一種雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的自然殺傷細胞的制備方法及其試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的自然殺傷細胞的制備方法及其試劑盒，其中包括如下特征:構建成含特異結合信號淋巴細胞激活分子家族成員7(Signaling Lymphocytic Activat1n Molecule Family ,Member 7，SLAMF7)以及纖連蛋白變異體(fibronectin variant，FNv)的雙特異嵌合抗原受體(double chimeric antigenreceptor，D1-CAR)基因重組到病毒載體上并轉染人自然殺傷細胞(NaturaI killercells，NK)，高表達該雙特異性嵌合抗原受體基因，可特異結合表達信號淋巴細胞激活分子家族成員7和纖連蛋白變異體的腫瘤細胞，并抑制自然殺傷細胞抑制性受體表達，避免了腫瘤細胞免疫逃避；同時激活第一信號和共刺激信號而引發抗腫瘤細胞毒性活性，體內體外試驗抗腫瘤具有很強殺傷毒性;本發明還提供了一種含通過上述方法而得到的自體自然殺傷細胞制備的試劑盒，可獲得高表達該雙特異性嵌合抗原受體基因并引發強大的抗腫瘤效應。
【背景技術】
[0002]自然殺傷細胞是目前在國內進行臨床治療常見的免疫細胞技術。目前NK細胞主要通過滋養細胞或者抗體激活誘導作用獲得的，表達CD16+CD56+陽性細胞。其抗腫瘤主要機制為通過其表達激活性受體與腫瘤細胞膜上配體結合，釋放顆粒酶和穿孔素直接殺死腫瘤細胞，以及高表達的CD16分子引發抗體依賴性細胞毒性活性對腫瘤細胞產生凋亡作用。
[0003]然而，NK細胞在臨床上治療惡性腫瘤方面療效還有限，根據臨床治療數據統計包括腫瘤完全消失的完全緩解和腫瘤部分縮減的部分緩解的有效率在40-50%之間，還遠遠不能滿足臨床治療惡性腫瘤的需要。影響NK細胞治療癌癥的效果的關鍵問題是NK細胞靶向腫瘤細胞殺傷特異性差，以及其表達抑制性受體，使得腫瘤細胞可以通過結合其產生免疫逃逸。目前提高NK細胞數量、CD16+⑶56+表型和降低抑制性受體表達，均已有研究開展，以有效提尚其治療癌癥的有效率。
[0004]本發明提供了以結合腫瘤細胞特異表達的SLAMF7以及FNv的雙特異嵌合抗原基因重組到病毒載體上并轉染人自然殺傷細胞，高表達該雙特異性嵌合抗原受體基因，可特異結合表達信號淋巴細胞激活分子家族成員7和纖連蛋白變異體的腫瘤細胞，如黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤和脈絡膜黑色素瘤等均特異表達SLAMF7以及FNv兩個腫瘤抗原;并抑制自然殺傷細胞抑制性受體表達，避免了腫瘤細胞免疫逃避；同時激活第一信號和共刺激信號而引發抗腫瘤細胞毒性活性，體內體外試驗抗腫瘤具有很強殺傷毒性，將顯著提高臨床療效和延長患者生存期。
【發明內容】
[0005]本發明針對現有臨床應用NK細胞技術的不足，特別是因NK細胞靶向腫瘤細胞殺傷特異性差;NK細胞表達抑制性受體，使得腫瘤細胞可以通過結合其產生免疫逃逸，以及在體內激活患者自身免疫作用抗腫瘤不足，因而造成殺瘤活性低和大多數惡性腫瘤治療有限。本發明在前期研究工作中發現黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤和脈絡膜黑色素瘤等均特異表達兩個腫瘤抗原SLAMF7和FNv，根據這兩個腫瘤抗原的胞外區通過雜交瘤技術獲得與兩者特異性結合反應的單克隆細胞株和單克隆抗體，蛋白測序確定單克隆抗體的重鏈和輕鏈的可變區，利用基因PCR技術將重鏈和輕鏈通過鏈接子(Iinker)連接產生單鏈抗體(singlechain antibody fragment, scFv)，在酶聯免疫法和細胞流式檢測該兩個scFv能特異結合SLAMF7和FNv兩個腫瘤抗原，腫瘤細胞為黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤和脈絡膜黑色素瘤等，這兩個scFv可以作為結合SLAMF7和FNv兩個腫瘤抗原的抗體。
[000?]本申請發明人發現轉錄因子-原癌基因c-My c結合NK細胞抑制性受體(killercell immunoglobulin-like receptor，KIR)表達啟動子，啟動NK細胞KIR的表達而介導腫瘤細胞的免疫逃逸功能。我們發現將c-Myc中362位點亮氨酸突變為纈氨酸產生的c-Myc突變體，可以與KIR基因表達啟動子結合，但KIR基因不表達，表明該c-Myc突變體可抑制KIR基因表達，從而阻止了 NK細胞表達抑制性受體介導的免疫逃逸作用。因而我們根據這些科研結果，構建成含特異結合SLAMF7以及FNv的雙特異嵌合抗原受體基因，并引入c-Myc突變體以及⑶28、CDl37和⑶3ζ胞內信號區的基因片段，重組到病毒載體上并轉染人自然殺傷細胞，高表達該雙特異性嵌合抗原受體基因，體內體外試驗抗腫瘤具有很強殺傷毒性。
