一種用于提高卷枝毛霉產γ-亞麻酸產量的發酵培養基及用途
【專利摘要】本發明涉及一種用于提高卷枝毛霉CBS108.16產γ-亞麻酸產量的發酵培養基，它含有酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸的氨基酸氮源，還涉及使用所述發酵培養基提高卷枝毛霉CBS108.16產γ-亞麻酸產量的方法。該方法包括菌種活化、種子培養、發酵培養與烘干等步驟。采用本發明得到的卷枝毛霉CBS108.16菌體生物量達到16.5～19.8g/L，比對照組提高25～52%；脂肪酸含量達到24～35%，比對照組提高11～48%；發酵液中γ-亞麻酸含量達到810～1300mg/L，比對照組提高41～124%。本發明方法操作工藝簡便，加工設備要求低，產量提高效果顯著，因此具有廣闊的應用前景。
【專利說明】一種用于提局卷枝毛霉產Y-亞麻酸產量的發酵培養基及用途
【【技術領域】】
[0001]本發明屬于微生物【技術領域】，更具體地，本發明涉及一種用于提高卷枝毛霉CBS108.16產Y -亞麻酸產量的發酵培養基，還涉及使用所述發酵培養基提高卷枝毛霉CBS108.16產Y-亞麻酸產量的方法。
【【背景技術】】
[0002]Y -亞麻酸(順式-6，9，12-十八碳三烯酸)作為一種重要的不飽和脂肪酸，它是組成人體各組織生物膜的結構材料，也是合成前列腺素的前體。Y -亞麻酸在營養保健方面有重要的作用，它能夠抗心血管疾病，降血脂，降血糖，抗癌以及美白和抗皮膚老化，其潛在的藥用價值受到廣泛的關注。
[0003]天然的Y-亞麻酸主要存在于琉璃苣、月見草和黑加侖中，其中油脂中Y-亞麻酸含量分別為22%、8%、16%。但是，植物種子采集困難，產量低，受氣候地區的影響較大，且生產周期長，現已不能滿足市場的需求。與這些傳統的富含Y-亞麻酸的植物相比，微生物擁有生長速率快，培養條件簡單，不依賴天氣等優點。因此，用微生物來替代傳統植物生產Y-亞麻酸具有廣闊的前景。卷枝毛霉，作為富含Y-亞麻酸的一種微生物，其Y-亞麻酸含量約為15~18%，在上世紀已被作為生產Y-亞麻酸的模式菌株。
[0004]微生物培養基中的氮源是其生長必不可少的營養成分，也對一些活性物質的產量起著重要的重要，其中對微生物油脂積累的影響已被廣泛研究。而氨基酸作為重要的氮源，能夠直接參與蛋白質的合成，已有文獻報道它們能調控釀酒酵母的基因表達水平，另外，氨基酸和它們的一些代謝產物 也能調控其它代謝過程。
[0005]目前，對于添加氨基酸為氮源來提高Y-亞麻酸產量的研究在國內外并不多見。本發明以卷枝毛霉CBS108.16為出發菌株，以氨基酸為營養氮源提高其Y-亞麻酸產量。
【
【發明內容】
】
[0006][要解決的技術問題]
[0007]本發明的目的是提供一種用于提高卷枝毛霉(Mucor circinelloides)CBS108.16
產Y-亞麻酸產量的發酵培養基。
[0008]本發明的另一個目的是提供一種使用所述發酵培養基提高卷枝毛霉CBS108.16產Y-亞麻酸產量的方法。
[0009][技術方案]
[0010]本發明是通過下述技術方案實現的。
[0011]本發明涉及一種用于提高卷枝毛霉CBS108.16產Y -亞麻酸產量的發酵培養基。
[0012]所述的發酵培養基含有一種或多種選自酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸的氨基酸氮源。
[0013]所述酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸的濃度以N元素計是0.3~3g/L。[0014]根據本發明的一種優選實施方式，所述酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸的濃度以N元素計是0.5~2.6g/L。
[0015]根據本發明的另一種優選實施方式，除氨基酸外，它還含有其它的有機氮源，其它有機氮源的濃度以N元素計是O~0.2g/L。 [0016]根據本發明的另一種優選實施方式，其它的有機氮源是酵母粉、尿素或蛋白胨。
