具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽以及編碼其的多核苷酸的制作方法

具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽以及編碼其的多核苷酸的制作方法
【專利摘要】本發明涉及具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的分離的多肽，催化結構域，以及編碼這些多肽、催化結構域的多核苷酸。本發明還涉及包括這些多核苷酸的核酸構建體、載體以及宿主細胞連同生產和使用這些多肽或催化結構域的方法。
【專利說明】具有Ct -葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽以及編碼其的多核苷 酸
[0001] 序列表的引用
[0002] 本申請包括一個計算機可讀形式的序列表，將其通過引用結合在此。
[0003] 發明背景 發明領域
[0004] 本發明涉及具有α -葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽、催化結構域、結合結構域，以及 編碼這些多肽、催化結構域、或結合結構域的多核苷酸。本發明還涉及包括這些多核苷酸的 核酸構建體、載體、和宿主細胞，以及生產和使用這些多肽、催化結構域和結合結構域的方 法。
[0005] 本發明的另一個方面涉及具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽和具有葡萄糖醛 酸酯酶活性的多肽的組合作用。
[0006] 相關技術說明
[0007] 可以在水解和/或發酵之前對纖維素材料或包含木聚糖的材料進行預處理。優選 在水解前進行預處理。可替代地，可以同時用酶水解進行預處理，以釋放可發酵糖，例如葡 萄糖、木糖、和/或纖維二糖。在多數情況下，預處理步驟自身導致將生物質轉化為可發酵 糖（即使在沒有酶的情況下）。
[0008] 預處理的目的是提高生產速率連同水解步驟中釋放的糖的總產率。在化學預處理 (像例如酸預處理或堿預處理）的情況下，預處理的類型將對木質纖維素結構性組分具有 不同影響，并且因此取決于預處理方法，用于水解步驟的酶組合物可能不同。本方法的目標 是改善經預處理的包含木聚糖的材料的水解。
[0009] 本發明提供具有α -葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽和具有葡萄糖醛酸酯酶活性的 肽以及編碼這些多肽的多核苷酸。使用具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽以及具有 α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽和具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽的組合提供了用于改善 特別是包含木聚糖的材料的水解的方法。
[0010] 發明概述
[0011] 本發明涉及選自下組的具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的分離的多肽，該組由以下 各項組成：
[0012] (a) -種多肽，該多肽與SEQ ID Ν0:2的成熟多肽具有至少80%、至少85%、至少 90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少 98%、至少99%、或100%序列一致性；或
[0013] 與SEQ ID N0:4的成熟多肽具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%、或100%序列一致性；或
[0014] 與SEQ ID N0:6的成熟多肽具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%、或100%序列一致性；或
[0015] 與SEQ ID N0:8的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、 至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至 少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性；
[0016] (b)由一種多核苷酸編碼的一種多肽，該多核苷酸在高嚴謹度條件或非常高嚴謹 度條件下與（i)SEQ ID N0:1的成熟多肽編碼序列、（ii)其CDNA序列、或（iii) (i)或（ii) 的全長互補體雜交；或
[0017] 或在非常高嚴謹度條件下與（iv)SEQ ID N0:3的成熟多肽編碼序列、（V)其CDNA 序列、或（vi) (iv)或（V)的全長互補體雜交；
[0018] 或在非常高嚴謹度條件下與（vii)SEQ ID N0:5的成熟多肽編碼序列、（viii)其 cDNA序列、或（ix) (vii)或（viii)的全長互補體雜交；
[0019] 或在中嚴謹度條件、中-高嚴謹度條件、高嚴謹度條件、或非常高嚴謹度條件下， 與（x)SEQ ID N0:7的成熟多肽編碼序列、（xi)其cDNA序列、或（xii) (X)或（xi)的全長 互補體雜交；
[0020] (c)由一種多核苷酸所編碼的一種多肽，該多核苷酸與SEQ ID NO: 1的成熟多肽 編碼序列或其cDNA序列具有至少80%、至少85%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少 92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% 序列一致性；或
[0021] 與SEQ ID N0:3的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少90%、至少91%、 至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或 100 %序列一致性；或
[0022] 與SEQ ID N0:5的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少85%、至少90%、至 少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%或100%序列一致性；或
[0023] 與SEQ ID N0:7的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少80%、至少85%、至 少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性；
[0024] (d)SEQ ID NO:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6 或 SEQ ID N0:8 的成熟多肽的一種 變體，該變體在一個或多個位置處包括取代、缺失、和/或插入；以及
[0025] (e) (a)、(b)、（c)或（d)的多肽的一個片段，該片段具有α -葡糖醛酸糖苷酶活性。
[0026] 本發明還涉及編碼本發明的多肽的分離的多核苷酸；核酸構建體；重組表達載 體；包括這些多核苷酸的重組宿主細胞；以及產生這些多肽的方法。
[0027] 本發明還涉及編碼包括SEQ ID Ν0:4的氨基酸1至20或由其組成的信號肽的一種 多核苷酸、編碼包括SEQ ID Ν0:4的氨基酸21至696或由其組成的前肽的一種多核苷酸、 或編碼包括SEQ ID N0:4的氨基酸1至696或由其組成的信號肽和前肽的一種多核苷酸， 其每一者被可操作地連接至編碼一種蛋白質的基因；涉及核酸構建體、表達載體、以及包括 這些多核苷酸的重組宿主細胞；以及涉及產生一種蛋白質的方法。
[0028] 本發明還涉及選自下組的具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的分離的多肽，該組由以 下各項組成：
