使用甲羥戊酸作為底物的3-甲基丁-3-烯-1-醇的酶促生產方法
【專利摘要】本發明描述了通過生物方法生成3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法。更具體而言，描述了用于從甲羥戊酸生產3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法。
【專利說明】使用甲羥戊酸作為底物的3-甲基丁-3-烯-1-醇的酶促生 產方法
[0001] 本發明涉及使用甲羥戊酸作為底物并將其酶促轉化為3-甲基丁-3-烯-1-醇的 生產3-甲基丁 -3-烯-1-醇的方法。此外，本發明涉及生產異戊二烯的方法，所述方法包 括使用甲羥戊酸作為底物并通過脫羧作用步驟將其酶促轉化為3-甲基丁 -3-烯-1-醇的 生產3-甲基丁 -3-烯-1-醇的方法，并且還包括將生產的3-甲基丁 -3-烯-1-醇轉化為 異戊二烯的步驟。
[0002] 本發明也涉及生產異戊醇的方法，所述方法包括使用甲羥戊酸作為底物并通過脫 羧作用步驟將其酶促轉化為3-甲基丁-3-烯-1-醇的生產3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法， 并且還包括將生產的3-甲基丁 -3-烯-1-醇轉化為異戊醇的步驟。
[0003] 3-甲基丁-3-烯-1-醇對應式C5H1(l0。它能夠用于生產異戊烯醇，異戊烯醇用于 香料或在制藥工業中作為構件使用，例如在檸檬醛、維生素 A和維生素 E的生產中。它是通 過異丁烯和甲醛的縮合，生成3-甲基丁 -3-烯-1-醇進一步被異構化為異戊烯醇化學生產 的。
[0004] 目前用于生產3-甲基丁 -3-烯-1-醇的生物學路線涉及甲羥戊酸途徑：生產甲羥 戊酸，然后二磷酸化，然后脫羧-脫水至焦磷酸3-甲基丁 -3-烯-1-醇酯，并最后兩次脫磷 酸至3-甲基丁 -3-烯-1-醇（美國專利申請20080092829)。
[0005] 3-甲基丁 -3-烯-1-醇能夠被轉化為異戊二烯，異戊二烯是輪胎工業的關鍵化合 物，并且也在粘合劑中有許多應用。它是使用若干種路線化學地生產的：
[0006] -從油中萃取蒸餾（C5餾分）
[0007] -異戊烯脫氫
[0008] -異戊烷的雙脫氫
[0009] _異丁稀和甲醒反應 [0010]-丙酮和乙炔的反應
[0011] -丙烯二聚化
[0012] W0 2009/076676報道了至異戊二烯的代謝途徑。途徑基于甲羥戊酸途徑的下游中 間體，即焦磷酸3-甲基丁 -3-烯-1-醇酯或焦磷酸異戊烯醇酯的脫磷酸-脫水。此方法的 缺點是要求經歷整個甲羥戊酸途徑：甲羥戊酸雙磷酸化，然后脫羧-脫水至焦磷酸3-甲基 丁 -3-烯-1-醇酯，再異構化為焦磷酸異戊烯醇酯，并最后雙脫磷酸/脫水至異戊二烯。
[0013] 異戊醇是非常重要的化學制品，通常用作脂肪、油、樹脂和生物堿的溶劑。在香料 工業中，例如在用于香皂和化妝品香料的水楊酸異戊醇酯的制造中存在對異戊醇的需求。 它也用于磷酸的制造。此外，它用于擬除蟲菊酯的合成。生產異戊醇的商業方法包括雜醇 油的分餾、烷烴的氯化和隨后的水解以生產異構體的混合物以及正丁烯的低壓羰基合成或 加氫甲酰基化，然后氫化獲得的異戊醛。
[0014] W0 2011/076261描述了使用具有脫羧酶活性的酶通過甲羥戊酸的酶促轉化生產 3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法。盡管在W0 2011/076261中描述的方法允許通過酶促轉化 甲羥戊酸生產3-甲基丁 -3-烯-1-醇，對于改善，特別是關于方法的效率方面從而使得其 適于工業目的仍然有需求。本發明解決了這方面的需求。
[0015] 因此，在第一個方面，本發明涉及從甲羥戊酸生產3-甲基丁-3-烯-1-醇的 方法。特別地，本發明涉及從甲羥戊酸經過生物過程，特別是酶促過程生產3-甲基 丁 -3-烯-1-醇的方法，在所述酶促過程中組合兩種類型的酶以增加生產速率的效率。更 具體而言，本發明涉及生產3-甲基丁 -3-烯-1-醇的方法，其特征在于其包括通過
[0016] (i)具有將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸的活性的第一種酶；和
[0017] (ii)與第一種酶不同并且具有將所述甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁 -3-烯-1-醇的活性的第二種酶
[0018] 將甲羥戊酸轉化為3-甲基丁-3-烯-1-醇。
[0019] 本發明也涉及至少兩種酶的用途，其中一種酶選自如上所述的（i)并且另一種酶 選自如上所述的（ii)，或生產所述酶的組合的微生物的用途，用于從甲羥戊酸生產3-甲基 丁-3-烯-1-醇。
[0020] 本發明也涉及生物，優選地微生物，其生產至少兩種酶，其中一種酶選自如上所述 的（i)并且另一種酶選自如上所述的（ii)。
[0021] 術語"甲羥戊酸"包含甲羥戊酸和甲羥戊酸的陰離子，所述陰離子是生物介質中的 主要形式。甲羥戊酸是生產萜和類固醇的被稱為甲羥戊酸途徑的生物合成途徑中的前體。 甲羥戊酸是焦磷酸3-甲基丁 -3-烯-1-醇酯的主要前體，后者反過來是所有類萜的基礎。 在圖1中顯示甲羥戊酸的結構式。甲羥戊酸（3, 5-二羥基-5-甲基戊酸）是手性的并且以 兩種對映異構體，R和S存在。在本發明中術語"甲羥戊酸"涵蓋兩種手性形式，盡管兩種形 式之一，例如R形式，是天然地主要生產的形式，
[0022] 在本發明的背景中術語3-甲基丁-3-烯-1-醇（isoprenol)包含對應式C5H 1(l0的 化合物。isoprenol的IUPAC名稱為3-甲基丁-3-烯-1-醇。3-甲基丁-3-烯-1-醇的異 名是，例如，2-甲基-1-丁烯-4-醇、3-丁烯-1-醇-3-甲基、3-異戊烯基醇、3-甲基-3-丁 烯-1-醇、異丁烯基甲醇、異丙烯基乙醇和甲代烯丙基甲醇。
[0023] 如以上所提及的，W0 2011/076261描述了使用具有脫羧酶活性的酶通過甲羥戊酸 的酶促轉化生產3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法。已經在W0 2011/076261中描述了一般 而言，通過具有脫羧酶活性的酶，例如甲羥戊酸二磷酸（MDP)脫羧酶（E. C. 4. 1. 1. 33)的甲 羥戊酸向3-甲基丁-3-烯-1-醇的轉化，通過甲羥戊酸向甲羥戊酸3-磷酸的轉化，后者然 后脫磷酸/脫羧以產生3-甲基丁 -3-烯-1-醇而進行。在圖2中描述了使用甲羥戊酸二 磷酸通過MDP脫羧酶進行的通用反應。在甲羥戊酸二磷酸脫羧酶與其天然底物甲羥戊酸 5_二磷酸的天然反應的情況中，反應的第一步，即磷酸化步驟，導致不穩定的中間體（3-膦 氧基-3-甲基-5-二磷酸戊酸；見圖2A)。甲羥戊酸5-二磷酸的磷酸化因此協助反應的 第二步，即磷酸（脫磷酸作用）和C0 2(脫羧作用）的協調的釋放以生產異戊烯基二磷酸 (Byres等人.，J. Mol. Biol. 371 (2007)，540-553)。由于反應的兩步是由相同的酶催化的， 假定當使用甲羥戊酸作為底物時反應將經歷相同的機理并且也將涉及不穩地的中間體，所 述中間體立即通過第二反應步驟被酶轉化。這也由Dhe-Paganon等人支持（Biochemistry 1994, 33, 13355-13362)，其描述了用酵母甲羥戊酸二磷酸脫羧酶實施的關于其作用機理和 受氟化的化合物抑制的機理的實驗。作者得出結論即甲羥戊酸二磷酸的C 3-羥基被ATP磷 酸化，生成p-Mev-pp，其電離，留下C3上的碳正離子，迅速地后接脫羧作用。因此，理解是由 甲羥戊酸二磷酸脫羧酶催化的反應的中間體被酶立即轉化為終產物。
