一種提高新霉素產量的生產方法
【專利摘要】本發明涉及一種提高新霉素產量的生產方法，用花生餅粉、玉米淀粉、大米粉、酵母粉、葡萄糖、蛋白胨、硫酸銨、氯化鈉、輕質碳酸鈣、KH2PO4的弗氏鏈霉菌常規發酵培養基中，加入選自下述的一種或多種添加劑：賴氨酸、乳酸亞鐵、酪氨酸、蛋氨酸、水解酪素、維生素B12、果糖、氨基葡萄糖、葉酸、核黃素、色氨酸。本發明的優點是提高新霉素產量5-20％以上，降低成本，發酵效率增高。本發明產品用于治療人類疾病和畜牧業，作抗生素用。
【專利說明】一種提高新霉素產量的生產方法
【技術領域】
[0001]本發明提供一種新霉素的生產方法，具體地說，提供一種提高新霉素產量的生產方法。是涉及用微生物發酵并提高新霉素產量的制備方法。
【背景技術】
[0002]新霉素是一種氨基糖苷類抗生素。新霉素是首個被發現的2 — DOS (2—脫氧鏈霉胺)氨基糖苷類抗生素，它是1949年Waksman等從弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae)代謝產物中分離得到的一種氨基環多醇復合抗生素，主要與細菌核糖體30S亞基結合，抑制細菌合成蛋白質。弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae)菌株可以商業購買，也是國內新霉素微生物發酵生產工藝中所用的菌株。臨床常用硫酸新霉素(Neomycin Salfate),分子式:C23H46N6013.3(H2S04)。該產品為白色或微黃色結晶，無臭，對熱穩定，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于有機溶劑，吸濕性強，易潮解。由于其抗菌譜廣，對革蘭氏陰、陽性菌、結核桿菌等均有抑制作用。口服給藥在體內難以吸收，在腸道中保持較高濃度，確保其殺菌效果，適用于胃腸道感染、呼吸道感染、皮膚感染五官科疾病的治療和腹部手術前的消毒等；同時因其能提高飼料利用率，促進禽畜生長，因此被廣泛應用于畜牧業。如今國際上在硫酸新霉素的應用研究上有了新的進展，歐美、西德等國家和地區廣泛應用于畜牧業。
[0003]中國于上世紀六、七十年代開始生產新霉素，該藥品已成為醫藥工業中的一種老藥品。長期以來，由于生產過程復雜，周期長，產率低。工藝自身發展的局限，生產得率及生產周期似已達到極限。目前該藥品的生產發酵周期在130-170小時，提煉收率85%，發酵單位為16000-19000單位/毫升，因此，如何提高新霉素的產菌率，降低生產成本仍是各研究單位的重要課題。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于克服現`有技術存在的問題，而提供一種提高新霉素發酵效率的制備方法，顯著地提高了新霉素的產量。
[0005]本發明目的是可以通過如下措施來實現:
[0006]本發明提供了一種提高新霉素產量的生產方法，所述方法是采用微生物發酵法，并且使用弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae),其特征在于在常規發酵培養基中加入添加劑，所述添加劑選自如下的一種或者多種:賴氨酸、乳酸亞鐵、蛋氨酸、酪氨酸、水解酪素、維生素B12、果糖、氨基葡萄糖、葉酸、核黃素、色氨酸。
[0007]上述所述的生產方法，其中添加劑的加入量，優選為:賴氨酸0.05-0.5克/升、乳酸亞鐵0.05-0.5克/升、蛋氨酸0.3-1.0克/升、酪氨酸0.01-0.3克/升、水解酪素0.5-50克/升、維生素B120.02-0.45毫克/升、果糖0.5-25克/升、氨基葡萄糖0.5-25克/升、葉酸0.01-0.2毫克/升、核黃素0.02-0.45毫克/升或者色氨酸0.1-0.3克/升。。