[0029] (a)與SEQ ID Ν0:6的成熟多肽具有至少92%序列一致性的一種多肽；
[0030] (b)由一種多核苷酸編碼的一種多肽，該多核苷酸在高或非常高嚴謹度條件下與 (i)SEQ ID N0:6的成熟多肽編碼序列、（ii)其cDNA序列、或（iii) (i)或（ii)的全長互補 體雜交；
[0031] (C)由與SEQ ID N0:6的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少92%序列一 致性的一種多核苷酸編碼的一種多肽；
[0032] (d) SEQ ID N0:6的成熟多肽的一種變體，該變體在一個或多個（例如若干個）位 置處包括取代、缺失、和/或插入；以及
[0033] (e) (a)、(b)、（c)或（d)的多肽的一個片段，該片段具有α -葡糖醛酸糖苷酶活性。
[0034] 本發明還涉及編碼一種信號肽的一種多核苷酸，該信號肽包括SEQ ID Ν0:2的氨 基酸1至22或SEQ ID NO:4的氨基酸1至20或SEQ ID NO:6的氨基酸1至15或SEQ ID NO:8的氨基酸1至27或由其組成。
[0035] 本發明還涉及抑制表達或者產生與序列SEQ ID:N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、 SEQ ID 勵:8中任一項具有至少68%，例如像70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或 100%序列一致性的一種或多種肽的方法。
[0036] 另外，本發明涉及一種用于降解或轉化纖維素材料的方法，包括：在具有α-葡糖 醛酸糖苷酶活性的多肽的存在下，用一種酶組合物處理該纖維素材料，該多肽與序列SEQ ID:N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID Ν0:8 中任一項具有至少 68%，例如像 70%、 75%、80%、85%、90%、95%、99% 或 100% 序列一致性。
[0037] 本發明還涉及包括選自下組的具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽的組合物，該 組由以下各項組成：
[0038] (a) -種多肽，該多肽與SEQ ID Ν0:2的成熟多肽具有至少80%、至少85%、至少 90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少 98%、至少99%、或100%序列一致性；或
[0039] 與SEQ ID N0:4的成熟多肽具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%、或100%序列一致性；或
[0040] 與SEQ ID N0:6的成熟多肽具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%、或100%序列一致性；或
[0041] 與SEQ ID N0:8的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、 至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至 少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性；
[0042] (b)由一種多核苷酸編碼的一種多肽，該多核苷酸在高嚴謹度條件或非常高嚴謹 度條件下與（i)SEQ ID N0:1的成熟多肽編碼序列、（ii)其cDNA序列、或（iii) (i)或（ii) 的全長互補體雜交；或
[0043] 或在非常高嚴謹度條件下與（iv)SEQ ID N0:3的成熟多肽編碼序列、（v)其cDNA 序列、或（vi) (iv)或（V)的全長互補體雜交；
[0044] 或在非常高嚴謹度條件下與（vii)SEQ ID N0:5的成熟多肽編碼序列、（viii)其 cDNA序列、或（ix) (vii)或（viii)的全長互補體雜交；
[0045] 或在中嚴謹度條件、中-高嚴謹度條件、高嚴謹度條件、或非常高嚴謹度條件下， 與（x)SEQ ID N0:7的成熟多肽編碼序列、（xi)其cDNA序列、或（xii) (X)或（xi)的全長 互補體雜交；
[0046] (c)由一種多核苷酸所編碼的一種多肽，該多核苷酸與SEQ ID NO: 1的成熟多肽 編碼序列或其cDNA序列具有至少80%、至少85%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少 92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% 序列一致性；或
[0047] 與SEQ ID N0:3的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少90%、至少91%、 至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或 100 %序列一致性；或
[0048] 與SEQ ID N0:5的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少85%、至少90%、至 少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%或100%序列一致性；或
[0049] 與SEQ ID N0:7的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少80%、至少85%、至 少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性；
[0050] (d)SEQ ID NO:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6 或 SEQ ID N0:8 的成熟多肽的一種 變體，該變體在一個或多個位置處包括取代、缺失、和/或插入；以及
[0051] (e)具有α -葡糖醛酸糖苷酶活性的（a)、（b)、（c)或（d)的多肽的一個片段；和 /或具有葡萄糖醛酸酯酶活性的選自下組的一種多肽，該組由以下各項組成：
[0052] (f) -種多肽，該多肽與SEQ ID N0:10的成熟多肽具有至少80%、至少85%、至 少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少 98%、至少99%、或100%序列一致性；或
[0053] 與SEQ ID N0:12的成熟多肽具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至 少99%、或100%序列一致性；或
[0054] 與SEQ ID N0:14的成熟多肽具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至 少99%、或100%序列一致性；或
[0055] (g)由一種多核苷酸編碼的一種多肽，該多核苷酸在高嚴謹度條件或非常高嚴謹 度條件下與（i)SEQ ID N0:9的成熟多肽編碼序列、（ii)其cDNA序列、或（iii) (i)或（ii) 的全長互補體雜交；或
[0056] 或在非常高嚴謹度條件下與（iv) SEQ ID N0:11的成熟多肽編碼序列、（v)其cDNA 序列、或（vi) (iv)或（v)的全長互補體雜交；
[0057] 或在非常高嚴謹度條件下與（vii)SEQ ID N0:13的成熟多肽編碼序列、（viii)其 cDNA序列、或（ix) (vii)或（viii)的全長互補體雜交；