[0024] 然而，已經令人驚訝地發現，當使用甲羥戊酸作為底物時，反應的中間體，即甲羥 戊酸3-磷酸，并不是不穩定的而是瞬間積累（見實施例3)。特別地，已經發現中間體并不 是立即被酶轉化而是被釋放并因此作為將其轉化為終產物的另一個酶的底物可獲得。此 夕卜，已經發現不同的脫羧酶，特別是甲羥戊酸二磷酸脫羧酶以不同的效率催化上述兩個步 驟，即一些脫羧酶以高于其他脫羧酶的效率催化第一步并且一些脫羧酶顯示對第二步，即 脫羧作用步驟的偏好。由于此以及中間體甲羥戊酸3-磷酸并不是不穩定的而是瞬間積累 的事實，現已經發現通過組合分別對反應的第一和第二步驟顯示高催化活性的酶，能夠極 大地增加如W0 2011/076261中所描述的甲羥戊酸向3-甲基丁 -3-烯-1-醇轉化的效率。 因此，本發明特別涉及用于在從甲羥戊酸酶促生產3-甲基丁-3-烯-1-醇中實現更高效率 的方法，即用于改善此類酶促生產的效率的方法。
[0025] 術語"具有將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸的活性的酶"意為能夠將甲羥戊酸 磷酸化為甲羥戊酸3-磷酸的酶。磷酰基團優選地來自ATP分子。
[0026] 活性可以，例如，如隨附的實施例，特別是實施例2中描述的那樣測量。因此一種 可能性是用甲羥戊酸和ATP孵育各個酶并測量ADP的生產（其反映了甲羥戊酸3-磷酸的 生產）。用于測量ADP的生產的測定法是本領域技術人員已知的。這些方法之一是實施例 2中描述的丙酮酸激酶/乳酸脫氫酶測定法。在這種情況下，測定法測量NADH的吸收率在 340nm處降低，這與ADP量成比例。備選地，可以通過直接測量生產的甲羥戊酸3-磷酸，例 如通過質譜法來測量活性。此類測定法在實施例3中描述。在優選的實施方案中術語"具 有將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸的活性的酶"意為可以將甲羥戊酸和ATP轉化為甲羥 戊酸3-磷酸和ADP的酶。甚至更優選地，此類酶可以以10mM或更低的K M，例如以5mM或更 低的KM，優選地ImM或更低，和甚至更優選0. ImM或更低的KM催化將甲羥戊酸轉化為甲羥戊 酸3-磷酸的反應，優選地將甲羥戊酸和ATP轉化為甲羥戊酸3-磷酸和ADP的反應。在特 別優選的實施方案中，此類酶可以以至少〇. 2^1的kMt，優選地以至少0. δ?Γ1的kMt，特別優 選地以至少1. (^1的keat，更優選地至少2. Of的keat和甚至更優選地以至少5. Of的kcat 催化將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸的反應，優選地將甲羥戊酸和ATP轉化為甲羥戊酸 3_磷酸和ADP的反應。
[0027] 在特別優選的實施方案中，將甲羥戊酸和ATP轉化為甲羥戊酸3-磷酸和ADP的能 力是在如實施例2中描述的或如實施例3中描述的測定法中測量的。
[0028] 術語"具有將所述甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基丁 -3-烯-1-醇的活性的酶"意 為催化這樣的反應的酶，在所述反應中有甲羥戊酸3-磷酸的脫羧作用和脫磷酸作用從而 生成3-甲基丁-3-烯-1-醇。
[0029] 此活性可以，例如，如隨附的實施例，特別是實施例4或5中描述的那樣測量。因 此一種可能性是實施組合的酶測定法，其中在允許通過嗜酸熱原體（Th. acidophilum)甲 羥戊酸二磷酸脫羧酶的L200E突變體（SEQ ID N0:16)將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸 并且原則上允許甲羥戊酸3-磷酸脫羧作用和脫磷酸作用成為3-甲基丁-3-烯-1-醇并檢 測3-甲基丁-3-烯-1-醇生產（例如通過氣相色譜）的條件下，將嗜酸熱原體甲羥戊酸二 磷酸脫羧酶的L200E突變體（SEQ ID N0:16)與甲羥戊酸和與各個酶孵育。在優選的實施 方案中此類測定法是在如實施例4或5中描述的測定法條件下進行的。在另外的優選的實 施方案中術語"具有將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基丁 -3-烯-1-醇的活性的酶"意為 這樣的酶，其能夠在此類測定法中導致與通過在此類測定法中使用嗜酸熱原體甲羥戊酸二 磷酸脫羧酶的L200E突變體（SEQ ID N0:16)與來自緩癥鏈球菌（S.mitis)的甲羥戊酸脫 羧酶（SEQ ID N0:10)的組合可以獲得的3-甲基丁-3-烯-1-醇生產相比至少一半高，更 優選地同樣高的3-甲基丁 -3-烯-1-醇生產。
[0030] 在特別優選的實施方案中，在如實施例4或5中描述的測定法中測量生產3-甲基 丁 -3_烯-1-醇的能力。
[0031] 在一個優選的實施方案中，以上（i)和（ii)中提及的酶，是被NCBI或等同的引擎 認定為具有C0G3407結構域的酶。
[0032] 在根據本發明的方法的優選的實施方案中，具有將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸 3_磷酸的活性的第一種酶（i)選自由以下組成的組 ：
[0033] (A)包含如SEQ ID NO: 1中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO: 1中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸的 活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID NO: 1中所示氨基酸序列的蛋白質的對應的活性至 少一樣1? ;
[0034] (B)包含如SEQ ID N0:2中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:2中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸的 活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:2中所示氨基酸序列的蛋白質的對應的活性至 少一樣1? ;
[0035] (C)包含如SEQ ID N0:3中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:3中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸的 活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:3中所示氨基酸序列的蛋白質的對應的活性至 少一樣1? ;
[0036] (D)包含如SEQ ID N0:4中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:4中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸的 活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:4中所示氨基酸序列的蛋白質的對應的活性至 少一樣商；和
[0037] (E)包含如SEQ ID N0:16中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:16中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸 的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:16中所示氨基酸序列的蛋白質的對應的活性 至少一樣高。
[0038] SEQ ID NO: 1 顯不來自 Picrophilus torridus DSM 9790 的酶的氨基酸序列 (GenBank 登錄號 AAT43941 ;Swissprot/TrEMBL 登錄號 Q6KZB1)。
