鱖魚傳染性脾腎壞死病毒lamp檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種用環介導等溫擴增（LAMP）技術快速檢測鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的試劑盒及其檢測方法。本發明含有10×等溫反應緩沖液、BstDNA聚合酶8U/μL、10mMdNTP、25mM硫酸鎂、10μM內引物1、10μM內引物2、10μM外引物1、10μM外引物2、30μM環引物1、30μM環引物2和5M甜菜堿的反應液A和反應液B：1000×的熒光染料SYBRGreenI。通過對組織樣品中鱖魚傳染性脾腎壞死病毒DNA提取、環介導等溫擴增、產物的顯色檢測等方法，從而實現對鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的快速檢測。本技術解決了現有檢測技術檢測時間長、操作復雜、需要昂貴儀器等缺點，適用于養殖場、獸醫站等的快速現場檢測。
【專利說明】鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，涉及一種用環介導等溫擴增(LAMP)技術快速檢測鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的試劑盒及其使用方法。
【背景技術】
[0002]鱖魚(Siniperca chuatsi))是中國的名優淡水養殖品種，其肉質鮮美，享有“淡水石斑”之稱。隨著鱖養殖規模的擴大，病害問題益發突出，其中又以鱖魚傳染性脾腎壞死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV )引起的危害最大。績魚傳染性脾腎壞死病毒具有很強的致病性，流行快、發病率高，并且目前尚無有效的控制措施，一般10天內鱖魚的死亡率達90%左右。由于鱖魚傳染性脾腎壞死病毒感染還沒有真正有效的治療手段，因此，病毒的及時檢測對于鱖魚養殖業的發展十分重要。
[0003]國內外常用的鱖魚傳染性脾腎壞死病毒檢測方法有常規組織學方法(HE染色)、電鏡觀察、分離外源核酸和核酸探針原位雜交技術等。這些檢測相對耗時比較長、技術要求高、工作量大。而目前普遍采用的PCR法雖然特異性強、靈敏度高，但是容易交叉污染，且操作繁瑣和需要價格較高的PCR儀等專業設備，限制了其應用。實時定量PCR技術雖然解決了常規PCR檢測方法的交叉污染問題，并簡化了操作步驟，但卻需要更昂貴的實時定量PCR設備，且PCR熒光探針的成本也較高，大大限制了其應用。
[0004]環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplication, LAMP)技術是Notmi等(2000年)開發出來的一種連續、恒溫、基于酶反應的新型核酸擴增方法，其原理是針對靶基因的6個區域設計兩對特殊的內、外引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)在恒溫(60~65°C)條件下啟動循環鏈置換反應。在祀標DNA區啟動互補鏈合成,結果在同一鏈上互補序列周而復始形成有很多環的花椰菜結構的莖-環DNA混合物。LAMP反應過程中從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應液`中的Mg2+結合，形成副產物焦磷酸鎂呈現乳白色沉淀，加入顯色液即可肉眼觀察判斷沉淀與否。4條引物針對靶序列的6個特異性區域識別，保證了 LAMP方法的高度特異性；本方法可檢測到只及PCR法的1/10~1/100的拷貝數，靈敏度高；LAMP反應只需在恒定溫度下反應即可，不需要預先的DNA變性等步驟，耗時短；本方法也不需要昂貴的儀器設備，只需一臺水浴鍋，投資小。因此，LAMP法檢測非常適合于基層單位的檢測需要。
【發明內容】
[0005]本發明的一個目的是解決現有技術檢測鱖魚傳染性脾腎壞死病毒所需周期長、現場應用困難、特異性低和靈敏性低的問題，提供一種基于環介導等溫擴增技術檢測鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的檢測試劑盒及方法，可廣泛用于鱖魚養殖場、基層檢測單位等的現場疾病診斷。
[0006]本發明的技術方案是:
根據GenBank中所公布的來源于世界各地鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的核酸序列中同源性較高的部位，設計并合成環介導等溫擴增用所用的特異性引物組。該引物組在實際應用中可實現對臨床鱖魚傳染性脾腎壞死病毒特異性診斷。我們對該引物組進一步開發成鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測試劑盒。
[0007]一種鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測試劑盒，包括以下成分:
(1)反應液A:含有IOX等溫反應緩沖液、Bst DNA聚合酶8U/ii L、10mM dNTP、25mM硫酸鎂、IOii M內引物UlOiiM內引物2、IOii M外引物1、IOii M外引物2、30yM環引物1、30 ii M環引物2和5M甜菜堿，其中:
IOX等溫反應緩沖液含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH 8.8)、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%的曲拉通X-100。
[0008]內引物 1: CTAGACTGGGCCACCACCTCATTTTGTCTGTGATGGGCACTTACG
內引物 2:TCATTGAACAGTGCCAGGTGGCTTTTAGGTCCAGATGCACCAAAG
外引物 1:1TGGCAATGTAGCACCCG