[0008]上述所述的生產方法，其中所述的常規發酵培養基，是指已有的新霉素微生物發酵工藝中所用的發酵培養基，例如，發酵培養基的組成，按培養基體積g/100ml計為:黃豆餅粉0.5、花生餅粉2.8、大米粉5.0、酵母粉0.9、葡萄糖1.5、蛋白胨1.0、硫酸銨0.5、氯化鈉0.45輕質碳酸鈣0.45、KH2PO40.06、α -淀粉酶0.02、豆油0.12、硅油0.05。
[0009]作為本發明一【具體實施方式】，上述所述的生產方法，其具體包括如下步驟:
[0010](I)斜面培養制得斜面孢子:將弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae)接種至斜面培養基內，接后于28 V的恒溫室培養10~12天，得斜面孢子，其中，所述的斜面培養基為(g/100ml):葡萄糖1.0、牛肉膏0.2、瓊脂1.8~2.2、磷酸氫二鉀0.05和DL-天冬素0.05 ；
[0011](2)制備斜面孢子懸浮液:選步驟(1)中生長正常且符合質量要求的斜面孢子，在無菌條件下，加無菌水制成孢子懸液，置0-4°C條件下保存，保存時間為Shr內，得待接種用斜面孢子懸浮液；
[0012](3)繁殖罐培養制備新霉素繁殖培養物:將步驟(2)制得的斜面孢子懸浮液置于繁殖罐中進行擴大培養，種子接入量為擴大培養基體積的2%，培養溫度為36°C，培養時間為42小時，得到新霉素繁殖培養物，其中，繁殖罐培養所用的培養基為:按g/100ml計，花生餅粉1.0、玉米淀粉1.0、酵母粉2.25、葡萄糖2.5、蛋白胨0.5、硫酸銨0.1、輕質碳酸鈣1.4、Na2HPO40.1、豆油 0.28 ；
[0013](4)發酵罐發酵培養制備新霉素發酵產物:將步驟(3)所制得的新霉素繁殖培養物置于發酵罐中進行發酵培養，種子接入量為發酵培養基體積的15~20%，發酵溫度為35°C，發酵時間為130小時，得到新霉素發酵產物，其中，發酵罐培養所用的培養基為:按g/100ml計，黃豆餅粉0.5、花生餅粉2.8、大米粉5.0、酵母粉0.9、葡萄糖1.5、蛋白胨1.0、硫酸銨0.5、氯化鈉0.45 、輕質碳酸鈣0.45、ΚΗ2Ρ040.06、α -淀粉酶0.02、豆油0.12、硅油0.05，并加入添加劑，按培養基的體積計，所述添加劑選自如下的一種或者一種以上:賴氨酸0.05-0.5克/升，乳酸亞鐵0.05-0.5克/升，蛋氨酸0.3-1.0克/升，酪氨酸0.01-0.3克/升，維生素Β12，0.02-0.45毫克/升，水解酪素0.5-50克/升，果糖0.5-25克/升，氨基葡萄糖0.5-25克/升，葉酸0.01-0.2毫克/升，核黃素0.02-0.45毫克/升，色氨酸0.1-0.3 克 / 升；
[0014](5)將步驟(4)所得到的新霉素發酵產物經分離和純化處理制得新霉素。
[0015]其中，上述所述的生產方法，其中優選在步驟(2)中，通過種子培養考察斜面孢子質量，每只種瓶接種量為3-4cm2斜面孢子，每只種瓶中培養基為80ml，于轉速為220-240rpm的搖瓶機上，在溫度為35°C的條件下培養6天，得種子發酵液考察斜面孢子質量，其中種子培養所用的培養基為(g/100ml):葡萄糖2.0、DL-天冬素0.06、蛋白胨0.5、花生餅粉2.8、酵母粉0.5、大米粉8.0、玉米漿0.25、淀粉酶0.0025、硫酸銨0.6、輕質碳酸鈣0.45。