[0007]本發明涉及一種雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的自然殺傷細胞的制備方法，其特征在于，構建成含特異結合SLAMF7以及FNv的雙特異嵌合抗原受體基因重組到病毒載體上并轉染人自然殺傷細胞，高表達該雙特異性嵌合抗原受體基因，可特異結合表達信號淋巴細胞激活分子家族成員7和纖連蛋白變異體的腫瘤細胞，并抑制自然殺傷細胞抑制性受體表達，避免了腫瘤細胞免疫逃避；同時激活第一信號和共刺激信號而引發抗腫瘤細胞毒性活性，體內體外試驗中激活了強烈地抗腫瘤應答。
[0008]所述雙特異性嵌合抗原受體基因的cDNA(D1-CAR)構建在病毒載體中，并轉染NK細胞，再將NK細胞培養到第21天，獲得D1-CAR-NK細胞，通過熒光定量PCR技術檢測，轉染了D1-CAR病毒載體的NKs其表達D1-CAR基因高于未轉染的NKs為50倍以上；
[0009]所獲得自然殺傷細胞，其高表達其特異標志物⑶16+/⑶56+，陽性率高于80%以上，激活性受體陽性率超過80 %以上，而抑制性受體陽性率低于1 %以下。
[0010]本發明所述雙特異嵌合抗原受體基因中SLAMF7以及FNv單鏈抗體特異結合惡性腫瘤細胞表達的SLAMF7以及FNv抗原，使得NK細胞產生抗腫瘤的靶向特異性，優選地，為靶向黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤和脈絡膜黑色素瘤等。
[0011]本發明所述的纖連蛋白變異體的特異嵌合抗原受體基因，包括纖連蛋白變異體的單鏈抗體并鏈接了特異結合抑制性受體基因啟動子的轉錄因子突變體(c-Myc突變體)的基因片段，抑制自然殺傷細胞表達抑制性受體，避免了腫瘤細胞免疫逃避，其高表達激活性受體特異結合腫瘤細胞表面配體而產生細胞毒性作用。所述轉錄因子c-Myc突變體，優選地，將該基因cl641位點突變為g，即亮氨酸(Leu362)突變為纈氨酸，可結合KIR基因上游啟動子并抑制了其轉錄。
[0012]本發明所述的含特異結合信號淋巴細胞激活分子家族成員7的特異嵌合抗原受體基因，包括特異結合信號淋巴細胞激活分子家族成員7的單鏈抗體并串聯了兩個共刺激分子胞內域(CD28和CD137)和CD3G胞內信號區的基因片段，可激活第一信號和共刺激信號，SP激活機體免疫應答而引發抗腫瘤細胞毒性活性和腫瘤凋亡作用。
[0013]同時所述雙特異性嵌合抗原受體基因之間鏈接了弗林蛋白酶切割位點，其在細胞內蛋白翻譯后可產生兩個獨立發揮功能的嵌合抗原受體。
[0014]本發明所述方法中自然殺傷細胞來源于自體靜脈血、自體骨髓、臍帶血和胎盤血等的單個核細胞。優選地，來源于癌癥患者手術一個月后、放化療一個月后采集的新鮮外周血或骨髓。
[0015]本發明所述將人IFNy-信號肽-scFv(SLAMF7)-CD8a 鉸鏈區-CD28-CD137-CD3G 胞內區，以及ScFv(FNv)-1gD鉸鏈區-c-Myc突變體通過Furin切割位點和連接序列連接在一起，形成重組基因序列，基因序列通過化學合成獲得，形成完整的雙特異性嵌合抗原受體基因的。0嫩，8口0^八1?。
[0016]將D1-CAR構建在病毒載體中，并轉染患者自體NK細胞，再將NK細胞培養到第21天，獲得D1-CAR-NK細胞。通過熒光定量PCR技術檢測，轉染了D1-CAR病毒載體的NKs其表達D1-CAR基因高于未轉染的NKs為50倍以上。蛋白印跡技術檢測其D1-CAR融合蛋白表達水平，可
53kDa和scFv(FNv)-CAR 42kDa的融合蛋白。
[0017]本發明所述方法中來源30ml外周血單個核細胞誘導培養獲得自然殺傷細胞，增殖倍數達1000倍以上，培養到21天自然殺傷細胞數達3 X 19以上。
[0018]本發明所述方法中培養獲得的自然殺傷細胞，高表達其特異標志物⑶16+/⑶56+，陽性率高于80%以上，激活性受體陽性率超過80%以上，而抑制性受體陽性率低于10%以下，所述的自然殺傷細胞引發抗體依賴性的細胞毒性活性，體內體外試驗具有很強抗腫瘤殺傷毒性。
[0019]本發明使用的NK細胞激活培養器為使用小鼠抗人CD16單克隆抗體包被的培養板，包括48孔板、24孔板、12孔板、6孔板和培養瓶，優選地為24孔板。
[0020]本發明使用的細胞培養基為淋巴細胞無血清培養基或RPMI1640培養基加入含1-500ng/ml IL-15、l_500ng/ml IL-12、l_500ng/ml IL-18、10-2000活性單位(IU)/ml IL-2和10 % (體積比)自體血清或胎牛血清，優選地，細胞培養基為淋巴細胞無血清培養基，如CellGro SCGM、A頂_V、X_VIV0和GT-T551 等，含有l_500ng/m