Purα蛋白在抑制淀粉樣前體蛋白編碼基因表達中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了Purα蛋白在抑制淀粉樣前體蛋白(APP)編碼基因表達中的應用，利用Purα蛋白，可以有效結合APP編碼基因啟動子的5‘UTR區域，并抑制Egr-1因子的正調控作用，從而降低了淀粉樣前體蛋白(APP)的形成，可用于與淀粉樣前體蛋白異常表達相關的疾病的防治。
【專利說明】Pura蛋白在抑制淀粉樣前體蛋白編碼基因表達中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】，具體地說，本發明公開了Pura蛋白，以及編碼此多肽 的多核苷酸序列對淀粉樣前體表達的調控作用。
【背景技術】
[0002] 淀粉樣前體蛋白（AmyloidPrecursorProtien，簡稱APP)是一種廣泛存在于體 內的跨膜蛋白。它的異常代謝可以生成42個氨基酸組成的多肽（AmyloidPP印tide，簡 稱A0)，這種多肽在神經系統內的聚集可以產生Senileplaque,而這種plaque由于可引 起神經組織的興奮性毒性的增強，激發炎癥反應和炎性因子的浸潤，并且可以阻斷和破壞 神經元之間的聯系，被認為是Alzheimer's病形成的主要原因。APP的代謝異常，如過表 達，可以產生早發性Alzheimer病的癥狀，所以對APP基因表達和調控方面的研究，對于治 療Alzheimer病的發生和發展有著很重要意義。
【發明內容】
[0003] 申請人:通過長期研究發現，Pura蛋白和Egr-1蛋白（其序列表SEQIDN0 :3所 示的氨基酸序列、編碼序列如序列表SEQIDN0 :4)是APP的編碼基因表達過程中兩個重要 的調控因子。Pura蛋白對APP的表達有明顯的負調控作用，而Egr-1蛋白則表現出強烈的 正調控作用。兩種因子共同作用，則Pura蛋白可以完全抑制Egr-1因子的正調控作用，也 就是說Pura蛋白的結合位點與Egr-1蛋白的結合位點在APP的編碼基因啟動子區域是重 合的。
[0004] 基于上述研究成果， 申請人:完成了本發明。
[0005] 首先，本發明公開了Pura蛋白在抑制淀粉樣前體蛋白編碼基因表達中的應用， 在該作用中，Pura蛋白結合APP編碼基因啟動子的5 'UTR區域9063-9077:ggCggcgg tggcggc，并抑制Egr-1因子的正調控，Pur a蛋白包括序列表SEQ ID NO :1所示的氨基酸 序列。
[0006] 由于Pura蛋白有效抑制APP的表達，因此本發明還公開了Pura蛋白作為拮抗 劑或抑制劑，在診斷或治療與抑制淀粉樣前體蛋白異常表達相關的疾病中的應用。
[0007] 如 申請人:在【背景技術】部分所提到的，上述疾病，主要為阿爾茨海默氏病，目前本領 域技術人員普遍認為該疾病與APP的過表達高度相關。
[0008] 進一步的，本發明還公開了診斷或治療與抑制淀粉樣前體蛋白異常表達相關的疾 病的藥物組合物，包含上述的Pura蛋白與藥學上可接受的載體。
[0009] 本發明還公開了編碼Pura蛋白的多核苷酸，具有序列表SEQIDN0 :2的核苷酸 序列。
[0010] 基于上述多核苷酸，本發明還公開了一種含有外源多核苷酸的重組載體，由多核 苷酸與質粒、病毒或表達載體構建而成的重組載體。
[0011] 本領域技術人員熟知上述重組載體的構建方法，是將編碼Pura蛋白的多核苷酸 序列可插入到載體中，以構成含有本發明所述多核苷酸的重組載體。其中所用的載體指本 領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉 錄病毒或其它載體。在本發明中適用的載體包括但不限于：在細菌中表達的基于17啟動子 的表達載體；在哺乳動物細胞中表達的PMSXND表達載體和在昆蟲細胞中表達的來源于桿 狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都可以用于構建重組 表達載體。
[0012] 為了構建上述重組表達載體，可以使用生物學領域任何已知的方法，這些方法包 括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等，通過將編碼Pura蛋白的DNA序列 有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有： 大腸桿菌的lac或trp啟動子；噬菌體的PL啟動子，和其它一些已知的可控制基因在原核 細胞或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。
[0013] 在上述基礎上，本發明還公開了含有外源多核苷酸的遺傳工程化宿主細胞，選自 于下列一種宿主細胞：(a)用所述重組載體轉化或轉導的宿主細胞；或（b)用所述的多核苷 酸轉化或轉導的宿主細胞。
[0014] 利用上述的宿主細胞，選擇合適的培養基進行培養，，即可分離純化獲得Pura蛋 白。