[0039] SEQ ID N0:2顯示來自嗜酸熱原體的酶（GenBank登錄號CACIM26 ;Swissprot/ TrEMBL登錄號Q9HIN1)的氨基酸序列。
[0040] SEQ ID N0:3顯示來自火山熱原體（Thermoplasma volcanium)的酶的氨基酸序列 (GenBank 登錄號 BAB59465 ;Swissprot/TrEMBL 登錄號 Q97BY2)。
[0041] SEQ ID N0:4 顯不來自 Ferroplasma acidarmanus ferl 的酶的氨基酸序列 (GenBank 登錄號 ZP_05571615)。
[0042] SEQ ID N0:16顯示SEQ ID N0:2中顯示的來自嗜酸熱原體的酶的氨基酸序列 (GenBank 登錄號 CAC12426 ;Swissprot/TrEMBL 登錄號 Q9HIN1)，其中 200 位的亮氨酸（Leu) 谷氨酸（Glu)取代。
[0043] 在根據本發明的方法的另外的優選的實施方案中，具有將甲羥戊酸3-磷酸轉化 為3-甲基丁 -3-烯-1-醇的活性的第二種酶（ii)選自由以下組成的組：
[0044] (a)包含如SEQ ID N0:5中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:5中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:5中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高；
[0045] (b)包含如SEQ ID N0:6中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:6中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:6中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高；
[0046] (c)包含如SEQ ID N0:7中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:7中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:7中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高；
[0047] (d)包含如SEQ ID N0:8中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:8中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:8中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高；
[0048] (e)包含如SEQ ID N0:9中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:9中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:9中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高；
[0049] (f)包含如SEQ ID N0:10中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:10中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:10中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高；
[0050] (g)包含如SEQ ID N0:11中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:11中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:11中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高；
[0051] (h)包含如SEQ ID N0:12中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:12中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:12中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高；
[0052] (i)包含如SEQ ID N0:13中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:13中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:13中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高；
[0053] (j)包含如SEQ ID N0:14中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:14中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁 -3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:14中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高；
[0054] (k)包含如SEQ ID N0:15中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:15中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:15中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高；
[0055] (1)包含如SEQ ID N0:17中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:17中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:17中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高；
[0056] (m)包含如SEQ ID N0:18中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:18中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:18中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高；
[0057] (η)包含如SEQ ID N0:19中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:19中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:19中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高；
[0058] (〇)包含如SEQ ID N0:20中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:20中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:20中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高；