[0016]作為實施方式之一，上述所述的生產方法，其中所述的分離和純化處理制得新霉素的過程包括如下步驟:(I)將得到的新霉素發酵產物進行酸化處理至PH值為6-7，得到新霉素酸化液；(2)將得到的新霉素酸化液以732型樹脂進行吸附和解吸處理，得到新霉素解析液；(3)將得到的新霉素解析液以711型樹脂進行脫色，得到新霉素脫色液；(4)將得到的新霉素脫色液進行薄膜濃縮，制得新霉素濃縮液。
[0017]優選地，上述所述的生產方法，其中還包括如下步驟:(I)將制得的新霉素濃縮液加入硫酸成鹽后制得硫酸新霉素成品液；(2)將制得的硫酸新霉素成品液通過嗔霧干媒制得硫Ife新霉素成品。[0018]作為本發明一個【具體實施方式】，提供了一種提高新霉素產量的生產方法，其為:
[0019]斜面培養基(g/100ml)配方:葡萄糖1.0、牛肉膏0.2、瓊脂1.8~2.2、磷酸氫二鉀 0.05、DL-天冬素 0.05。
[0020]種瓶培養基(g/100ml)配方:葡萄糖2.0、DL-天冬素0.06、蛋白胨0.5、花生餅粉
2.8、酵母粉0.5、大米粉8.0、玉米漿0.25、淀粉酶0.0025、硫酸銨0.6、輕質碳酸鈣0.45。
[0021]繁殖罐種子培養基(g/100ml)配方:花生餅粉1.0、玉米淀粉1.0、酵母粉2.25、葡萄糖2.5、蛋白胨0.5、硫酸銨0.1、輕質碳酸鈣L 4、Na2HPO40.1、豆油0.28。
[0022]發酵罐發酵培養基(g/100ml)配方:黃豆餅粉0.5、花生餅粉2.8、大米粉5.0、酵母粉0.9、葡萄糖1.5、蛋白胨1.0、硫酸銨0.5、氯化鈉0.45輕質碳酸鈣0.45、KH2PO40.06、α -淀粉酶0.02、豆油0.12、硅油0.05，加入選自如下的一種或多種添加劑及其加入量:
[0023]
1)賴氨酸0.05-0.5 y_i/升
2)乳酸亞鐵0.05-0.5 --/升
3)蛋氨酸0.3-1.0克/升
4)酪氨酸0.01-0.3克/升
5)維生素B120.02-0.45毫克/升
6)水解酪素0.5-50克/升
7)果糖0.5-25克/升
8)氨基葡萄糖0.5-25克/升
9)葉酸0.01-0.2毫克/升
10)核黃素0.02-0.45毫克/升
11)色氨酸0.1-0.3克/升。
[0024]斜面培養基制備:按處方量稱取所用物料，溶解均勻，加飲用水至配制全量，然后用氫氧化鈉溶液調節PH，使消后pH至6.0左右，分裝至250ml茄瓶中，裝量為50ml，于壓力
0.1MPa，進行121°C、30min濕熱滅菌，取出待稍冷后制成斜面，斜面長占茄瓶的2/3，冷卻備用。
[0025]斜面接種培養:無菌挖塊取生產新霉素用弗氏鏈霉菌菌種孢子約10_X6mm，用劃線法涂布在斜面培養基上，用棉塞塞緊，接后于28°C的恒溫室培養10~12天，得斜面孢子。
[0026]斜面孢子懸浮液制備:選2-3瓶生長正常且符合質量要求的孢子斜面，在無菌條件下，各加50ml無菌水制成孢子懸液，然后合并于750ml的三角瓶中，置0_4°C條件下保存，保存時間為8hr內，得待接種用斜面孢子懸浮液。
[0027]種子培養基制備:按處方量稱取配料，溶解均勻，加純化水至配制全量，然后用氫氧化鈉溶液調節PH，使消后pH至6.5左右，分裝至750ml三角瓶中，裝量為80ml，于壓力
0.1MPa，進行121°C、30min濕熱滅菌，取出冷卻備用。
[0028]種子培養:每只種瓶接種量為3-4cm2斜面孢子，每只種子瓶培養基為80ml，于轉速為220-240rpm的搖瓶機上，在溫度為35°C的條件下培養6天，得種子發酵液考察斜面種
子質量。
[0029]繁殖罐種子培養基制備:按繁殖罐種子培養基配比稱量所需的原材料，加飲用水加至實際配制量，進行12rC、30min滅菌，備用。