[0015] 上述的宿主細胞指原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是 高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬；細菌細胞如鼠傷寒 沙門氏菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞如果蠅S2或Sf9 ;動物細胞如CH0、C0S或 Bowes黑素瘤細胞等。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016] 圖1顯示了在EMSA實驗中，Egr_l、Pura以及同時加入Egr-1和Pura對APP表 達的影響，其中A為單獨加入不同量的Egr-1和Pura的電泳結果，B為同時加入不同量的 Egr-1和Pura以及分別加入Egr-1和Pura的電泳結果，C為上述結果的量化放大圖像。
【具體實施方式】
[0017] 實施例1
[0018] 通過LuciferaseAssay,顯示Pura蛋白和Egr-1蛋白是APP基因表達過程中兩 個重要的調控因子，其中，Pura蛋白對APP的表達有明顯的負調控作用，而Egr-1蛋白則 表現出強烈的正調控作用。兩種因子共同作用，則Pura蛋白完全抑制Egr-1因子的正調 控作用，說明兩種因子之間存在著對APP基因的調控作用存在著一定的機制。
[0019] 為了進一步弄清楚這兩種因子相互作用的機制，利用電子計算機輔助分析對APP 啟動子的DNA序列進行了分析，發現在APP啟動子的5'UTR區域存在著符合Pura蛋白結 合特征的區域（GGN)n，而此區域在在物理位置上與Egr-1的結合位點是重合的。以APP全 長序列定位的話，Pura蛋白結合位點為9063-9077部分，即啟動子序列（（為APP編碼序 列的部分序列，從8201-9147,即-800/+147)，序列5顯示的為該部分序列）中的ggcggcgg tggcggc部分，Egr-1 結合位點為（9063-9079):ggcggcggtggcggcgc和（9066-9082): ggcggtggcggcgcggg,與Pura位點重合。也就是說，Pura蛋白的結合位點位于啟動子的 +63-+77處，這里有一個（GGN)n的區域，而Egr-1的結合位點則位于+63-+79和+66-+82 處，二者大部分是重合的。
[0020] 在上述基礎上，利用PCR法對這一部位進行了缺失突變，設計PCR引物，分別對APP 啟動子-170-+62和+83-+147進行擴增，得到兩個APP啟動子的片段，然后再得用引物將這 兩個片段連接起來，就形成了+63-+S2部位缺失的片段，然后將所完成的APP啟動子缺失突 變體克隆到PGL3 Basic載體中，構建成含有缺失突變的APP啟動子報道質粒進行進一步的 驗證。
[0021] 同時， 申請人:研究了去除Pura和Egr-1結合位點的效果，發現去除后這兩種轉錄 因子對APP啟動子的調控作用消失，EMSA(凝膠遷移或電泳遷移率實驗，采用Promega公司 的試劑盒）研究結果也證實兩種轉錄因子對APP啟動子的結合存在著競爭性的作用。
[0022] 參考圖1-A所示我們可以看到，加入Pura蛋白后，由于Pura蛋白與APP編碼DNA 結合抑制了其表達，導致電泳遷移率顯著降低；參考圖1-B我們可以看到，相對于只加入 Egr-1，同時加入Pura和Egr-1，電泳遷移率明顯降低，說明在APP表達中，Pura蛋白完全 抑制Egr-1因子的正調控作用。參考圖1-C顯示了上述結果的清晰電泳圖像。
【權利要求】
1. Pur a蛋白在抑制淀粉樣前體蛋白編碼基因表達中的應用，所述Pur a蛋白結合APP 編碼基因啟動子的5 'UTR區域9063-9077 :ggcggcgg tggcggc，并抑制Egr-1因子的正調 控，所述Pur a蛋白包括序列表SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。 2. Pur a蛋白作為拮抗劑或抑制劑，在診斷或治療與抑制淀粉樣前體蛋白異常表達相 關的疾病中的應用。
3. -種診斷或治療與抑制淀粉樣前體蛋白異常表達相關的疾病的藥物組合物，包含 Pur a蛋白與藥學上可接受的載體。
4. 一種多核苷酸，編碼Pur a蛋白，具有序列表SEQ ID NO :2的核苷酸序列。
5. -種含有外源多核苷酸的重組載體，由權利要求5所述的多核苷酸與質粒、病毒或 表達載體構建而成的重組載體。
6. -種含有外源多核苷酸的遺傳工程化宿主細胞，其特征在于選自于下列一種宿主細 胞：(a)用權利要求5所述的重組載體轉化或轉導的宿主細胞；或（b)用權利要求4所述的 多核苷酸轉化或轉導的宿主細胞。
【文檔編號】G01N33/68GK104387464SQ201410581731
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月27日 優先權日:2014年10月27日
【發明者】崔建奇 申請人:寧夏醫科大學