[0058] (h)由一種多核苷酸所編碼的一種多肽，該多核苷酸與SEQ ID N0:9的成熟多肽 編碼序列或其cDNA序列具有至少80%、至少85%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少 92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% 序列一致性；或
[0059] 與SEQ ID N0:11的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少90%、至少91%、 至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或 100 %序列一致性；或
[0060] 與SEQ ID N0:13的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少85%、至少90%、 至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至 少99%或100%序列一致性；
[0061] (i)SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:12 或 SEQ ID N0:14 的成熟多肽的一種變體，該變 體在一個或多個位置處包括取代、缺失、和/或插入；以及
[0062] (j) (f)、（g)、（h)或（i)的多肽的一個片段，該片段具有葡萄糖醛酸酯酶活性。
[0063] 附圖簡要說明
[0064] 圖1顯示在β -葡聚糖酶和β -木糖苷酶的酶促背景上添加四種α -葡糖醛酸糖 苷酶之后對經預處理的玉米纖維的轉化百分率的影響的比較研究。樣品1:黑曲霉（SEQ ID N0:4);樣品 2 :構巢裸殼孢菌（SEQ ID N0:2);樣品 3 :黃灰青霉（P. aurantiogriseum) (SEQ ID N0:6);樣品 4 :約氏黃桿菌（F. johnsoniae) (SEQ ID N0:8)。
[0065] 圖2顯示在β -葡聚糖酶和β -木糖苷酶的酶促背景上添加四種α -葡糖醛酸糖 苷酶之后對葡糖醛酸（g/kg DM)的釋放的影響的比較研究。樣品：樣品1 :黑曲霉（SEQ ID N0:4);樣品 2 :構巢裸殼孢菌（SEQ ID N0:2);樣品 3 :黃灰青霉（P. aurantiogriseum) (SEQ ID NO:6);樣品 4 :約氏黃桿菌（F. johnsoniae) (SEQ ID NO:8)。
[0066] 圖3顯示對具有α -葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽和具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多 肽的組合影響的研究。樣品：樣品1 :黑曲霉（SEQ ID Ν0:4);樣品2 :構巢裸殼孢菌（SEQ ID Ν0:2);樣品 3:黃灰青霉（P. aurantiogriseum) (SEQ ID Ν0:6);樣品 4:約氏黃桿菌 (F. johnsoniae) (SEQ ID Ν0:8);樣品 Α，一色齒毛菌（C. unicolor) (SEQ ID Ν0:10);樣品 B，里氏木霉（SEQ ID NO: 12);樣品C，球毛殼菌（SEQ ID NO: 14)。
[0067] 定義
[0068] 纖維素分解活性術語"纖維素分解活性"意指水解一種纖維素材料的生物 活性。用于測量纖維素分解活性的兩種基本方法包括：（1)測量總纖維素分解活性， 以及（2)測量個體纖維素分解活性（葡聚糖內切酶、纖維二糖水解酶、和β-葡糖苷 酶），如在張（Zhang)等人，對纖維素酶改進的展望：篩選和選擇策略（Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies), 2006,生物技術進展 (Biotechnology Advances) 24:452-481中綜述。通常使用不溶性底物對總纖維素分解活 性進行測定，包括沃特曼一號（Whatman Ml)濾紙、微晶纖維素、細菌纖維素、藻類纖維素、 棉花、經過預處理的木質纖維素等。最常用的總纖維素分解活性測定法是使用沃特曼一 號濾紙作為底物的濾紙測定法。該測定是由國際純粹與應用化學聯合會（IUPAC)(高斯 (Ghose)，1987,纖維素酶活性的測量（Measurement of cellulase activities)，純粹與應 用化學（Pure Appl.Chem. )59:257-68)確立的。
[0069] 出于本發明的目的，通過測量在以下條件下由一種或多種纖維素分解酶進行的纖 維素材料水解的增加來測定纖維素分解酶活性：l_2〇mg的纖維素分解蛋白/g于PCS中的 纖維素，在50°C -65°C下持續3-7天，與未添加纖維素分解蛋白的對照水解相比較。典型 條件為：1ml反應，洗滌或未洗滌的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸鈉 （pH 5)，lmM MnS04， 50°C _65°C，72小時，通過AMINEX? HPX-87H柱（伯樂實驗室有限公司，美國加州赫拉克 勒斯）進行的糖分析。
[0070] 內切葡聚糖酶：術語"內切葡聚糖酶"意指一種內切-1，4-(1，3 ;1，4)_ β -D-葡聚 糖4-葡聚糖水解酶（E. C. 3. 2. 1. 4)，其催化纖維素、纖維素衍生物（如羧甲基纖維素和羥 乙基纖維素）、地衣多糖中的l，4-i3-D-糖苷鍵和混合β-1，3葡聚糖如谷類β-D-葡聚 糖或木葡聚糖以及含有纖維素組分的其他植物材料中的β_1，4鍵的內切水解。可以通過 測量底物粘度的減小，或通過還原糖測定確定還原端增加來確定內切葡聚糖酶活性（張等 人，2006,生物技術進展24:452-481)。出于本發明的目的，根據高斯，1987,純粹與應用化 學59:257-268的程序，在 PH 5、40°C下，使用羧甲基纖維素（CMC)作為底物，確定內切葡聚 糖酶活性。
[0071] 纖維二糖水解酶：術語"纖維二糖水解酶"是指一種l，4-i3_D-葡聚糖纖維二 糖水解酶（E.C. 3. 2. 1.91)，其催化纖維素、纖維寡糖、或任何含β-1，4-連接的葡萄糖 的聚合物中的l，4-i3-D-糖苷鍵水解，從該鏈的還原端或非還原端釋放纖維二糖（泰里 (Teeri)，1997,晶態纖維素降解：纖維二糖水解酶功能的新見解（Crystalline cellulose degradation:New insight into the function of cellobiohydrolases),生物技術趨 勢（Trends in Biotechnology) 15:160-167 ;泰里（Teeri)等人，1998,里氏木霉纖維二糖 水解酶：為何對晶態纖維素如此有效？（Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose ?)，生物化學學會學報（Biochem. Soc. Trans.)26:173-1780。出于本發明的目的，根據范·帝伯赫（van Tilbeurgh)等人，1982， 歐洲生化學會聯合會快報（FEBS Letters) ,149:152-156以及范?帝伯赫和克萊森斯 (Claeyssens)，1985,歐洲生化學會聯合會快報，187:283-288所述的程序，使用一種熒光二 糖衍生物4-甲基傘形酮基-β -D-乳糖在pH 5、40°C下確定纖維二糖水解酶活性。
[0072] β -葡糖苷酶：術語" β -葡糖苷酶"意指一種β -D-葡糖苷葡糖水解酶 (E. C. 3. 2. 1. 21)，其催化末端非還原性β -D-葡萄糖殘基的水解，并釋放β -D-葡萄糖。 出于本發明的目的，根據文丘里（Venturi)等人，2002,來自嗜熱毛殼菌嗜糞變種的胞外 β-D-葡糖苷酶：產生、純化以及一些生物化學特性（Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum:production, purification and some biochemical properties),基礎微生物學雜志（J. Basic Microbiol. )42:55-66 描述的基 本程序確定β-葡糖苷酶活性。一個單位的β-葡糖苷酶定義為在40°C、pH 5下，在含有 0. 01%TWEEN? 20的lOOmM檸檬酸鈉中從作為底物的ImM對硝基苯基-β -D-吡喃葡萄 糖苷每分鐘產生1. 〇微摩爾的對硝基苯酚。