[0017]根據本發明的另一種優選實施方式，所述的發酵培養基組成如下:50~120g/L葡萄糖、以N元素計0.3~3.0g/L酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸、5~10g/LKH2P04、I ~5g/LNa2HP04、l ~5g/LMgS04.7Η20、0.01 ~2.0g/L 酵母粉、尿素或蛋白胨、0.1g/LCaCl2.2Η20、0.008g/LFeCl3.6Η20、0.001g/LZnS04.7Η20、0.0001g/LCuS04.5Η20、0.0OOlg/LCo (NO3) 2.6H20 與 0.0001g/LMnS04.5H20。
[0018]本發明涉及一種用于提高卷枝毛霉CBS108.16產Y -亞麻酸產量的方法。
[0019]該方法的步驟如下:
[0020]A、菌種活化
[0021]按照卷枝毛霉CBS108.16孢子液與活化培養基的體積比1:1000~2000，將卷枝毛霉CBS108.16孢子液接入裝有活化培養基的帶擋板三角瓶中，在搖床中在溫度25~35°C與轉速100~200rpm的條件下恒溫培養16~30h,得到一種活化菌種液；
[0022]B、種子培養
[0023]在無菌的條件下，按照在步驟A得到的活化菌種液體積為種子培養基體積的5~15%，將所述的活化菌種液接入裝有種子培養基的帶擋板三角瓶中，在搖床中在溫度25~35°C與轉速100~200rpm的條件下恒溫培養16~30h，得到一種種子培養液；
[0024]C、發酵培養
[0025]在無菌的條件下，按照在步驟B得到的種子培養液體積為發酵培養基體積的5~15%，將所述的種子培養液接入裝有發酵培養基的發酵罐中，在通氣流量I~3L/min、pH為5.0~7.0、溫度25~35°C與轉速500~1000rpm的條件下恒溫培養80~120h，得到一種發酵培養液；
[0026]D、烘干
[0027]將步驟C得到的發酵培養液經過濾，然后在烘箱中在溫度60~105°C下烘干至恒重，得到含有Y -亞麻酸的卷枝毛霉CBS108.16菌體。
[0028]根據本發明的一種優選實施方式，所述的活化培養基與種子培養基組成如下:30g/L 葡萄糖、3.3g/L 酒石酸銨、7.0g/LKH2P04、2.0g/LNa2HP04、1.5g/LMgS04.7Η20、1.5g/L 酵母粉、0.lg/LCaCl2.2Η20、0.008g/LFeCl3.6Η20、0.001g/LZnS04.7Η20、0.0OOlg/LCuSO4.5Η20、0.0001 g/LCo (NO3)2.6Η20 與 0.0001g/LMnS04.5H20。
[0029]根據本發明的另一種優選實施方式，所述的發酵培養基組成如下:50~120g/L葡萄糖、以N元素計0.3~3g/L酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸、5~10g/LKH2P04、l~5g/LNa2HPO4U ~5g/LMgS04.7Η20、0 ~2g/L 酵母粉、0.lg/LCaCl2.2Η20、0.008g/LFeCl3.6Η20、0.001g/LZnS04.7Η20、0.0001g/LCuS04.5Η20、0.0001g/LCo (NO3)2.6Η20 與 0.0OOlg/LMnSO4.5Η20ο
[0030]根據本發明的另一種優選實施方式，所述的卷枝毛霉CBS108.16菌液含有810~1300mg/L Y -亞麻酸。[0031]根據本發明的另一種優選實施方式，所述的卷枝毛霉CBS108.16菌體含有以該菌體總重量計24~35%脂肪酸。
[0032] 下面將更詳細地描述本發明。
[0033]本發明涉及一種用于提高卷枝毛霉(Mucorcircinelloides) CBS108.16產Y-亞
麻酸產量的發酵培養基。
[0034]本發明使用的卷枝毛霉CBS108.16是從荷蘭微生物菌種保藏中心商業途徑獲得的，其保藏號CBS108.16。
[0035]首先，按照下述方式培養卷枝毛霉CBS108.16，并就各種氨基酸對卷枝毛霉CBS108.16產Y -亞麻酸的影響進行了研究:
[0036]A、菌種活化
[0037]按照卷枝毛霉CBS108.16孢子液與活化培養基的體積比1:1000~2000，將卷枝毛霉CBS108.16孢子液接入裝有活化培養基的帶擋板三角瓶中，在搖床中在溫度25~35°C與轉速100~200rpm的條件下恒溫培養16~30h,得到一種活化菌種液；
