專利名稱：一種雞大腸桿菌病檢測用試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及的是生物技術領域，尤其是一種應用于雞大腸桿菌病檢測過程中用的試劑盒。
背景技術：
雞大腸桿菌病是由大腸桿菌引起的一種常見多發病。其中包括大腸桿菌性腹膜炎、輸卵管炎、臍炎、滑膜炎、氣囊炎、肉芽腫、眼炎等多種疾病，對養雞業危害較大。1、臨床癥狀由致病性大腸桿菌引起的疾病在臨診上表現極其多樣化。現僅就文獻報道的歸納如下: (I)急性敗血型病雞不顯癥狀而突然死亡；或癥狀不明顯；部分病雞離群呆立，或擠堆，羽毛松舌L食欲減退或廢絕，排黃白色稀糞，肛門周圍羽毛污染，發病率死亡率較高，這是目前危害最大的一個型。通常所說的雞大腸桿菌病指的就是這個型。目前對本型的診斷主要靠臨診時剖檢死、病雞只，肉眼觀察病理變化作出。 (2)卵黃性腹膜炎又稱“蛋子瘟”這是籠養蛋雞的一種重要疾病。病雞的輸卵管常因感染大腸桿菌而產生炎癥，炎癥產物使輸卵管傘部粘連，漏斗部的喇叭口在排卵時不能打開，卵泡因此不能進入輸卵管而跌入腹腔而引發本病。廣泛的腹膜炎產生大量毒素，可引起發病母雞死亡。不少蛋雞場或種雞場常因本病造成重大經濟損失。此種死、病母雞，外觀腹部膨脹、重墜。 (3)輸卵管炎多見于產蛋期母雞。輸卵管充 血、出血，或內有多量分泌物，產生畸形蛋和內含大腸桿菌的帶菌蛋，嚴重者減蛋或停止產蛋。 (4)腸炎病雞肛門下方羽毛潮濕、污穢、粘連，這是本菌引起腹瀉的一種征兆。(5)生殖器官病患病母雞卵泡膜充血，卵泡變形，局部或整個卵泡紅褐色或黑褐色，有的硬變，有的卵黃變稀。有的病例卵泡破裂，輸卵管粘膜有出血斑和黃色絮狀或塊狀的干酪樣物；公雞睪丸膜充血，交媾器充血、腫脹。從上述病變器官均可分離到致病性大腸桿菌。還有報道，本菌會引起母雞卵泡囊腫。 (6)關節炎或足墊腫 幼、中雛感染居多。一般呈慢性經過，病雞關節腫脹，跛行，從此類病雞的關節或足墊中常可分離到大腸桿菌。 (7)肉芽腫部分成雞感染本菌后常在腸道等處產生大腸桿菌性肉芽腫。十二指腸和盲腸等部位以及偶爾在肝和脾臟產生肉芽腫，病變可從很小的結節到大塊組織壞死。 (8)死胚和孵化率低下本菌經蛋傳播或穿透蛋殼進入蛋內的情況下，即可發生。(9)蛋黃囊炎和臍炎指幼雞的蛋黃囊、臍部及其周圍組織的炎癥。主要發生于孵化后期的胚胎及I 2周齡的雛雞，死亡率為3 % 10 %，甚者高達40 %。表現為蛋黃吸收不良，臍部閉合不全，腹部脹大下垂等異常變化。引起本病的病因相當復雜，但據報道，以大腸桿菌導致的發病率為最高。 (10)全眼球炎患大腸桿菌性全眼球炎的病雞，眼睛灰白色，角膜混濁，眼前房積膿，常因全眼球炎而失明。 (11)大腸桿菌性腦病本病為廣東禽病工作者近年所報道。發現血清型022、053和086:B7等大腸桿菌能突破雞的血腦屏障進入腦部，引起病雞昏睡、神經癥狀和下痢，不吃不喝，難以治愈。且該菌在腦的分離成功率最高。本病可在滑膜支原體病、敗血支原體病、傳染性鼻炎和傳染性喉氣管炎的基礎上繼發或混合感染，又可獨立發生。2、檢測手段目前對雞大腸桿菌病的監控及檢測方法一般是國際上通用的培養法，具體步驟如下:(I)增菌米集樣品，于無菌條件下，稱取樣品25g,加在225mL營養肉湯中，用均質器打碎Imin或用乳缽加滅菌砂磨碎，取出適量，接種乳糖膽鹽培養基，以測定大腸菌群MPN，其余的移入500mL廣口瓶中，于36 ± I °C培養6h。挑取I環，接種于I管30mL腸道菌增菌肉湯內，于42°C培養18h。(2)分離將乳糖發酵陽性的乳糖膽鹽發酵管和增菌液分別劃線接種麥康凱或伊紅美蘭瓊脂平板。對于污染嚴重的檢樣，可將檢樣勻液直接劃線接種麥康凱或伊紅美蘭平板，于36±1°C培養18 24h,觀察菌落。(3)生化試驗自鑒別平板上直接挑取數個菌落分別接種三糖鐵瓊脂或克氏雙糖鐵瓊脂。同時將這些培養物分別接種蛋白胨水、半固體、pH7.2尿素瓊脂、KCN肉湯和賴氨酸脫羧酶試驗培養基。以上培養物均在36 °C培養過夜。三糖鐵瓊脂斜面產酸或不產酸、底層產酸，H2S陰性和尿素陰性的培養物為大腸桿菌。三糖鐵瓊脂底層不產酸，或h2s、kcn、尿素有任一項為陽性的培養物，均非大腸桿菌。必要時做氧化酶試驗和革蘭氏染色。(4)血清學試驗用致病大腸桿菌多價O血清做玻片凝集試驗，如呈現強凝集反應，即為試驗陽性。3、PCR 檢測目前PCR檢測技術已趨于成熟，利用DNA的半保留復制傳代方式，對樣品中的目的基因序列進行聚合酶鏈式反應能快速、準確的檢測出目的基因序列。由于PCR檢測反應體系的建立需要很大的工作量，因此，出現了包括有完成反應體系，能用來簡單操作，進行快速檢測的PCR試劑盒產品，目前的PCR試劑盒的反應體系一般包括兩種反應液，其中第一反應液是進行PCR擴增的反應體系，達到目的基因快速增殖的目的，第二反應液是用來進行顯色反應以使得增殖產物能夠被定量或者定性檢出的反應體系。目前這兩種反應液均以盛裝于PCR管中，而后置于泡沫質材料中進行銷售運輸的，這樣的方式雖然使用方便，但是，不利于大量運輸，使得產品成本很高。發明內容本實用新型所要解決的技術問題，就是針對現有技術所存在的不足，而提供一種能大量運輸PCR反應液、便于吸取且具有一定抗污染能力的試劑盒。本方案是通過如下技術措施來實現的:本新型公開的雞大腸桿菌病檢測用試劑盒包括有長方體盒體，盒體內固定有兩塊十字交叉的平板，兩塊平板隔出的四個密閉空間內各設有一個與固定在盒體上的彈性液囊，彈性液囊和盒體固定連接處設有連接外部空間和液囊內部的通孔，盒體外表面的通孔上設有孔蓋。上述四個液囊中兩個用來盛裝PCR檢測大腸桿菌的反應液一，剩余兩個用來盛裝
反應液二。上述的兩塊十字交叉平板表面涂有石蠟，且盒體和孔蓋均為保溫材料。本方案的有益效果可根據對上述方案的敘述得知，由于在該方案中盛裝反應液體系的是彈性液囊，因此在吸取的時候，不會有殘余反應液，方便清洗及重復使用；本方案中，每種反應液都盛裝了兩份，能避免反應液被污染使得整個檢測被迫中止的情況發生；而平板上涂抹石蠟的目的在于，當液囊意外破掉時，石蠟能減輕對反應液的污染同時也能避免反應液對其它密閉空間的滲透。由此可見，本實用新型與現有技術相比，具有實質性特點和進步，其實施的有益效果也是顯而易見的。
圖1為本實用新型具體實施方式
的結構示意圖。圖2為圖1的左視全剖結構示意圖。圖中，I為盒體,2為平板,3為液囊,4為孔蓋。
具體實施方式
為能清楚說明本方案的技術特點，下面通過一個具體實施方式
，并結合其附圖，對本方案進行闡述。通過附圖可以看出，本方案的試劑盒包括有長方體盒體,盒體內固定有兩塊十字交叉的平板，兩塊平板隔出的四個密閉空間內各設有一個與固定在盒體上的彈性液囊，彈性液囊和盒體固定連接處設有連接外部空間和液囊內部的通孔，盒體外表面的通孔上設有孑匕蓋。上述四個液囊中上面兩個用來盛裝PCR檢測大腸桿菌的反應液一，下面兩個用來
盛裝反應液二。上述的兩塊 十字交叉平板表面涂有石蠟，且盒體和孔蓋均為保溫材料。
權利要求1.一種雞大腸桿菌病檢測用試劑盒，其特征是:所述試劑盒包括有長方體盒體(1)，盒體(I)內固定有兩塊十字交叉的平板(2)，兩塊平板(2)隔出的四個密閉空間內各設有一個與固定在盒體上的彈性液囊(3)，彈性液囊(3)和盒體(1)固定連接處設有連接外部空間和液囊內部的通孔，盒體外表面的通孔上設有孔蓋(4 )。
2.根據權利要求1所述的雞大腸桿菌病檢測用試劑盒，其特征是:所述的兩塊十字交叉平板(2)表面涂有石蠟。
3.根據權利要求1所述的雞大腸桿菌病檢測用試劑盒，其特征是:所述的盒體(I)及孔蓋(4)的材質為保溫材料。
專利摘要本實用新型提供了一種能大量運輸PCR反應液、便于吸取且具有一定抗污染能力的試劑盒。本新型公開的雞大腸桿菌病檢測用試劑盒包括有長方體盒體，盒體內固定有兩塊十字交叉的平板，兩塊平板隔出的四個密閉空間內各設有一個與固定在盒體上的彈性液囊，彈性液囊和盒體固定連接處設有連接外部空間和液囊內部的通孔，盒體外表面的通孔上設有孔蓋。
文檔編號C12M1/00GK203112815SQ20132009990
公開日2013年8月7日 申請日期2013年3月6日 優先權日2013年3月6日
發明者李桂芹, 孟薔, 劉海兵 申請人:濱州職業學院