[0073] 纖維素分解增強活性：術語"纖維素分解增強活性"意指由一種GH61多肽催化的 生物活性，該GH61多肽增強具有纖維素分解活性的酶對纖維素材料的水解。出于本發明 的目的，通過在以下條件下測量來自由纖維素分解酶水解纖維素材料的還原糖的增加或纖 維二糖與葡萄糖總量的增加來測定纖維素分解增強活性 ：l_5〇mg總蛋白/g于PCS中的纖 維素，其中總蛋白由50% -99. 5% w/w纖維素分解蛋白和0. 5% -50% w/w具有纖維素分 解增強活性的GH61多肽的蛋白構成，在50°C _65°C持續1-7天，與不具有纖維素分解增強 活性的相等總蛋白裝載的對照水解（l-50mg纖維素分解蛋白/g于PCS中的纖維素）相比 較。在一個優選方面，使用在總蛋白質重量的3%的米曲霉（Aspergillus oryzae) β -葡糖 苷酶（根據W0 02/095014在米曲霉中重組產生）或總蛋白質重量的3%的煙曲霉β-葡 糖苷酶（如W0 2002/095014中所描述在米曲霉中重組產生）的纖維素酶蛋白負載量存 在的情況下（TU丄LK'LAST⑧1. 5L(諾維信公司（Novozymes A/S)，丹麥巴格斯瓦爾德 (Bagsvaerd, Denmark))的混合物作為纖維素分解活性的來源。
[0074] 具有纖維素分解增強活性的GH61多肽通過將達到相同的水解程度所需要的纖維 素分解酶的量降低優選至少1. 01倍、更優選至少1. 05倍、更優選至少1. 10倍、更優選至少 1. 25倍、更優選至少1. 5倍、更優選至少2倍、更優選至少3倍、更優選至少4倍、更優選至 少5倍、甚至更優選至少10倍、以及最優選至少20倍，來增強由具有纖維素分解活性的酶 催化的纖維素材料的水解。
[0075] 家族61糖苷水解酶：術語"家族61糖苷水解酶"或"家族GH61"或"GH61" 意指根據亨利薩特（Henrissat) B.，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分 類(A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities)，生物化學雜志（Biochem.J. )280:309-316 ;和亨利薩特B.和貝洛赫 (Bairoch)A.，1996,修正糖基水解酶的基于序列的分類（Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases)，生物化學雜志 316:695-696 屬于糖苷水解酶家 族61的多肽。
[0076] 木聚糖降解活性：術語"木聚糖降解活性"或"木聚糖分解活性"意指水解含有木 聚糖的材料的生物活性。用于測量木聚糖分解活性的兩種基本方法包括：（1)測量總木聚 糖分解活性，并且（2)測量單獨的木聚糖分解活性（內切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯 呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、以及α-葡萄糖醛酸酯 酶）。木聚糖分解酶測定的最近進展總結于若干出版物中，這些出版物包括：別雷（Biely) 和普喬爾德（Puchard)，木聚糖分解酶測定的最近進展（Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes)，2006,食品與農業科學雜志（Journal of the Science of Food and Agriculture)86(ll) :1636-1647 ;斯帕尼科瓦（Spanikova)和別雷，2006,葡萄糖醒 酸酯酶_由產生的新型碳水化合物酯酶裂裙菌（Schizophyllum commune) (Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune),歐洲 生化學會聯合會快報580 (19) :4597-4601 ;赫爾曼（Herrmann)、沃散斯卡（Vrsanska)、尤 日奇科娃（Jurickova)、赫西（Hirsch)、另ij雷、以及庫比切克（Kubicek)，1997,里氏木霉 的β-D-木糖苷酶是一種多功能β-D-木聚糖木糖水解酶（The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylan xylohydrolase),生物化學雜 志 321:375-381。
[0077] 總木聚糖降解活性可以通過測定由不同類型的木聚糖（包括例如燕麥（oat spelt)木聚糖、山毛櫸木木聚糖、以及落葉松木木聚糖）形成的還原糖，或通過光度法 測定從不同共價染色的木聚糖釋放的染色的木聚糖片段來測量。最常見的總木聚糖 分解活性測定基于由聚合4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖產生的還原糖，如描述于別雷，別 雷，Poutanen(坡泰恩），1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity(用于木聚糖酶活性測定的多個實驗室測試方法），Journal of Biotechnology (生物技術雜志）23 (3) : 257-270 中。
[0078] 出于本發明的目的，通過測量在以下典型條件下由一種或多種木聚糖降解酶引 起的樺木木聚糖（西格瑪化學有限公司（Sigma Chemical Co.，Inc.)，美國密蘇里州圣 路易斯（St. Louis，M0, USA))水解的增加來確定木聚糖降解活性：1ml反應、5mg/ml底物 (總固體）、5mg木聚糖分解蛋白/g底物、50mM乙酸鈉 （pH 5)、50°C、24小時，使用如里弗 (Lever) ,1972,用于碳水化合物的比色測定的新反應（A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates)，分析生物化學47:273-279所描述的對輕基苯甲酸醜 肼（PHBAH)測定進行糖分析。
[0079] 木聚糖酶：術語"木聚糖酶"意指1，4- β -D-木聚糖-木糖水解酶（E. C. 3. 2. 1. 8)， 其催化木聚糖中的1，4-β -D-木糖苷鍵的內切水解。為了本發明的目的，使用樺木木聚糖 作為底物確定木聚糖酶活性。一個單位的木聚糖酶定義為在50°C、pH 5下的初始期水解 中，在含有0. 01% Τ\νΠΠΝα( 20的50mM乙酸鈉中從作為底物的2g樺木木聚糖每公升每 分鐘產生1.〇μ摩爾還原糖（以如里弗（LeVer)，1972,用于碳水化合物的比色測定的新反 M (A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates),分析生物化 學（Anal. Biochem) 47:273-279所述的葡萄糖當量測量）。
[0080] β -木糖苷酶：術語"β -木糖苷酶"意指一種β-D-木糖苷木糖水解酶 (E. C. 3. 2. 1. 37)，其催化短β (1 - 4)-木寡糖的外水解，以從非還原性末端去除連續的 D-木糖殘基。出于本發明的目的，一個單位的β-木糖苷酶定義為在40°C、pH 5下在含有 0. 01%TWEEN? 20的100mM檸檬酸鈉中從作為底物的ImM對硝基苯基-β -D-木糖苷每 分鐘產生1. 0微摩爾的對硝基苯酚。