[0038]B、種子培養
[0039]在無菌的條件下，按照在步驟A得到的活化菌種液體積為種子培養基體積的5~15%，將所述的活化菌種液接入裝有種子培養基的帶擋板三角瓶中，在搖床中在溫度25~35°C與轉速100~200rpm的條件下恒溫培養16~30h，得到一種種子培養液；
[0040]C、發酵培養
[0041]在無菌的條件下，按照在步驟B得到的種子培養液體積為發酵培養基體積的5~15%，將所述的種子培養液接入裝了含有氨基酸的發酵培養基的發酵罐中，在通氣流量I~3L/min、pH為5.0~7.0、溫度25~35°C與轉速500~1000rpm的條件下恒溫培養80~120h，得到一種發酵培養液；
[0042]D、烘干
[0043]將步驟C得到的發酵培養液經過濾，然后在烘箱中在溫度60~105°C下烘干至恒重，得到含有Y -亞麻酸的卷枝毛霉CBS108.16菌體。
[0044]采用上述培養方法研究了氨基酸對該菌生長、產脂、Y -亞麻酸產量的影響:
[0045]1、氨基酸對卷枝毛霉CBS108.16生長的影響
[0046]卷枝毛霉CBS108.16 Y -亞麻酸產量與其生長密切相關，因此，本發明收集上述發酵菌體，通過稱重法(Song, Y., Wynn, J.P., Li, Y., Grantham, D.&Ratledge, C.(2001).Apregeneticstudyoftheisoforms of malic enzyme associated with lipidaccumulation in Mucor circinelloides.Microbiologyl47, 1507 - 1515.)測得卷枝毛霉CBS108.16在以不同氨基酸為氮源時的生物量，其結果列于圖1。這些結果清楚地表明，與對照組相比，脯氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、谷氨酸，尤其是酪氨酸和天冬氨酸，顯著促進卷枝毛霉CBS108.16的生長，而纈氨酸，苯丙氨酸、色氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺或賴氨酸對其生長不利，其它氨基酸對卷枝毛霉CBS108.16生長影響不大。
[0047]2、氨基酸對卷枝毛霉CBS108.16總脂肪積累的影響
[0048]Y-亞麻酸產量與其總脂肪酸含量相關。為了研究氨基酸對總脂肪積累的影響，本發明采用有機溶劑提取與氣相色譜分析的方法，對上述發酵菌體的總脂肪酸進行了分析，得到在不同氨基酸下卷枝毛霉CBS108.16總脂肪酸的含量，其結果列于圖2。這些結果表明，與對照組相比，酪氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸能夠顯著提高卷枝毛霉CBS108.16脂肪酸含量。
[0049]3、氨基酸對卷枝毛霉CBS108.16脂肪酸組分的影響
[0050]由表1的數據知道，氨基酸可以影響卷枝毛霉CBS108.16脂肪酸的組分，而脂肪酸組分中Y-亞麻酸含量也影響著其產量。這些結果表明亮氨酸、色氨酸、蛋氨酸顯著減少了脂肪酸中Y-亞麻酸的含量，雖然纈氨酸增加了卷枝毛霉CBS108.16脂肪酸中Y-亞麻酸的含量，但是由于纈氨酸不利于卷枝毛霉CBS108.16的生長，因此其Y-亞麻酸產量依然很低。
[0051]表1:以不同氨基酸作為氮源，在發酵培養后卷枝毛霉CBS108.16的脂肪酸的組成
【權利要求】
1.一種用于提高卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)CBS108.16產Y-亞麻酸產量的發酵培養基，其特征在于所述的發酵培養基含有一種或多種選自酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸的氨基酸氮源，所述酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸的濃度以N元素計是0.3~3g/L。
2.根據權利要求1所述的發酵培養基，其特征在于所述酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸的濃度以N元素計是0.5~2.6g/L。