外引物 2:AAGAACAAGGCCTTCACGG
_環引物 1: GCTCCTCGCTTGTCAGTACAG 一
環引物 2:CGTCACGCCCGCAGACAAT
(2)反應液B:1000X的熒光染料SYBR Green I。
[0009]本發明的另一個技術方案是:
一種鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測試劑盒檢測鱖魚傳染性脾腎壞死病毒方法，其步驟包括:
(I)樣品中DNA的提取
采用商業化的基因組DNA提取試劑盒進行組織中鱖魚傳染性脾腎壞死病毒DNA的制備，作為LAMP反應的DNA模板。
[0010](2)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的等溫環介導擴增
在裝有23 ii I反應液A的反應管中加入2 ii I待檢DNA,于65 °C恒溫水浴鍋中放置40mino
[0011](3)擴增產物的顯色檢測
在上述反應管中加入Iu I反應液B，直接用肉眼觀察顏色變化，如顏色變為綠色，則說明樣品中含有鱖魚傳染性脾腎壞死病毒，若顏色為黃色，則說明待檢樣品中不含有鱖魚傳染性脾腎壞死病毒。
[0012]本發明與現有技術相比，其優點和積極效果表現`在:本發明根據GenBank中所公布的來源于世界各地的鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的核酸序列中同源性較高的八個序列部位設計了六條環介導等溫擴增所用的特異性引物組。并依據此引物組建立了一種鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測試劑盒及其檢測方法。本發明采用LAMP技術，特異性強，比目前普遍采用的PCR檢測方法有更高的靈敏度，同時也不需要昂貴的PCR儀、電泳儀和凝膠成像儀等設備，僅采用一臺水浴鍋即可，特別適于基層單位的推廣應用。
[0013]下面提供具體的實例進一步闡述本發明的技術方案和有益效果，但本發明的技術應用不限于實例。
【具體實施方式】[0014]下面對本發明的試劑盒和檢測方法進行具體的描述。
[0015]實施例1擴增引物組的獲得
根據鱖魚傳染性脾腎壞死病毒基因組序列中MCP基因相對保守的區域設計環介導恒溫擴增用引物組。從GenBank數據庫中下載10株來源于世界不同地區的傳染性胰腺壞死病毒的核酸序列，對應 Accession Number 如下:AF371960.1、JQ253372.1、HQ317465.1、AY989901.UJQ253373.UJF264349.UAB666344.UJF264350.UKC244182.UEU847416.1。利用序列分析軟件Clustal X進行同源性比較，在同源性最高的八個區域用在線的PrimerExplorer V4生物軟件設計環介導恒溫擴增用引物,并利用Primer Premier 5.0生物軟件中的引物分析功能對所設計引物進行各項參數的具體分析，最終確定本發明的6條環介導恒溫擴增用引物組，并進一步以其為核心制備檢測試劑盒。
[0016]實施例2鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的LAMP檢測試劑盒 按下列配方制作鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測試劑盒:
1、LAMP反應液A:含有IOX等溫反應緩沖液、Bst DNA聚合酶8U/y L、IOmM dNTP、25mM硫酸鎂、IOii M內引物UlOiiM內引物2、IOii M外引物1、IOii M外引物2、30yM環引物1、30 ii M環引物2和5M甜菜堿，其中:
IOX等溫反應緩沖液含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH 8.8)、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%的曲拉通X-100。
[0017]內引物 1:CTAGACTGGGCCACCACCTCATTTTGTCTGTGATGGGCACTTACG
內引物 2:TCATTGAACAGTGCCAGGTGGCTTTTAGGTCCAGATGCACCAAAG
外引物 1:1TGGCAATGTAGCACCCG
外引物 2:AAGAACAAGGCCTTCACGG
_環引物 1: GCTCCTCGCTTGTCAGTACAG 一
環引物 2:CGTCACGCCCGCAGACAAT
環介導等溫擴增(LAMP)反應液A管每管23 ii L,最佳配比為:2.5 y L IOX等溫反應緩沖液、1.0ii L Bst DNA 聚合酶(8U/ii L)、3.L IOmM dNTP,5u L 25mM 硫酸鎂、2.0 y LIOiiM 內引物 1、2.0ii L 1011]?內引物2、0.5111 10 y M 外引物 1、0.5 y L IOyM 外弓丨物 2、
0.5u L 3011]?環引物1、0.5111 3011]?環引物2、5.0111 5M 甜菜堿。
[0018]2、反應液 B:1000X 的熒光染料 SYBR Green I。
[0019]實施例3鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測試劑盒檢測鱖魚傳染性脾腎壞死病毒方法
上述鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測試劑盒檢測鱖魚傳染性脾腎壞死病毒方法，其步驟包括:
1、樣品中DNA的提取
采用商業化的基因組DNA提取試劑盒進行組織中鱖魚傳染性脾腎壞死病毒DNA的制備，作為LAMP反應的DNA模板。
[0020]2、鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的等溫環介導擴增 在裝有23 ii I反應液A的反應管中加入2 ii I待檢DNA,于65 °C恒溫水浴鍋中放置40mino