[0059] (p)包含如SEQ ID N0:21中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:21中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:21中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高；和
[0060] (q)包含如SEQ ID N0:22中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:22中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:22中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高。
[0061] SEQ ID N0:5顯示了從格氏鏈球菌（Streptococcus gordonii)克隆的酶的氨基 酸序列。SEQ ID N0:6顯示了來自格氏鏈球菌Challis菌株CH1亞株的酶的氨基酸序列 (GenBank 登錄號 AAT43941 ;Swissprot/TrEMBL 登錄號 A8UU9)。SEQ ID N0:7 顯示了來自 嬰兒鏈球菌嬰兒亞種（Streptococcus infantarius subsp infantarius)ATCC BAA-102 的 酶的氨基酸序列（GenBank 登錄號 EDT48420. 1 ;Swissprot/TrEMBL 登錄號 B1SCG0)。SEQ ID N0:8顯不了盤基網柄菌（Dictyostelium discoideum)的氨基酸序列（GenBank登錄 號 EAL68476.1;Swissprot/TrEMBL 登錄號 Q54YQ9)。SEQ ID N0:9 顯示了來自德氏乳酸 桿菌（Lactobacillus delbrueckii)的酶的氨基酸序列（GenBank 登錄號 CAI97800.1; Swissprot/TrEMBL登錄號QlGAB2)。SEQIDN0:10顯示了來自緩癥鏈球菌（菌株B6)的酶 的氨基酸序列（GenBank登錄號CBJ22986. 1)。SEQ ID NO: 11顯示了來自解沒食子酸鏈球菌 (Streptococcus gallolyticus)UCN34 的酶的氨基酸序列（GenBank 登錄號 CBI13757. 1)。 SEQ ID N0:12顯不了來自血鏈球菌（Streptococcus sanguinis)SK36的酶的氨基酸序列 (GenBank登錄號ABN43791.DOSEQ ID N0:13顯示了來自鏈球菌屬物種M143的酶的氨基酸 序列（GenBank 登錄號 EFA24040.1)。SEQ ID NO: 14 顯不了來自豬鏈球菌（Streptococcus suis)89/1591 的酶的氨基酸序列（GenBank 登錄號 EEF63672.1)。SEQ ID N0:15 顯示了 來自唾液鏈球菌SK126 (streptococcus salivarius)的酶的氨基酸序列（GenBank登錄號 EEK09252)〇
[0062] SEQ ID N0:17顯不了馬氏甲燒八疊球菌（Methanosarcina mazei)的氨基酸序列 (GenBank 登錄號 AAM31457. 1 ;Swissprot/TrEMBL 登錄號 Q8PW40)。SEQ ID N0:18 顯示了 Sulfolobus tokodaii 的氨基酸序列（GenBank登錄號BAK54434. 1 ;Swissprot/TrEMBL登錄 號 F9VNS6)。SEQ ID NO: 19 顯不了肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumonia)的氨基酸序列 (GenBank 登錄號 EDT95457.1;Swissprot/TrEMBL 登錄號 B2DRT0)。SEQ ID N0:20 顯示了 Chloroflexus aggregans 的氨基酸序列（GenBank 登錄號 ACL26234. 1 ;Swissprot/TrEMBL 登錄號B8G8V9)。SEQIDN0:21顯不了氨基酸序列Natromonaspharaonis(GenBank登錄 號CAI48881.1 ;Swissprot/TrEMBL登錄號Q3ISK5)。SEQIDN0:22顯示了氨基酸序列釀酒 酵母（Saccharomyces cerevisiae) (GenBank 登錄號 CAA66158. 1 ;Swissprot/TrEMBL 登錄 號 P32377)。
[0063] 在根據本發明的方法的優選的實施方案中，第一種酶（i)如以上（E)中所定義并 且第二種酶（ii)如上述（a)或（b)中所定義，甚至更優選地第二種酶如上述（f)、（η)或 (q)中所定義。如實施例中所示出的，這些酶的組合特別有效率地生產根據本發明的3-甲 基丁 _3_烯-1-醇化合物。
[0064] 在根據本發明的方法的另一個優選的實施方案中，具有將甲羥戊酸3-磷酸轉化 為3-甲基丁-3-烯-1-醇的活性的第二種酶（ii)選自下表中列出的蛋白質中的任意一 種或選自包含與此類蛋白質的氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并顯示將甲羥戊酸 3_磷酸轉化為3-甲基丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與所述蛋白質的對應的活 性至少一樣高。
[0065] 表 1
[0066]
【權利要求】
1. 生產3-甲基丁 -3-烯-1-醇的方法，所述方法特征在于其包括通過 (i) 具有將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸的活性的第一種酶；和 (ii) 與第一種酶不同并且具有將所述甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基丁 -3-烯-1-醇 的活性的第二種酶 將甲羥戊酸轉化為3-甲基丁 -3-烯-1-醇。
2. 權利要求1的方法，其中 (i) 具有將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸的活性的第一種酶選自由以下組成的組： (A) 包含如SEQ ID NO: 1中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO: 1中所示氨 基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸的活性 的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID NO: 1中所示氨基酸序列的蛋白質的對應的活性至少一 樣1? ; (B) 包含如SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO:2中所示氨 基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸的活性 的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:2中所示氨基酸序列的蛋白質的對應的活性至少一 樣1? ; (C) 包含如SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO:3中所示氨 基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸的活性 