin,42°C 40min,95°C 5min,冰上冷卻。獲得 cDNA。
[0039]實施例4膠質瘤細胞內檢測pre-(i3)pro-GDNF mRNA表達水平的實時熒光定量方法的建立。本發明提供的優選實時熒光定量擴增反應程序:
[0040]應用LightCycler? 480System Real Time PCR 擴增儀，將所有 DNA 樣品分別配置 Realtime PCR 反應體系。體系配置如下:SYBR? Premix Ex Taq (TAKARA DRR041A)10 μ I,PCR Forward Primer (SEQ ID N0.1,10 μ M) 0.5 μ I,PCR Reverse Primer (SEQ IDN0.2，10 μ M) 0.5 μ 1，cDNA模板I μ 1，dH208 μ 1，輕彈管底將溶液混合，5000rpm短暫離心；將19 μ I混合液加到PCR板對應的每個孔中，再加入對應的I μ I DNA,小心粘上封口膜，并短暫離心混合。在設置PCR程序前將準備好的PCR板放在冰上。
[0041]所有的指 標均按以下程序進行:
[0042]95°C預變性30秒，ICycle ;95°C變性5秒，60°C退火20秒，72°C延伸10秒(收集熒光)，40Cycles ;從601:緩慢加熱到95°C執行熔解曲線檢測。
【權利要求】
1.用于檢測GDNF剪接變異體2、4的實時熒光定量PCR專用引物及方法，其特征在于:實時熒光定量PCR專用引物，主要用于檢測人組織或細胞內剪接變異體2(Gene code N0.:NM_001190469.1)和剪接變異體4 (Gene code N0.: NM_199231.2)表達量，其核苷酸序列分別如 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 所示。
2.用于檢測GDNF剪接變異體2、4的實時熒光定量PCR專用引物及方法，其實時熒光定量PCR方法，主要用于檢測人組織或細胞內pre-( β )pro-GDNF實時熒光定量檢測的方法，其特征在于:應用 LightCycler--480 System Real Time PCR 擴增儀，95°C預變性 30 秒，ICycle ;95°C變性5秒，60°C退火20秒，72°C延伸10秒，40 Cycles ;本發明提供的優選配制PCR 反應液，包括:SYBR--Premix Ex Taq (TAKARA DRR041A)10 μ I,PCR Forward Primer(SEQ ID N0.1,10 μ M) 0.5 μ I, PCR Reverse Primer (SEQ ID N0.2,10 μ M) 0.5 μ I,cDNA 模板 I μ 1，dH20 8 μ I。
【文檔編號】C12N15/11GK103614481SQ201310648187
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月4日 優先權日:2013年12月4日
【發明者】李 亨, 高殿帥, 張寶樂, 柴祥, 何濤 申請人:徐州醫學院