[0030]繁殖罐種子接種及培養:將新霉素斜面孢子懸浮液置于繁殖罐中進行擴大培養，種子接入量為擴大培養基體積的2%，培養溫度為36°C，培養時間為42小時，得到新霉素繁殖培養物。
[0031]發酵培養基制備:按發酵培養基配比稱量所需的原材料，加飲用水加至實際配制量，進行121°C、30min滅菌，備用。
[0032]發酵培養:將上述繁殖培養物置于發酵培養基上進行發酵培養，種子接入量為發酵培養基體積的15-20%，發酵溫度為35°C，發酵時間為130小時，得到新霉素發酵產物；
[0033]將上步得到的新霉素發酵產物進行酸化處理至pH值為6-7，得到新霉素酸化液；
[0034]將上步得到的新霉素溶液以732樹脂進行吸附解吸處理，得到新霉素解析液；
[0035]將上步得到的新霉素解析液以711樹脂進行脫色，得到新霉素脫色液；
[0036]將上步得到的新霉素脫色液以薄膜進行濃縮，得到新霉素濃縮液；
[0037]將上步得到的新霉素濃縮液加入硫酸成鹽后制得硫酸新霉素成品液；
[0038]將上步得到硫酸新霉素通過噴霧干燥制得硫酸新霉素成品。
[0039]本發明令人意外地發現，在常規的新霉素微生物發酵生產工藝中，在其常規發酵培養基中加入特定的添加劑，能顯著提高發酵液中新霉素的產量。且生產工藝相對易于控制，生產工藝改變小，且生產成本更低，能夠更好地應用于規模化生產中。改進前生產的硫酸新霉素產品發酵液含量為18000u/ml，本發明生產的硫酸新霉素產品發酵液含量達22000u/mlo本發明相比傳統發酵方法具有如下優點:提高新霉素產量5-20%以上，降低成本，增加發酵效率。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0040]圖1:新霉素發酵配方增加添加劑發酵效率增幅百分比圖表
[0041]具體實施方法
[0042]下面列舉實施例，對本發明加以進一步說明，但本發明不只限于這些實施例。
[0043]實施例1:在黃豆餅粉0.5、花生餅粉2.8、大米粉5.0、酵母粉
[0044]0.9、葡萄糖1.5、蛋白胨1.0、硫酸銨0.5、氯化鈉0.45輕質碳酸鈣0.45、KH2PO40.06、α-淀粉酶0.02、豆油0.12、硅油0.05的弗氏鏈霉菌常規發酵培養基中，添加賴氨酸，濃度0.3克/升，按常規方法接種弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae-Η菌株)(SY060112)，在ρΗ7.0，培養溫度35°C，體積50升的條件下發酵130小時。
[0045]實施方法:
[0046](I)斜面培養基％(g/100ml)配方:葡萄糖1.0、牛肉膏0.2、瓊脂1.8~2.2、磷酸氫二鉀0.05、DL-天冬素0.05
[0047](2)種瓶培養基％(g/100ml)配方:葡萄糖2.0、DL-天冬素0.06、蛋白胨0.5、花生餅粉2.8、酵母粉0.5、大米粉8.0、玉米漿0.25、淀粉酶0.0025、硫酸銨0.6、輕質碳酸鈣
0.45[0048](3)繁殖罐種子培養基％(g/100ml)配方:花生餅粉1.0、玉米淀粉1.0、酵母粉
2.25、葡萄糖2.5、蛋白胨0.5、硫酸銨0.1、輕質碳酸鈣L 4、Na2HPO40.1、豆油0.28
[0049](4)發酵罐發酵培養基％(g/100ml)配方:黃豆餅粉0.5、花生餅粉2.8、大米粉5.0、酵母粉0.9、葡萄糖1.5、蛋白胨1.0、硫酸銨0.5、氯化鈉0.45輕質碳酸鈣0.45、KH2PO40.06、α -淀粉酶0.02、豆油0.12、硅油0.05、賴氨酸濃度0.03