[0021]3、擴增產物的顯色檢測在上述反應管中加入Iu I反應液B，直接用肉眼觀察顏色變化，如顏色變為綠色，則說明樣品中含有鱖魚傳染性脾腎壞死病毒，若顏色為黃色，則說明待檢樣品中不含有鱖魚傳染性脾腎壞死病毒。
[0022]實施例4鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測試劑盒的敏感性檢驗
將鱖魚傳染性脾腎壞死病毒0SGIV75株的MCP基因PCR擴增出來，構建入pMD18_T質粒。以提取的含MCP基因的質粒按10倍梯度稀釋作為模板，采用本發明的鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測試劑盒及其檢測方法進行檢測，同時設立常規的鱖魚傳染性脾腎壞死病毒PCR檢測方法作為對照(上游引物:ATGTCTGCAATCTCAGGT，下游引物:TTACAGGATAGGGAAGCCTG,擴增程序:50 °C 孵育 lh，94 °C 5min, 94 °C 30s, 58 °C 30s, 72 °C30s, 72°C 5min，35個循環)。結果表明在I U g樣品DNA稀釋到1012次方時，依然能檢測到信號，說明本試劑盒具有極高的靈敏性。而常規PCR稀釋到107次方時就無信號了。
[0023]實施例5鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測試劑盒的特異性檢驗
利用鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測試劑盒對鱖魚傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)及其他常見病毒如魚出血性敗血病病毒(VHS)、魚傳染性造血器官壞死病毒(IHN)進行檢測。
[0024]具體操作同實施例3的具體方法，結果顯示，本發明的試劑盒中僅對鱖魚傳染性脾腎壞死病毒有特異性檢測結果，對其他病原微生物檢測均為陰性，說明本發明的試劑盒特異性良好。 [0025]實施例6鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測試劑盒對臨床樣品的檢測
采集臨床上懷疑鱖魚傳染性脾腎壞死病毒感染的病料18份，分別利用本試劑盒按實施例3的具體方法進行檢測。同時分別對18份病料進行常規PCR檢測。
[0026]結果表明，本試劑盒檢測的18份鱖魚病料中8份鱖魚傳染性脾腎壞死病毒陽性，與常規PCR檢測結果一致。
【權利要求】
1.一種鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測試劑盒，包括以下成分: (1)反應液A:含有IOX等溫反應緩沖液、Bst DNA聚合酶8U/ii L、10mM dNTP、25mM硫酸鎂、IOii M內引物UlOiiM內引物2、IOii M外引物1、IOii M外引物2、30yM環引物1、30 ii M環引物2和5M甜菜堿，其中: IOX等溫反應緩沖液含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH 8.8)、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%的曲拉通X-100 ；
內引物 1:CTAGACTGGGCCACCACCTCATTTTGTCTGTGATGGGCACTTACG
內引物 2:TCATTGAACAGTGCCAGGTGGCTTTTAGGTCCAGATGCACCAAAG 外引物 1:1TGGCAATGTAGCACCCG 外引物 2:AAGAACAAGGCCTTCACGG 環引物 1:GCTCCTCGCTTGTCAGTACAG 環引物 2:CGTCACGCCCGCAGACAAT (2)反應液B:1000X的熒光染料SYBR Green I。
2.根據權利要求1所述的一種鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測試劑盒，其特征在于反應液A每管23 ii L的組成為:2.5 ii L 10 X等溫反應緩沖液、1.0 y L Bst DNA聚合酶(8U/u L),3.5u L IOmM dNTP,5u L 25mM 硫酸鎂、2.0 y L 10 y M 內引物 1、2.0 y L IOuM內引物 2、0.5iiL 1011]?外引物1、0.5111 1011]?外引物2、0.5111 30 y M 環引物 1、0.5 y L3011]?環引物2、5.01^ 5M甜菜堿。
3.根據權利要求1所述的一種鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測試劑盒檢測鱖魚傳染性脾腎壞死病毒方法，其步驟包括: (1)樣品中DNA的提取 采用商業化的基因組DNA提取試劑盒進行組織中鱖魚傳染性脾腎壞死病毒DNA的制備，作為LAMP反應的DNA模板； (2)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的等溫環介導擴增 在裝有23 ii I反應液A的反應管中加入2 ii I待檢DNA,于65 °C恒溫水浴鍋中放置40min ； (3)擴增產物的顯色檢測 在上述反應管中加入Iu I反應液B，直接用肉眼觀察顏色變化，如顏色變為綠色，則說明樣品中含有鱖魚傳染性脾腎壞死病毒，若顏色為黃色，則說明待檢樣品中不含有鱖魚傳染性脾腎壞死病毒。
【文檔編號】C12Q1/70GK103667532SQ201310652799
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月9日 優先權日:2013年12月9日
【發明者】侯竹美, 方華華, 豐艷妮, 王鳳舞, 王金葉 申請人:青島農業大學