[0081] 乙酰木聚糖酯酶：術語"乙酰木聚糖酯酶"的意思是一種羧酸酯酶（EC 3. 1. 1.72)，其催化乙酰基自聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、α-萘基乙酸酯、和對 硝基苯基乙酸酯的水解。為了本發明的目的，用0. 5mM對硝基苯基乙酸酯作為底物，在含有 0. 01%TWEEN?20的50mM乙酸鈉（pH5. 0)中，對乙酰木聚糖酯酶的活性進行測定。一個單 位的乙酰木聚糖酯酶被定義為，在pH 5, 25°C，每分鐘能夠釋放1 μ mol對硝基酚根陰離子 的酶的量。
[0082] 阿魏酸酯酶：術語"阿魏酸酯酶"意指4-羥基-3-甲氧基肉桂酰基-糖水解酶（EC 3. 1.1. 73)，其催化4-羥基-3-甲氧基肉桂酰基（阿魏酰基）基團從酯化的糖（其在"天 然"底物中通常為阿拉伯糖）的水解，以產生阿魏酸酯（4-羥基-3-甲氧基肉桂酸酯）。阿 魏酸酯酶（Feruloyl esterase)也被稱為阿魏酸酯酶（ferulic acid esterase)、輕基肉 桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I、或FAE-II。為了本發明的目 的，使用〇. 5mM對硝基苯阿魏酸酯作為底物在50mM乙酸鈉中在pH 5. 0對阿魏酰酯酶的活 性進行測定。一個單位的阿魏酸酯酶等于，在pH 5, 25°C，每分鐘能夠釋放1 μ mol的對硝基 酚根陰離子的酶的量。
[0083] α-葡糖醛酸糖苷酶：術語"α-葡糖醛酸糖苷酶"是指可催化α-D-葡萄 糖苷酸水解成為D-葡萄糖醛酸酯和醇的一種α-D-葡萄糖苷酸葡萄糖醛酸水解酶 (EC 3. 2. 1. 139)。出于本發明的目的，根據德弗里斯（de Vries)，1998,細菌學雜志 (J.Bacteriol. ) 180:243-249來測定α-葡糖醛酸糖苷酶活性。一個單位的α-葡糖醛酸 糖苷酶等于能夠在pH 5、40°C下每分鐘釋放1微摩爾的葡糖醛酸或4-0-甲基葡糖醛酸的酶 的量。
[0084] 本發明的這些α-葡糖醛酸糖苷酶具有SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6 或SEQ ID N0:8的成熟多肽的a-葡糖醛酸糖苷酶活性的至少60%，例如至少70%、至少 80%、至少90%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少 98%、至少99%或至少100%。
[0085] a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶：術語" a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶"意指一種a -L-阿拉 伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶（EC 3. 2. 1. 55)，其催化a -L-阿拉伯糖苷中的末端非還原 性α-L-阿拉伯呋喃糖苷殘基的水解。該酶對α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有（1，3)_和/或 (1，5)_鍵的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿 拉伯呋喃糖苷酶還被稱為阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿 拉伯呋喃糖苷酶、多糖a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶、a -L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯 糖苷酶、或α-L-阿拉伯聚糖酶。出于本發明的目的，使用每ml的lOOmM乙酸鈉 （pH 5) 中5mg的中等粘度小麥阿拉伯糖基木聚糖（麥格酶國際愛爾蘭股份有限公司（Megazyme International Ireland, Ltd.)，愛爾蘭威克洛郡布瑞公司（Bray, Co. Wicklow, Ireland)以 總體積200 μ 1在40°C下持續30分鐘，接著通過AMINEX? HPX-87H柱色譜（伯樂實驗 室有限公司（Bio-Rad Laboratories, Inc.)，美國加州赫拉克勒斯（Hercules, CA, USA)進 行阿拉伯糖分析來測定a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。
[0086] 纖維素材料：該纖維素材料可以是包括纖維素的任何材料。生物質的初生細胞壁 中的主要多糖是纖維素，第二豐富的是半纖維素，而第三豐富的是果膠。細胞停止生長后產 生的次生細胞壁也包含多糖，并且它通過與半纖維素共價交聯的聚合木質素得到強化。纖 維素是脫水纖維二糖的均聚物，因此是一種線性i3-(l-4)_D-葡聚糖，而半纖維素包括多 種化合物，如具有一系列取代基以復雜支鏈結構存在的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯糖基木聚 糖、以及甘露聚糖。盡管纖維素一般為多態的，但發現其在植物組織中主要以平行葡聚糖鏈 的不溶性晶體基質存在。半纖維素通常氫鍵合至纖維素以及其他半纖維素，這有助于穩定 細胞壁基質。
[0087] 纖維素通常見于例如植物的莖、葉、殼、皮、以及穗軸，或樹的葉、枝、以及木材中。 纖維素材料可以是，但不限于：草本材料、農業殘余物、林業殘余物、城市固體廢物、廢紙、以 及紙漿和造紙廠殘余物（參見，例如，維色洛戈爾（Wiselogel)等人，1995,于生物乙醇手 冊（Handbook on Bioethanol)(查爾斯· E ·懷曼（Charles E. Wyman)編輯），第 105-118 頁，泰勒弗朗西斯出版集團（Taylor&Francis)，華盛頓特區（Washington D.C.);懷曼 (Wyman)，1994,生物資源技術（Bioresource Technology)50:3_16;林德（Lynd)，1990,應 用生物化學與生物技術（Applied Biochemistry and Biotechnology)24/25:695_719; 莫思爾（Mosier)等人，1999,木質纖維素的生物轉化的最近進展（Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics)，生物化學工程 / 生物技術的進展（Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology)，T·謝伯（T.Scheper)主編，第 65 卷，第 23-40 頁，紐約斯普林格出版社（Springer-Verlag，New York)。在此應該理解的是，纖維素可以處 于木素纖維素，在混合基質中包含木質素、纖維素、和半纖維素的植物細胞壁材料的形式。 在一個優選方面，該纖維素材料是木質纖維素。
[0088] 在一個方面，纖維素材料是草本材料。在另一個方面，纖維素材料是農業殘余物。 在另一個方面，纖維素材料是林業殘余物。在另一個方面中，該纖維素材料是城市固體廢 物。在另一個方面中，纖維素材料是廢紙。在另一個方面中，纖維素材料是紙漿和造紙廠殘 余物。
[0089] 在另一個方面中，纖維素材料是玉米秸桿。在另一個方面中，纖維素材料是玉米纖 維。在另一個方面中，纖維素材料是玉米芯。在另一個方面中，纖維素材料是橘皮。在另一 個方面中，纖維素材料是稻草。在另一個方面中，纖維素材料是小麥桿。在另一個方面，纖 維素材料是柳枝稷。在另一個方面中，纖維素材料是芒草。在另一個方面中，纖維素材料是 甘蔗渣。
[0090] 在另一個方面中，纖維素材料是微晶纖維素。在另一個方面中，纖維素材料是細菌 纖維素。在另一個方面中，纖維素材料是海藻纖維素。在另一個方面中，纖維素材料是棉短 絨。在另一個方面，纖維素材料是無定形磷酸處理的纖維素。在另一個方面中，纖維素材料 是濾紙。
[0091] 纖維素材料可以按原樣使用或可以使用本領域已知的常規方法進行預處理，如在 此所描述。在一個優選方面，纖維素材料進行了預處理。
