栽培番茄scf復合體亞單位cul1蛋白序列及其核酸序列的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種分子生物學【技術領域】的栽培番茄SCF復合體亞單位CUL1蛋白序列及其核酸序列；本發明涉及的栽培番茄SCF復合體亞單位CUL1蛋白序列如SEQ?ID?NO.3所示；本發明還涉及編碼前述CUL1蛋白序列的核酸序列。利用本發明的CUL1蛋白基因，可以篩選出與之相關或者發生相互作用的物質、受體、抑制劑以及拮抗劑等；利用本發明可以通過基因工程手段過表達或低表達該基因，進一步研究由S-核酸酶介導的自交不親和機制，對獲得能夠克服遠緣雜交不親和的野生番茄品種以及番茄品種的改良具有重要的理論支撐。
【專利說明】栽培番茄SCF復合體亞單位CUL1蛋白序列及其核酸序列
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學【技術領域】，具體涉及一種栽培番茄SCF復合體亞單位CULl蛋白序列及其核酸序列。
【背景技術】
[0002]番爺(Solanum Iycopersicum),屬于爺科番爺屬，是世界重要的蔬菜作物和經濟作物之一，現被廣泛栽培于世界各地。據聯合國糧農組織2013年統計數據顯示，2011年全球番茄種植面積4.73X IO6公頃，總產量達1.59X IO8噸，生產總值為5.82X 101°美元，在全球糧農產品中占第八位。
[0003]在番茄栽培生產中，由于葉霉病，灰霉病，以及各種蟲害的發生，常給番茄產量和質量造成嚴重影響。野生種及其近緣野生種具有多種特質，為改良育種提供了豐富的資源，但由于多數野生種番茄的果實較少，產量低，風味差，且在保種上有一定的難度，無法直接應用于生產，因此通過遠緣雜交將野生番茄的優良性狀轉移到栽培番茄中成為育種的主要技術。
[0004]自交不親和性是廣泛存在于開花植物的種內生殖障礙。番茄由于同時存在自交不親和自交親和兩種生殖機制，因此成為研究自交不親和的模式植物。嚴格的自交不親和性以及相應的與普通番茄種間雜交的單側不親和性，成為番茄遺傳研究和育種工作最大的障礙。因此對于番茄自交不親和機制的研究越來越多。目前研究發現茄科、薔薇科、玄參科均是由雌配子決定因子S —核酸酶和花粉決定因子SLF介導的一類自交不親和。SLF是F-box家族的一員，參與SCF 復合體的組成，已成為研究最深而且最多的一個亞基，在擬南芥已發現的SLF基因已有700多種。
[0005]泛素介導的蛋白水解是生物體中蛋白質調控的重要環節，是生物代謝的調控中心。而SCF復合體是泛素降解系統中最大的一類E3泛素連接酶復合體，通過介導多種信號蛋白和調控蛋白的泛素化來調控細胞周期、信號轉導、轉錄水平，是多種生物代謝的關鍵調控因子。SCF復合體屬于RING類的泛素連接酶，廣泛存在于真核生物中，是植物中最大的一類多亞基E3酶，由⑶L1、SKPU RBXUF-Box四個亞基組成。⑶LI是SCF復合體的中心，具有橋梁的作用，通過一側的長柄狀結構與SKPl結合通過SKPl接頭作用與F-Box家族蛋白連接，另一側的球狀區域與RBXl形成一個二亞基催化中心，利用RBXl的RING鋅指結構與E2泛素結合酶相作用，最后完成底物蛋白的識別和泛素化。目前發現真核生物中CUL蛋白存在五個同源家族。CULl蛋白是CUL家族中最早被分離出來的一類，目前已在許多物種中的被克隆分離出來，如擬南芥、矮牽牛、梨、金魚草。⑶LI蛋白由N端415個氨基酸以及C端360個氨基酸組成，N端具有由五個螺旋組成的三個重復區域，C端由4HB (4螺旋束)組成且高度保守，從4HB開始的200個堿基被認為是CUL蛋白家族的同源區域(包含H24螺旋、部分折疊片，WH-A區域)。
[0006]目前的研究已經對于SCF復合體在自交不親和中的的作用和功能已經有了部分證據。通過研究對比栽培番茄中的⑶LI基因組成，有助于加深對自交不親和和單側雜交不親和機制的認識，進而為克服遠緣雜交，改良番茄育種提供了理論基礎。經現有技術文獻檢索，尚未發現與本發明相同或者相似的技術主題。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種栽培番茄SCF復合體亞單位CULl蛋白序列及其核酸序列。本發明公開了栽培番茄中SCF復合體E3泛素連接酶亞基CULl的編碼序列；利用本發明公開的基因序列，通過轉基因手段過表達或低表達該基因，可以進一步研究對于S —核酸酶介導的自交不親和機制，同時對于番茄遠緣雜交不親和具有重要的理論支撐，進而對于番茄品種的形狀改良具有重要的意義。
[0008]本發明是通過以下技術方案實現的，
[0009]第一方面，本發明涉及一種分離的栽培番茄CLN1621F E3泛素連接酶SCF復合體亞單位⑶LI蛋白序列，所述蛋白序列如SEQ ID N0.3所示。
[0010]第二方面，本發明還涉及一種編碼前述⑶LI蛋白序列的核酸序列。
[0011]優選地，所述核酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0012]優選地，所述核酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0013]第三方面，本發明還涉及一種編碼前述的CULl蛋白序列的核酸序列的用途，所述用途是利用基因工程手段或者干擾手段，調控所述核酸序列的表達，進而引起S-核酸酶介導的自交不親和機制，獲得改良的番茄品種。