[0050](5)斜面培養基制備:按處方量稱取所用物料，溶解均勻，加飲用水至配制全量，然后用氫氧化鈉溶液調節ΡΗ，使消后pH至6.0左右，分裝至250ml茄瓶中，裝量為50ml，于壓力0.1MPa，進行121°C、30min濕熱滅菌，取出待稍冷后制成斜面，斜面長占茄瓶的2/3，冷卻備用。
[0051](6)斜面接種培養:無菌挖塊取生產新霉素用弗氏鏈霉菌菌種孢子約
用劃線法涂布在斜面培養基上，用棉塞塞緊，接后于28°C的恒溫室培養10~12天，得斜面孢子。
[0052](7)斜面孢子懸浮液制備:選2-3瓶生長正常且符合質量要求的孢子斜面，在無菌條件下，各加50ml無菌水制成孢子懸液，然后合并于750ml的三角瓶中，置0_4°C條件下保存，保存時間為8hr內，得待接種用斜面孢子懸浮液。(8)種子培養基制備:按處方量稱取配料，溶解均勻，加純化水至配制全量，然后用氫氧化鈉溶液調節PH，使消后pH至6.5左右，分裝至750ml三角瓶中，裝量為80ml，于壓力0.1MPa，進行121°C、30min濕熱滅菌，取出冷卻備用。
[0053](9)種子培養:每只種瓶接種量為3_4cm2斜面孢子,每只種子瓶培養基為80ml，于轉速為220-240rpm的搖瓶機上，在溫度為35°C的條件下培養6天，得種子發酵液考察斜面種子質量。
[0054](10)繁殖罐種子培養基制備:按繁殖罐種子培養基配比稱量所需的原材料，加飲用水加至實際配制量，進行12rC、30min滅菌,備用。
[0055](11)繁殖罐種子接種及培養:將新霉素斜面孢子懸浮液置于繁殖罐中進行擴大培養，種子接入量為擴大培養基體積的2%，培養溫度為36°C，培養時間為42小時，得到新霉素繁殖培養物。
[0056](12)發酵培養基制備:按發酵培養基配比稱量所需的原材料，加飲用水加至實際配制量，進行12rC、30min滅菌，備用。
[0057](13)發酵培養:將上述繁殖培養物置于發酵培養基上進行發酵培養，種
[0058]子接入量為發酵培養基體積的15-20%，發酵溫度為35°C，發酵
[0059]時間為130小時，得到新霉素發酵產物；
[0060]實施例2:添加劑是乳酸亞鐵，濃度0.6克/升，代替實施例1中的賴氨酸濃度0.3克/升，培養基組成和用量，以及發酵條件均與實施例1相同。 [0061 ] 實施例3:添加劑是蛋氨酸，濃度0.6克/升，代替實施例1中的賴氨酸濃度0.3克/升，培養基組成和用量，以及發酵條件均與實施例1相同。
[0062]實施例4:添加劑是酪氨酸,濃度0.3克/升，代替實施例1中的賴氨酸濃度0.3克/升，培養基組成和用量，以及發酵條件均與實施例1相同。
[0063]實施例5:添加劑是水解酪素,濃度5克/升,代替實施例1中的賴氨酸濃度0.3克/升，培養基組成和用量，以及發酵條件均與實施例1相同。[0064]實施例6:添加劑是維生素B 12，濃度0.05毫克/升，代替實施例1中的賴氨酸濃度0.3克/升，培養基組成和用量，以及發酵條件均與實施例1相同。
[0065]實施例7:添加劑是果糖，濃度2.0克/升，代替實施例1中的賴氨酸濃度0.3克/升，培養基組成和用量，以及發酵條件均與實施例1相同。
[0066]實施例8:添加劑是氨基葡萄糖，濃度1.5克/升，代替實施例1中的賴氨酸濃度
0.3克/升，培養基組成和用量，以及發酵條件均與實施例1相同。
[0067]實施例9:添加劑是葉酸，濃度0.05毫克/升，代替實施例1中的賴氨酸濃度0.3克/升，培養基組成和用量，以及發酵條件均與實施例1相同。
[0068]實施例10:添加劑是核黃素，濃度0.05毫克/升，代替實施例1中的賴氨酸濃度