[0092] 預處理的玉米秸桿：術語"PCS"或"預處理的玉米秸桿"是指通過用熱和稀硫酸處 理源自玉米秸桿的纖維素材料。
[0093] 含有木聚糖的材料：術語"含有木聚糖的材料"意指包含含有β -(1-4)連接的木 糖殘基主鏈的植物細胞壁多糖的任何材料。陸生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-D-吡喃木 糖主鏈的雜聚物，其通過短的碳水化合物鏈分支。它們包括D-葡糖醛酸或其4-0-甲基醚、 L-阿拉伯糖、和/或不同的低聚糖，這些低聚糖由D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖、以 及D-葡萄糖構成。可以將木聚糖類型的多糖分成同源木聚糖（homoxylan)和異源木聚糖 (heteroxylan)，包括葡糖醛酸木聚糖、（阿拉伯糖）葡糖醛酸木聚糖、（葡糖醛酸）阿糖基 木聚糖、阿糖基木聚糖、以及復雜的異源木聚糖。參見，例如，埃伯林格羅瓦（Ebringerova) 等人，2005,聚合物科學進展（Adv. Polym. Sci.) 186:1-67。
[0094] 在本發明的方法中，可以使用含有木聚糖的任何材料。在一個優選方面，含有木聚 糖的材料是木質纖維素。
[0095] 等位基因變體：術語"等位基因變體"意指占用同一染色體位點的一種基因的兩個 或更多個替代形式中的任一者。等位基因變異由突變天然產生，并且可以導致群體內的多 態性。基因突變可以是靜默的（在所編碼的多肽中沒有改變）或可編碼具有改變的氨基酸 序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。
[0096] 結合結構域：術語"結合結構域"例如"纖維素結合結構域"是指介導酶結合至纖 維素底物的非晶區域的酶的區域。纖維素結合結構域（CBD)典型地發現于α-葡糖醛酸糖 苷酶的Ν末端或C末端末尾。
[0097] 催化結構域：術語"催化結構域"意指一種酶的含有該酶的催化機構的區域。
[0098] cDNA:術語"cDNA"是指可以通過得自真核或原核細胞的成熟的、剪接的mRNA分子 的反轉錄而制備的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于對應基因組DNA中的內含子序列。早先 的初始RNA轉錄本是mRNA的前體，其在呈現為成熟的剪接的mRNA之前要經一系列的步驟 進行加工，包括剪接。
[0099] 編碼序列：術語"編碼序列"意指直接指定一個多肽的氨基酸序列的多核苷酸。編 碼序列的邊界一般由一個開放閱讀框架決定，該開放閱讀框架從一個起始密碼子（如ATG、 GTG或TTG)開始并且以一個終止密碼子（如TAA、TAG或TGA)結束。編碼序列可以是一種 基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。
[0100] 控制序列：術語"控制序列"是指表達編碼本發明的成熟多肽的多核苷酸所必需的 核酸序列。每個控制序列對于編碼該多肽的多核苷酸來說可以是原生的（即，來自相同基 因）或外源的（即，來自不同基因），或相對于彼此是原生的或外源的。此類控制序列包括 但不限于前導子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列、以及轉錄終止子。至少， 控制序列包括啟動子，以及轉錄和翻譯終止信號。出于引入有利于將這些控制序列與編碼 一種多肽的多核苷酸的編碼區連接的特異性限制酶切位點的目的，這些控制序列可以提供 有多個接頭。
[0101] 表達：術語"表達"包括涉及多肽產生的任何步驟，包括但不限于：轉錄、轉錄后修 飾、翻譯、翻譯后修飾、以及分泌。
[0102] 表達載體：術語"表達載體"意指一種直鏈或環狀DNA分子，該分子包括編碼一種 多肽的一種多核苷酸并且可操作地連接至提供用于其表達的控制序列。
[0103] 片段：術語"片段"是指從成熟多肽或結構域的氨基和/或羧基末端刪除一個或多 個（例如，若干個）氨基酸的一種多肽或一個催化或纖維素結合結構域；其中該片段具有 α-葡糖醛酸糖苷酶或纖維素結合活性。在一個方面，一個片段包括SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6或SEQ ID N0:8的成熟多肽的氨基酸數目的至少85%、90%、以及95%。
[0104] 宿主細胞：術語"宿主細胞"意指易于用包括本發明的一種多核苷酸的一種核酸構 建體或表達載體進行轉化、轉染、轉導等的任何細胞類型。術語"宿主細胞"涵蓋由于復制 期間發生的突變而與親本細胞不同的親本細胞的任何后代。
[0105] 分離的或純化的：術語"分離的"或"純化的"意指從其中去除與其天然相關的至少 一種組分的多肽或多核苷酸。例如，如通過SDS-PAGE確定的，多肽可以是至少1 %純，例如 至少5 %純、至少10 %純、至少20 %純、至少40 %純、至少60 %純、至少80 %純、至少90 %純 或至少95%純，并且如通過瓊脂糖電泳確定的，多核苷酸可以是至少1%純，例如至少5% 純、至少10 %純、至少20 %純、至少40 %純、至少60 %純、至少80 %純、至少90 %純、或至少 95 %純。
[0106] 成熟多肽：術語"成熟多肽"意指在翻譯和任何翻譯后修飾（例如N-端加工、C-端 截短、糖基化、磷酸化等）之后處于其最終形式的多肽。在一個方面，如使用預測SEQ ID NO:2的氨基酸1至22、SEQ ID NO:4的氨基酸1至20、SEQ ID NO:4的氨基酸21至690、 SEQ ID N0:6的氨基酸1至15、SEQ ID N0:8的氨基酸1至27是信號肽的信號P(SignalP) (尼爾森（Nielsen)等人，1997,蛋白質工程（Protein Engineering) 10:1-6)預測的，該成 熟多肽是SEQIDN0:2的氨基酸1至 702、SEQIDN0:4的氨基酸1至696、SEQIDN0:6的 氨基酸1至690、SEQ ID N0:8的氨基酸1至708。本領域中已知的是，一個宿主細胞可以產 生由同一多核苷酸表達的兩種或更多種不同成熟多肽（即，具有不同C-末端和/或N-末 端氨基酸）的混合物。
[0107] 成熟多肽編碼序列：術語"成熟多肽編碼序列"意指編碼具有α -葡糖醛酸糖苷 酶活性的一種成熟多肽的一種多核苷酸。在一個方面，基于預測SEQ ID NO: 1的核苷酸1 至66、SEQ ID N0:3的核苷酸1至60、SEQ ID N0:5的核苷酸1至45和SEQ ID N0:7的核 苷酸1至81編碼信號肽的信號P (SignalP)程序（尼爾森等人，1997,同上），該成熟多肽編 碼序列是SEQ ID NO: 1的核苷酸1至2544、SEQ ID N0:3的核苷酸1至2526、SEQ ID N0:5 的核苷酸1至2508、SEQ ID NO: 7的核苷酸1至2124或其cDNA序列。
[0108] 核酸構建體：術語"核酸構建體"意指單鏈或雙鏈核酸分子，其分離自天然存在的 基因，或其被修飾成以本來在自然界中不存在的方式含有核酸的區段，或其為合成的，其包 括一個或多個控制序列。
[0109] 可操作地連接：術語"可操作地連接"意指一種配置，其中一個控制序列相對于一 種多核苷酸的編碼序列放置在一個適當位置處，以使得控制序列指引編碼序列的表達。 [0110] 序列一致性：兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性由參數"序列 一致性"描述。
[0111] 出于本發明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :歐洲分子生物學開放軟件套件 (The European Molecular Biology Open Software Suite)，賴斯（Rice)等人，2000,遺傳 學趨勢（Trends Genet.) 16:276-277)(優選5. 0. 0版或更新版本）的Needle程序中所實 施的尼德爾曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（尼德爾曼和翁施，1970,分子生物學雜志 (J. Mol. Biol. )48:443-453)來測定兩個氨基酸序列之間的序列一致性。使用的這些參數 是空位開放罰分10、空位延伸罰分0. 5,以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩 陣。尼德爾標注的"最長的一致性"的輸出（使用-非簡化選項獲得）被用作百分比一致 性，并且如下計算：