的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:3中所示氨基酸序列的蛋白質的對應的活性至少一 樣1? ; (D) 包含如SEQ ID N0:4中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:4中所示氨 基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸的活性 的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:4中所示氨基酸序列的蛋白質的對應的活性至少一 樣1? ;和 (E) 包含如SEQ ID NO: 16中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO: 16中所示 氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸的活 性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID NO: 16中所示氨基酸序列的蛋白質的對應的活性至少 一樣高。
3. 權利要求1或2的方法，其中 (ii) 具有將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基丁 -3-烯-1-醇的活性的第二種酶選自由 以下組成的組： (a) 包含如SEQ ID N0:5中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:5中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:5中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (b) 包含如SEQ ID N0:6中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:6中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:6中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (c) 包含如SEQ ID N0:7中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:7中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:7中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (d) 包含如SEQ ID N0:8中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:8中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:8中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (e) 包含如SEQ ID N0:9中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:9中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:9中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (f) 包含如SEQ ID NO: 10中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO: 10中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁 -3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID NO: 10中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (g) 包含如SEQ ID NO: 11中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO: 11中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID NO: 11中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (h) 包含如SEQ ID NO: 12中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO: 12中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:12中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (i) 包含如SEQ ID NO: 13中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO: 13中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID NO: 13中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (j) 包含如SEQ ID NO: 14中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO: 14中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID NO: 14中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (k) 包含如SEQ ID NO: 15中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO: 15中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:15中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (l) 包含如SEQ ID NO: 17中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO: 17中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:17中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (m)包含如SEQ ID NO: 18中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO: 18中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁 -3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID NO: 18中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (η)包含如SEQ ID NO: 19中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO: 19中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID NO: 19中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (〇)包含如SEQ ID N0:20中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:20中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:20中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (P)包含如SEQ ID N0:21中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:21中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:21中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高；和 (q)包含如SEQ ID N0:22中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:22中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:22中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高。
4. 權利要求1至3中任一項的方法，所述方法特征在于轉化步驟是在體外，在無細胞系 統中實施的。
5. 權利要求1至3中任一項的方法，所述方法特征在于在存在生產如權利要求1的（i) 和（ii)中定義的所述酶的微生物的條件下實施方法。
6. 權利要求4的方法，所述方法由使用生產如權利要求1的（i)和（ii)中定義的所述 酶的多細胞生物表征。
7. 組合物，包含 (a) 甲羥戊酸；和 (b) 至少兩種酶，其中一種酶選自⑴并且另一種酶選自（ii)，其中⑴和（ii)如下： (i) 具有將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸的活性的第一種酶；和 (ii) 與第一種酶不同并且具有將所述甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基丁 -3-烯-1-醇 的活性的第二種酶。
8. 組合物，包含 (a) 甲羥戊酸；和 (b) 生產至少兩種酶的多細胞生物或微生物，其中一種酶選自（i)并且另一種酶選自 (ii)，其中⑴和（ii)如下： (i) 具有將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸的活性的第一種酶；和 (ii) 與第一種酶不同并且具有將所述甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基丁-3-烯-1-醇 的活性的第二種酶。
9. 至少兩種酶的組合的用途，其中一種酶選自以下的（i)并且另一種酶選自以下的 (ii)，或權利要求7或8的組合物的用途或如權利要求8中定義的微生物的用途，用于從甲 羥戊酸生產3-甲基丁 -3-烯-1-醇， 其中⑴和（ii)如下： (i) 具有將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸的活性的第一種酶；和 (ii) 與第一種酶不同并且具有將所述甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基丁-3-烯-1-醇 的活性的第二種酶。
10. 權利要求7或8的組合物或權利要求9的用途，其中 (i) 具有將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸的活性的第一種酶選自由以下組成的組 (A) 包含如SEQ ID NO: 1中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO: 1中所示氨 基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸的活性 的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID NO: 1中所示氨基酸序列的蛋白質的對應的活性至少一 樣1? ; (B) 包含如SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO:2中所示氨 基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸的活性 的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:2中所示氨基酸序列的蛋白質的對應的活性至少一 樣1? ; (C) 包含如SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO:3中所示氨 基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸的活性 的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:3中所示氨基酸序列的蛋白質的對應的活性至少一 樣1? ; (D) 包含如SEQ ID N0:4中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:4中所示氨 基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸的活性 的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:4中所示氨基酸序列的蛋白質的對應的活性至少一 樣1? ;和 (E) 包含如SEQ ID NO: 16中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO: 16中所示 氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸轉化為甲羥戊酸3-磷酸的活 性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID NO: 16中所示氨基酸序列的蛋白質的對應的活性至少 一樣高。
11. 權利要求7,8,或10的組合物或權利要求9或10的用途，其中 (ii) 具有將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基丁 -3-烯-1-醇的活性的第二種酶選自由 以下組成的組： (a) 包含如SEQ ID N0:5中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:5中所示 氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示與將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性具有SEQ ID N0:5中所示氨基酸序列的蛋白質 的對應的活性至少一樣高； (b) 包含如SEQ ID N0:6中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:6中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:6中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (C)包含如SEQ ID N0:7中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:7中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁 -3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (d) 