3.根據權利要求1所述的發酵培養基，其特征在于除氨基酸外，它還含有其它的有機氮源，其它有機氮源的濃度以N元素計是O~0.2g/L。
4.根據權利要求3所述的發酵培養基，其特征在于其它的有機氮源是酵母粉、尿素或蛋白胨。
5.根據權利要求1或2所述的發酵培養基，其特征在于所述的發酵培養基組成如下:50~120g/L葡萄糖、以N元素計0.3~3.0g/L酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸、5~IOg/LKH2PO4U ~5g/LNa2HP04、l ~5g/LMgS04.7Η20、0.01 ~2.0g/L 酵母粉、尿素或蛋白胨、0.lg/LCaCl2.2Η20、0.008g/LFeCl3.6Η20、0.001g/LZnS04.7Η20、0.0001g/LCuS04.5Η20、0.0001g/LCo (NO3)2.6Η20 與 0.0001g/LMnS04.5H20。
6.一種用于提高卷枝毛霉CBS108.16產Y-亞麻酸產量的方法，其特征在于該方法的步驟如下: A、菌種活化 按照卷枝毛霉CBS108.16孢子液與活化培養基的體積比1:1000~2000，將卷枝毛霉CBS108.16孢子液接入裝有活化培養基的帶擋板三角瓶中，在搖床中在溫度25~35°C與轉速100~200rpm的條件下恒溫培養16~30h,得到一種活化菌種液； B、種子培養 在無菌的條件下，按照在步驟A得到的活化菌種液體積為種子培養基體積的5~15%，將所述的活化菌種液接入裝有種子培養基的帶擋板三角瓶中，在搖床中在溫度25~35V與轉速100~200rpm的條件下恒溫培養16~30h，得到一種種子培養液； C、發酵培養 在無菌的條件下，按照在步驟B得到的種子培養液體積為發酵培養基體積的5~15%，將所述的種子培養液接入裝有發酵培養基的發酵罐中，在通氣流量I~3L/min、pH為5.0~7.0、溫度25~35°C與轉速500~1000rpm的條件下恒溫培養80~120h，得到一種發酵培養液； D、烘干 將步驟C得到的發酵培養液經過濾，然后在烘箱中在溫度60~105°C下烘干至恒重，得到含有Y -亞麻酸的卷枝毛霉CBS108.16菌體。
7.根據權利要求5所述的培養方法，其特征在于所述的活化培養基與種子培養基組成如下:30g/L 葡萄糖、3.3g/L 酒石酸銨、7.0g/LKH2P04、2.0g/LNa2HP04、1.5g/LMgS04.7H20、1.5g/L 酵母粉、0.lg/LCaCl2.2Η20、0.008g/LFeCl3.6Η20、0.001g/LZnS04.7Η20、0.0OOlg/LCuSO4.5Η20、0.0001 g/LCo (NO3)2.6Η20 與 0.0001g/LMnS04.5H20。
8.根據權利要求5所述的培養方法，其特征在于所述的發酵培養基組成如下:50~120g/L葡萄糖、以N元素計0.3~3g/L酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸、5~10g/LKH2P04、I ~5g/LNa2HP04、l ~5g/LMgS04.7H20、0 ~2g/L 酵母粉、0.lg/LCaCl2.2Η20、0.008g/LFeCl3.6Η20、0.001g/LZnS04.7Η20、0.0001g/LCuS04.5Η20、0.0OOI g/LCo (NO3)2.6Η20 與.0.0001g/LMnS04.5H20。
9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述的卷枝毛霉CBS108.16發酵液含有.810 ~1300mg/L Y -亞麻酸。
10.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述的卷枝毛霉CBS108.16菌體含有以該菌體總重量計24~35%脂肪酸。
【文檔編號】C12R1/785GK103642859SQ201310654941
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月5日 優先權日:2013年12月5日
【發明者】宋元達, 唐鑫, 陳衛, 陳海琴, 張懷淵 申請人:江南大學