[0112] (一致的殘基X100V(比對長度-比對中的空位總數）
[0113] 出于本發明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :歐洲分子生物學開放軟件套 件，賴斯等人，2000,同上）（優選5. 0. 0版或更新版本）的Needle程序中所實施的尼德爾 曼-翁施算法（尼德爾曼和翁施，1970,同上）來測定兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的序 列一致性。使用的這些參數是空位開放罰分10、空位延伸罰分0. 5以及EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本）取代矩陣。尼德爾標注的"最長的一致性"的輸出（使用-非簡化 選項獲得）被用作百分比一致性，并且如下計算：
[0114] (一致的脫氧核糖核苷酸X100V(比對長度-比對中的空位總數）
[0115] 子序列：術語"子序列"意指使一個或多個（例如，若干個）核苷酸從成熟多肽編 碼序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸，其中該子序列編碼具有α -葡糖醛酸糖苷酶 活性的一個片段。在一個方面，一個子序列包含SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID Ν0:6 或SEQ ID N0:8的成熟多肽的氨基酸數目的至少85%、90%、以及95%。
[0116] 變體：術語"變體"是指包括改變（即在一個或多個位置處取代、插入、和/或刪除 一個或多個（例如若干個）氨基酸殘基）的具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的一個多肽。取 代意指占據一個位置的氨基酸被一個不同的氨基酸置換；缺失意指除去占據一個位置的氨 基酸；并且插入意指與占據一個位置的氨基酸相鄰來添加一個或多個（例如，若干個）氨基 酸，例如1-5個氨基酸。
[0117] 具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽
[0118] 術語具有葡萄糖醛酸酯酶活性的"多肽"涉及具有葡萄糖醛酸酯酶活性的所有多 肽。在一個實施例中，術語具有葡萄糖醛酸酯酶活性的"多肽"涉及具有葡萄糖醛酸酯酶活 性的多肽，所述多肽與SEQ ID Ν0:10的成熟多肽具有至少80%，例如至少85%、至少90%、 至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至 少99%、或100%的序列一致性，所述多肽具有葡萄糖醛酸酯酶活性。在一個方面，這些多 肽與SEQ ID N0:10的成熟多肽有不超過十個氨基酸不同，例如九個氨基酸、八個氨基酸、七 個氨基酸、六個氨基酸、五個氨基酸、四個氨基酸、三個氨基酸、兩個氨基酸、或一個氨基酸。 具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽優選包括SEQ ID N0:10的氨基酸序列或其等位變體或由 它們組成；或是其具有葡萄糖醛酸酯酶活性的一個片段。在另一個方面，多肽包括SEQ ID NO: 10的成熟多肽或由其組成。在另一個優選的方面，多肽包括SEQ ID NO: 10的氨基酸101 至474或由其組成。
[0119] 在一個另外的實施例中，術語具有葡萄糖醛酸酯酶活性的"多肽"涉及與SEQ ID NO: 12的成熟多肽具有至少95 %，例如至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 % 的序列一致性的多肽，所述多肽具有葡萄糖醛酸酯酶活性。在一個方面，這些多肽與SEQ ID NO: 12的成熟多肽只有不超過十個氨基酸不同，例如九個氨基酸、八個氨基酸、七個氨基酸、 六個氨基酸、五個氨基酸、四個氨基酸、三個氨基酸、兩個氨基酸、或一個氨基酸。具有葡萄 糖醛酸酯酶活性的多肽優選包括SEQ ID N0:12的氨基酸序列或其等位變體或由它們組成； 或是其具有葡萄糖醛酸酯酶活性的一個片段。在另一個方面，多肽包括SEQ ID N0:12的成 熟多肽或由其組成。在另一個優選的方面，多肽包括SEQ ID NO: 12的氨基酸94至460或 由其組成。
[0120] 在一個另外的實施例中，術語"具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽"涉及與SEQ ID NO: 14的成熟多肽具有至少92%，例如至少93%、至少94%、至少95 %、至少96%、至少 97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %的序列一致性的多肽，所述多肽具有葡萄糖醛酸酯酶 活性。在一個方面，這些多肽與SEQ ID N0:14的成熟多肽只有不超過十個氨基酸不同，例如 九個氨基酸、八個氨基酸、七個氨基酸、六個氨基酸、五個氨基酸、四個氨基酸、三個氨基酸、 兩個氨基酸、或一個氨基酸。
[0121] 具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽優選包括SEQ ID N0:14的氨基酸序列或其等位 變體或由它們組成；或是其具有葡萄糖醛酸酯酶活性的一個片段。在另一個方面，多肽包括 SEQ ID N0:14的成熟多肽或由其組成。在另一個優選的方面，多肽包括SEQ ID N0:14的氨 基酸21至392或由其組成。
[0122] 發明詳細說明
[0123] 具有α -葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽
[0124] 在一個另外的方面，本發明涉及α-葡糖醛酸糖苷酶和選自下組的具有葡萄糖醛 酸酯酶活性的分離的多肽的組合的作用，該組由以下各項組成：
[0125] (a)與SEQ ID Ν0:10的成熟多肽具有至少80%序列一致性的一種多肽；
[0126] (b)由一種多核苷酸編碼的一種多肽，該多核苷酸在高或非常高嚴謹度條件下與 (i)SEQ ID N0:9的成熟多肽編碼序列、（ii)其cDNA序列、或（iii) (i)或（ii)的全長互補 體雜交；
[0127] (c)由與SEQ ID N0:10的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少80%序列一 致性的一種多核苷酸編碼的一種多肽；
[0128] (d)SEQ ID N0:10的成熟多肽的一種變體，該變體在一個或多個（例如若干個）位 置處包括取代、缺失、和/或插入；以及
[0129] (e) (a)、（b)、（c)或（d)的多肽的一個片段，該片段具有葡萄糖醛酸酯酶活性。
[0130] 另外，本發明涉及α -葡糖醛酸糖苷酶和包括一個催化結構域的分離的多肽的組 合的作用，該催化結構域選自下組，該組由以下各項組成：葡萄糖醛酸酯酶（EC 2.4. 1. 17)
[0131] (a)與SEQ ID Ν0:10的氨基酸101至474具有至少80%序列一致性的一個催化 結構域；
[0132] (b)由一種多核苷酸編碼的一個催化結構域，該多核苷酸在高或非常高嚴謹度條 件下與（i)SEQ ID N0:9的核苷酸33至1457、（ii)其cDNA序列、或（iii)⑴或（ii)的全 長互補體雜交；
[0133] (c)由與SEQ ID N0:9的核苷酸33至1457或其cDNA序列具有至少80%序列一 致性的一種多核苷酸編碼的一個催化結構域；
