工程菌及其在制備阿托伐他汀藥物中間體中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物制藥領域，尤其涉及一種工程菌及其在制備阿托伐他汀藥物中間 體中應用。
【背景技術】
[0002] 他汀類藥物是一類羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的競爭性抑制劑藥物， 是目前臨床上應用廣泛的降血脂藥物。HMG-CoA還原酶催化HMG-CoA還原成3-甲基-3， 5-二羥基戊酸的反應是膽固醇的生物合成途徑，他汀類藥物通過抑制HMG-CoA還原酶的 合成，可抑制體內膽固醇的合成，降低低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C)水平，對以膽固醇升 高為主的高血脂癥和冠心病有較好的療效。在結構上，他汀類藥物通常由憎水性的剛性 平面結構母核和具有雙手性中心的（3R，5S/R)_雙羥基己酸酯組成。其中，阿托伐他汀 (Atorvastatin)和瑞舒伐他汀（Rosuvastatin)是全新第三代、全合成、高純化、高選擇性 的HMG-CoA還原酶抑制劑，多年來占據降血脂藥物的主要市場份額。合成阿托伐他汀的關 鍵手性中間體是（3R，5R)-6-氰基-3, 5-二羥基己酸叔丁酯和（R)-6-氰基-5-羥基-3-羰 基己酸叔丁酯。（3R，5R) -6-氰基-3，5-二羥基己酸叔丁酯是一個擁有兩個手性中心的化合 物，可以通過（3R，5S)-6-氯_3,5,二羥基己酸叔丁酯脫鹵上氰基得到，（R)-6-氰基-5-羥 基-3-羰基己酸叔丁酯同樣也可以通過（S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的脫鹵上 氰基得到。因此，開展對鹵代醇脫鹵酶的脫鹵上氰基的作用的研宄，對兩種他汀類藥物的制 備均具有十分重要的作用。
[0003] 目前，報道的制備（3R，5R) -6-氰基-3，5-二羥基己酸叔丁酯的方法主要有兩種， 一種為化學酶法，即先采用鹵代醇脫鹵酶或者腈水解酶得到4-氰基-3-羥基丁酸乙酯，再 通過克萊森反應與醋酸叔丁酯縮合加長碳鏈來合成6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁 酯，最后通過羰基還原酶的作用得到6-氰基-3, 5-二羥基己酸叔丁酯。另一種是兩酶三 步法，有兩條路線，其一為以6-氯-3, 5-二羰基己酸叔丁酯為底物，通過一種羰基還原酶不 對稱還原作用直接生成（S) -6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯，再與NaCN作用生成6-氰 基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯，最后在羰基還原酶的作用下生成6-氰基-3, 5-二羥基己 酸叔丁酯；另一條同樣以6-氯-3, 5-二羰基己酸叔丁酯為底物，通過一種羰基還原酶不對 稱還原作用直接生成（S) -6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯，再在羰基還原酶的作用下生 成6-氯-3, 5-二羥基己酸叔丁酯，最后在鹵代醇脫鹵酶的作用下生成6-氰基-3, 5-二羥 基己酸叔丁酯。
[0004] 報道的制備（R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的方法主要有三種，兩種 為化學酶法，其中之一是由美國Codexis公司開發出來，采用兩步三酶[游離酶]全生物 催化法合成4-氰基-3-羥基丁酸乙酯，另外一種是腈水解酶的不對稱水解4-氰基-3-羥 基丁酸按得到4-氰基-3-羥基丁酸乙醋，由法國的Diversa Corporation研發，兩者再通 過克萊森反應與醋酸叔丁酯縮合加長碳鏈來合成（R) -6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁 酯，這過程中需要鋰催化劑和無水無氧反應，反應條件較為苛刻；另一種是一步化學法，以 (S) -6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯為底物，與NaCN在堿性條件下反應生成（R) -6-氰 基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯，但底物和產物在強堿性的反應條件下通常是不穩定的。 [0005] 酶法與化學法相比反應溫和，費用相對低，過程更綠色化，區域和立體選擇性好， 是優先選擇的路線，更值得深入研宄。
【主權項】
1. 一種工程菌，包括宿主細胞和轉入宿主細胞的目的基因，其特征在于，所述目的基因 為堿基序列如SEQ ID NO. 3所示的鹵代醇脫鹵酶基因。
2. 如權利要求1所述的工程菌在以（S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯為底物制 備（R) -6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯中的應用。
3. 如權利要求1所述的工程菌在以（3R，5S) -6-氯-3, 5-二羥基己酸叔丁酯為底物制 備（3R，5R) -6-氰基-3，5-二羥基己酸叔丁酯中的應用。
4. 一種制備方法，其特征在于，包括： (1) 制備包含堿基序列如SEQ ID No. 3所示的鹵代醇脫鹵酶基因的工程菌； (2) 制備所述工程菌的靜息細胞懸液； (3) 將靜息細胞懸液與底物、氰化物混合，反應制得產物； 所述底物為（S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯或（3R，5S)-6-氯-3, 5-二羥基己 酸叔丁酯；所述產物為（R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯或（3R，5R)-6-氰基-3， 5-二羥基己酸叔丁酯。
5. 如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述反應的溫度為18~40°C，反應液 的pH值為7.0~9.0。
6. 如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述靜息細胞懸液的制備方法包括：將 所述工程菌活化后，擴大培養至〇D_達到0. 6~1. 2,加入誘導劑，繼續培養，離心收集細 胞，用緩沖液重懸，獲得靜息細胞懸液。
7. 如權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述誘導劑為IPTG ;誘導劑的濃度為 0· 1 ~0· 5mM〇
8. 如權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述緩沖液為HEPES緩沖液。
9. 如權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述緩沖液在反應液中的濃度為1~ IOOmM0
10. 如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述氰化物為NaCN。
【專利摘要】本發明公開了一種工程菌及其在制備阿托伐他汀藥物中間體中應用，該工程菌包括宿主細胞和轉入宿主細胞的目的基因，所述目的基因為堿基序列如SEQ ID N 0.3所示的鹵代醇脫鹵酶基因。本發明將SEQ ID N 0.3所示的鹵代醇脫鹵酶基因導入宿主細胞構建的工程菌可表達鹵代醇脫鹵酶HheA，通過該酶的催化作用可實現將(S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯催化成(R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯和(3R，5S)-6-氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯催化成(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羥基己酸叔丁酯。該反應條件溫和，操作簡便，提高了產物的轉化率和純度。
【IPC分類】C12R1-19, C12P13-00, C12N15-70, C12N1-21
【公開號】CN104651290
【申請號】CN201510066577
【發明人】楊立榮, 王金玉, 陳少云, 吳堅平, 徐剛
【申請人】浙江大學
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2015年2月10日