0.3克/升，培養基組成和用量，以及發酵條件均與實施例1相同。
[0069]實施例11:添加劑是色氨酸，濃度0.3克/升，代替實施例1中的賴氨酸濃度0.3克/升，培養基組成和用量，以及發酵條件均與實施例1相同。
[0070]對照例1:添加劑是 氯化鎂，濃度0.3克/升，代替實施例1中的賴氨酸濃度0.3克/升，培養基組成和用量，以及發酵條件均與實施例1相同。
[0071]對照例2:添加劑是葡萄糖酸鈉，濃度2.0克/升，代替實施例1中的賴氨酸濃度
0.3克/升，培養基組成和用量，以及發酵條件均與實施例1相同。
[0072]對照例3:添加劑是氯化鋅，濃度0.4克/升，代替實施例1中的賴氨酸濃度0.3克/升，培養基組成和用量，以及發酵條件均與實施例1相同。
[0073]對照例:按實施I的方法，但發酵培養基中不添加任何添加劑。黃豆餅粉0.5克/升、花生餅粉2.8克/升、大米粉5.0克/升、酵母粉0.9克/升、葡萄糖1.5克/升、蛋白胨
1.0克/升、硫酸銨0.5克/升、氯化鈉0.45克/升、輕質碳酸鈣0.45克/升、KH2PO40.06克/升、α -淀粉酶0.02克/升、豆油0.12克/升、硅油0.05克/升的弗氏鏈霉菌常規發酵培養基中，按常規方法接種弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae-Η菌株)(代號SY060112)，在ρΗ7.0,培養溫度35°C，體積50升的條件下發酵130小時。除不添加添加劑外，其他培養基組成和用量，以及發酵條件均與實施例1相同。
[0074]新霉素生物效價測定:
[0075]測量新霉素的生物效價的標準菌種為金黃色葡萄球菌。將已知效價的標準溶液和被檢品溶液，滴加在金黃色葡萄球菌的培養基上進行對照培養，產生透明的抑菌圈。比較標準品和被檢品抑菌圈的大小，計算新霉素抗菌效價和發酵效率，
[0076]對照例、實施例1 一 11以及對照例I 一 3的新霉素生物效價測定結果見表1和圖1o
[0077]表1:添加劑對新霉素發酵單位和發酵效率的影響
[0078]
【權利要求】
1.一種提高新霉素產量的生產方法，所述方法是采用微生物發酵法，并且使用弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae),其特征在于在常規發酵培養基中加入添加劑,所述添加劑選自如下的一種或者多種:賴氨酸、乳酸亞鐵、蛋氨酸、酪氨酸、水解酪素、維生素B12、果糖、氨基葡萄糖、葉酸、核黃素、色氨酸。
2.根據權利要求1所述的生產方法，其中添加劑的加入量優選為:賴氨酸0.05-0.5克/升、乳酸亞鐵0.05-0.5克/升、蛋氨酸0.3-1.0克/升、酪氨酸0.01-0.3克/升、水解酪素0.5-50克/升、維生素B120.02-0.45毫克/升、果糖0.5-25克/升、氨基葡萄糖0.5-25克/升、葉酸0.01-0.2毫克/升、核黃素0.02-0.45毫克/升或者色氨酸0.1-0.3克/升。
3.根據權利要求1-2所述的生產方法，其中所述的常規發酵培養基的組成，按g/100ml計為:黃豆餅粉0.5、花生餅粉2.8、大米粉5.0、酵母粉0.9、葡萄糖1.5、蛋白胨1.0、硫酸銨0.5、氯化鈉0.45、輕質碳酸鈣0.45、KH2PO40.06、α -淀粉酶0.02、豆油0.12、硅油0.05。