[0014]本發明具有以下有益效果:利用本發明的CULl蛋白，可以篩選出與之相關或者發生相互作用的物質、受體、抑制劑以及拮抗劑等；利用本發明可以通過基因工程手段，進一步研究由S-核酸酶介導的自交不親和機制，對于番茄品種的改良具有重要的意義。
[0015]同時，對于本領域技術人員而言，當明確本發明的核酸序列后，與SEQ ID N0.1第1-5494位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID N0.1中從核苷酸第1-5494位的核苷酸序列雜交；這些序列顯然也屬于本發明的保護范疇；此外，具有SEQ ID N0.2所示的cDNA序列以及SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物，也應在本發明的保護范疇。
[0016]本發明根據茄科基因序列數據庫，運用生物信息學手段，通過序列比對和電子拼接，設計出合適的引物，利用分子克隆的方法，克隆出栽培番茄CLN162IF中E3泛素連接酶SCF復合體亞單位⑶LI蛋白基因；在番茄中⑶LI基因有19個外顯子和18個內含子組成，但在第七個外顯子中含有一個終止密碼子，產生了長度為252氨基酸的蛋白。
[0017]此外本發明涉及大腸桿菌DH5 a BL-21菌株，該菌已在薩姆布魯克J，拉塞爾DW.分子克隆實驗指南[Μ]。黃培棠，王嘉璽，朱厚礎，等譯.第三版.北京:科技出版社，2002，中公開。大腸桿菌DH5aBL-21菌株、pMD19-T Simple載體、膠回收試劑盒等均可通過商業渠道取得。
[0018]在本發明中，“分離的”、“純化的” DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組分分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
[0019]在本發明中，術語“E3泛素連接酶SCF復合體亞單位⑶LI蛋白編碼序列”指編碼具有E3泛素連接酶SCF復合體亞單位⑶LI蛋白活性的核苷酸序列。該術語還包括能編碼具有與栽培番茄E3泛素連接酶SCF復合體亞單位⑶LI相同功能蛋白的SEQ ID N0.2中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于):若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
[0020]在本發明中，術語“E3泛素連接酶SCF復合體亞單位⑶LI蛋白”指能夠參與E3泛素連接酶SCF復合體組成的CULl蛋白。該術語還包括具有與栽培番茄E3泛素連接酶SCF復合體亞單位CULl相同功能的、SEQ ID N0.3序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于):若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。
[0021 ] 本發明的E3泛素連接酶SCF復合體亞單位⑶LI蛋白的變異形式包括:同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊條件下能與E3泛素連接酶SCF復合體亞單位CULl蛋白相關DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗E3泛素連接酶SCF復合體亞單位CULl蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。
[0022]在本發明中，“E3泛素連接酶SCF復合體亞單位⑶LI蛋白”指與SEQ ID N0.3的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行替換而產生。
[0023]表1
[0024]
【權利要求】
1.一種分離的栽培番茄CLN1621F E3泛素連接酶SCF復合體亞單位⑶LI蛋白序列，其特征在于，所述蛋白序列如SEQ ID N0.3所示。
2.一種編碼如權利要求1所述的CULl蛋白序列的核酸序列。
3.如權利要求2所述的核酸序列，其特征在于，其序列如SEQ ID N0.2所示。
4.如權利要求2所述的核酸序列，其特征在于，其序列如SEQ ID N0.1所示。
5.一種編碼如權利要求1所述的CULl蛋白序列的核酸序列的用途，其特征在于，所述用途是利用基因工程手段或者干擾手段，調控所述核酸序列的表達，進而引起S-核酸酶介導的自交不親和機制，獲得改良的番茄品種。
【文檔編號】C12N9/00GK103695378SQ201310686929
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月13日 優先權日:2013年12月13日
【發明者】趙凌俠, 高美鳳, 彭會珍, 陳露露, 瞿海鷗 申請人:上海交通大學