包含如SEQ ID N0:8中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:8中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:8中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (e) 包含如SEQ ID N0:9中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:9中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:9中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (f) 包含如SEQ ID NO: 10中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO: 10中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁 -3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID NO: 10中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (g) 包含如SEQ ID NO: 11中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO: 11中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID NO: 11中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (h) 包含如SEQ ID NO: 12中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO: 12中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID NO: 12中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (i) 包含如SEQ ID NO: 13中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO: 13中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:13中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (j) 包含如SEQ ID NO: 14中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO: 14中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:14中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (k) 包含如SEQ ID NO: 15中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO: 15中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁 -3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID NO: 15中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (l) 包含如SEQ ID NO: 17中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO: 17中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:17中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (m)包含如SEQ ID NO: 18中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO: 18中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:18中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (η)包含如SEQ ID NO: 19中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID NO: 19中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID NO: 19中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (〇)包含如SEQ ID N0:20中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:20中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:20中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高； (P)包含如SEQ ID N0:21中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:21中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:21中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高；和 (q)包含如SEQ ID N0:22中所示氨基酸序列的蛋白質或包含與SEQ ID N0:22中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且顯示將甲羥戊酸3-磷酸轉化為3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白質，所述活性與具有SEQ ID N0:22中所示氨基酸序列的蛋白 質的對應的活性至少一樣高。
12. 生產3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法，所述方法包括通過使用酶將甲羥戊酸3-磷酸 酶促轉化為3-甲基丁-3-烯-1-醇的步驟，所述酶可以經由脫羧作用和脫磷酸作用催化轉 化。
13. 權利要求1至6中任一項的方法或權利要求12的方法，所述方法特征在于使用 ATP、dATP、ADP、AMP，非ATP的NTP或dNTP作為共底物實施方法。
14. 從甲羥戊酸生產異戊二烯的方法，所述方法包括權利要求1至6、12或13中任一項 的方法，并還包括將生產的3-甲基丁 -3-烯-1-醇轉化為異戊二烯的步驟。
15. 從甲羥戊酸生產異戊醇的方法，所述方法包括權利要求1至6、12或13中任一項的 方法，并還包括將生產的3-甲基丁 -3-烯-1-醇轉化為異戊醇的步驟。
【文檔編號】C12P5/00GK104245945SQ201380018861
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年4月4日 優先權日:2012年4月5日
【發明者】M·德勒庫特, M·阿尼斯莫瓦, P·馬利埃 申請人:環球生物能源, 財富科學家股份有限公司