4.根據權利要求1-3所述的生產方法，其包括如下步驟: (1)斜面培養制得斜面孢子:將弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae)接種至斜面培養基內，接后于28°C的恒溫室培養10~12天，得斜面孢子，其中，所述的斜面培養基為(g/100ml):葡萄糖1.0、牛肉膏0.2、瓊脂1.8~2.2、磷酸氫二鉀0.05和DL-天冬素0.05 ； (2)制備斜面孢子懸浮液:選步驟(1)中生長正常且符合質量要求的斜面孢子，在無菌條件下，加無菌水制成孢子懸液，置0-4°C條件下保存，保存時間為Shr內，得待接種用斜面孢子懸浮液； (3)繁殖罐培養制備新霉素繁殖培養物:將步驟(2)制得的斜面孢子懸浮液置于繁殖罐中進行擴大培養，種 子接入量為擴大培養基體積的2%，培養溫度為36°C，培養時間為42小時，得到新霉素繁殖培養物，其中，繁殖罐培養所用的培養基為:按g/100ml計，花生餅粉1.0、玉米淀粉1.0、酵母粉2.25、葡萄糖2.5、蛋白胨0.5、硫酸銨0.1、輕質碳酸鈣1.4、Na2HP040.1、豆油 0.28 ； (4)發酵罐發酵培養制備新霉素發酵產物:將步驟(3)所制得的新霉素繁殖培養物置于發酵罐中進行發酵培養，種子接入量為發酵培養基體積的15~20%，發酵溫度為35°C，發酵時間為130小時，得到新霉素發酵產物，其中，發酵罐培養所用的培養基為:按g/100ml計，黃豆餅粉0.5、花生餅粉2.8、大米粉5.0、酵母粉0.9、葡萄糖1.5、蛋白胨1.0、硫酸銨0.5、氯化鈉0.45、輕質碳酸鈣0.45、KH2PO40.06、α -淀粉酶0.02、豆油0.12、硅油0.05，并加入添加劑，按培養基的體積計，所述添加劑選自如下的一種或者一種以上:賴氨酸0.05-0.5克/升，乳酸亞鐵0.05-0.5克/升，蛋氨酸0.3-1.0克/升，酪氨酸0.01-0.3克/升，維生素Β12，0.02-0.45毫克/升，水解酪素0.5-50克/升，果糖0.5-25克/升，氨基葡萄糖0.5-25克/升，葉酸0.01-0.2毫克/升，核黃素0.02-0.45毫克/升，色氨酸0.1-0.3克/升； (5)將步驟(4)所得到的新霉素發酵產物經分離和純化處理制得新霉素。
5.根據權利要求4所述的生產方法，其中在步驟(2)中，通過種子培養考察斜面孢子質量，每只種瓶接種量為3-4cm2斜面孢子，每只種瓶中培養基為80ml，于轉速為220_240rpm的搖瓶機上，在溫度為35°C的條件下培養6天，得種子發酵液考察斜面孢子質量，其中種子培養所用的培養基為(g/100ml):葡萄糖2.0、DL-天冬素0.06、蛋白胨0.5、花生餅粉2.8、酵母粉0.5、大米粉8.0、玉米漿0.25、淀粉酶0.0025、硫酸銨0.6、輕質碳酸鈣0.45。
6.根據權利要求1一 5所述的生產方法，其中所述的分離和純化處理制得新霉素的過程包括如下步驟:(I)將得到的新霉素發酵產物進行酸化處理至PH值為6-7，得到新霉素酸化液；(2)將得到的新霉素酸化液以732型樹脂進行吸附和解吸處理，得到新霉素解析液；(3)將得到的新霉素解析液以711型樹脂進行脫色，得到新霉素脫色液；(4)將得到的新霉素脫色液進行薄膜濃縮，制得新霉素濃縮液。
7.根據權利要求1一 6所述的生產方法，其中還包括如下步驟:(I)將制得的新霉素濃縮液加入硫fe成鹽后制得硫fe新霉素成品液;(2)將制得的硫酸新霉素成品液通過喂霧干燥制得硫酸新霉素成品。`
【文檔編號】C12P19/52GK103740790SQ201310713136
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月20日 優先權日:2013年12月20日
【發明者】尹國民, 齊紅革, 鄭朝霞, 劉洪海, 唐茂峰 申請人:煙臺只楚藥業有限公司