[0134] (e)在一個或多個（例如若干個）位置處包括取代、刪除、和/或插入的SEQ ID NO: 10的氨基酸101至474的變體；以及
[0135] (f)具有葡萄糖醛酸酯酶活性的（a)、(b)、（c)、（d)或（e)的催化結構域的一個片 段。
[0136] 此外，本發明涉及α-葡糖醛酸糖苷酶和選自下組的具有葡萄糖醛酸酯酶活性的 分離的多肽的組合的作用，該組由以下各項組成：
[0137] (a)與SEQ ID Ν0:12的成熟多肽具有至少80%序列一致性的一種多肽；
[0138] (b)由一種多核苷酸編碼的一種多肽，該多核苷酸在高或非常高嚴謹度條件下與 (i)SEQ ID N0:11的成熟多肽編碼序列、（ii)其cDNA序列、或（iii) (i)或（ii)的全長互 補體雜父；
[0139] (c)由與SEQ ID N0:12的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少80 %序列一 致性的一種多核苷酸編碼的一種多肽；
[0140] (d) SEQ ID N0:12的成熟多肽的一種變體，該變體在一個或多個（例如若干個）位 置處包括取代、缺失、和/或插入；以及
[0141] (e) (a)、（b)、（c)或（d)的多肽的一個片段，該片段具有葡萄糖醛酸酯酶活性。
[0142] 本發明還涉及分離的多肽，所述分離的多肽包括選自下組的催化結構域，該組由 以下各項組成：葡萄糖醛酸酯酶（EC 2. 4. 1. 17)
[0143] (a)與SEQ ID N0:12的氨基酸94至460具有至少80%序列一致性的一個催化結 構域；
[0144] (b)由一種多核苷酸編碼的一個催化結構域，該多核苷酸在高或非常高嚴謹度條 件下與（i)SEQ ID N0:11的核苷酸81至1463、（ii)其cDNA序列、或（iii)⑴或（ii)的 全長互補體雜交；
[0145] (c)由與SEQ ID N0:11的核苷酸81至1463或其cDNA序列具有至少80%序列一 致性的一種多核苷酸編碼的一個催化結構域；
[0146] (e) SEQ ID N0:12的氨基酸94至460的一種變體，該變體在一個或多個（例如若 干個）位置處包括取代、刪除、和/或插入；以及
[0147] (f)具有葡萄糖醛酸酯酶活性的（a)、(b)、（c)、（d)或（e)的催化結構域的一個片 段。
[0148] 在一個另外的方面，本發明涉及α-葡糖醛酸糖苷酶和選自下組的具有葡萄糖醛 酸酯酶活性的分離的多肽的組合的作用，該組由以下各項組成：
[0149] (a)與SEQ ID Ν0:14的成熟多肽具有至少80%序列一致性的一種多肽；
[0150] (b)由一種多核苷酸編碼的一種多肽，該多核苷酸在高或非常高嚴謹度條件下與 (i)SEQ ID N0:14的成熟多肽編碼序列、（ii)其cDNA序列、或（iii) (i)或（ii)的全長互 補體雜父；
[0151] (c)由與SEQ ID N0:14的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少80%序列一 致性的一種多核苷酸編碼的一種多肽；
[0152] (d)SEQ ID N0:14的成熟多肽的一種變體，該變體在一個或多個（例如若干個）位 置處包括取代、缺失、和/或插入；以及
[0153] (e) (a)、（b)、（c)或（d)的多肽的一個片段，該片段具有葡萄糖醛酸酯酶活性。
[0154] 本發明還涉及分離多肽，所述分離多肽包括選自下組的催化結構域，該組由以下 各項組成：葡萄糖醛酸酯酶（EC 2. 4. 1. 17)
[0155] (a)與SEQ ID N0:14的氨基酸48至392具有至少80%序列一致性的一個催化結 構域；
[0156] (b)由一種多核苷酸編碼的一個催化結構域，該多核苷酸在高或非常高嚴謹度條 件下與（i)SEQ ID N0:13的核苷酸235至1491、（ii)其cDNA序列、或（iii)⑴或（ii)的 全長互補體雜交；
[0157] (c)由與SEQ ID N0:13的核苷酸235至1491或其cDNA序列具有至少80%序列 一致性的一種多核苷酸編碼的一個催化結構域；
[0158] (d)SEQ ID N0:14的成熟多肽的一種變體，該變體在一個或多個（例如若干個）位 置處包括取代、缺失、和/或插入；以及
[0159] (e) SEQ ID N0:14的氨基酸21至392的一種變體，該變體在一個或多個（例如若 干個）位置處包括取代、刪除、和/或插入；以及
[0160] (f)具有葡萄糖醛酸酯酶活性的（a)、(b)、（c)、（d)或（e)的催化結構域的一個片 段。
[0161] 另外，本發明涉及一種用于降解或轉化纖維素材料的方法，包括：在具有α-葡糖 醛酸糖苷酶活性的與序列 SEQ ID:N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID Ν0:8 中任一 項具有至少68%，例如像70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性的多 肽和具有葡萄糖醛酸酯酶活性的與序列SEQ ID Ν0:10、SEQ ID Ν0:12或SEQ ID Ν0:14中 任一項具有至少68%，例如像70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性 的多肽的存在下，用一種酶組合物處理該纖維素材料。
[0162] 在一個實施例中，本發明涉及與SEQ ID N0:2的成熟多肽具有至少80%，例如至 少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至 少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的分離的多肽，這些分離的多肽具有 α-葡糖醛酸糖苷酶活性。在一個方面，這些多肽與SEQ ID N0:2的成熟多肽只有不超過十 個氨基酸不同，例如九個氨基酸、八個氨基酸、七個氨基酸、六個氨基酸、五個氨基酸、四個 氨基酸、三個氨基酸、兩個氨基酸、或一個氨基酸。
[0163] 本發明的多肽優選地包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列或其等位基因變體或由它們 組成；或是其具有葡糖醛酸糖苷酶活性的片段。在另一個方面，多肽包括SEQ ID N0:2 的成熟多肽或由其組成。在另一個優選的方面，多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸23至702 或由其組成。
[0164] 在一個實施例中，本發明涉及與SEQ ID N0:4的成熟多肽具有至少95%，例如至 少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %的序列一致性的分離的多肽，該分離的多 肽具有葡糖醛酸糖苷酶活性。在一個方面，這些多肽與SEQ ID N0:4的成熟多肽只有 不超過十個氨基酸不同，例如九個氨基酸、八個氨基酸、七個氨基酸、六個氨基酸、五個氨基 酸、四個氨基酸、三個氨基酸、兩個氨基酸、或一個氨基酸。
[0165] 本發明的多肽優選地包括SEQ ID N0:4的氨基酸序列或其等位基因變體或由它們 組成；或是其具有葡糖醛酸糖苷酶活性的片段。在另一個方面，多肽包括SEQ ID N0:4 的成熟多肽或由其組成。在另一個優選的方面，多肽包括SEQ ID N0:4的氨基酸21至696 或由其組成。
[0166] 在一個實施例中，本發明涉及與SEQ ID N0:6的成熟多肽具有至少92%，例如至少 93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一 致性的分離的多肽，這些分離的多肽具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性。在一個方面，這些多肽 與SEQ ID Ν0:6的成熟多肽只有不超過十個氨基酸不同，例如九個氨基酸、八個氨基酸、七 個氨基酸、六個氨基酸、五個氨基酸、四個氨基酸、三個氨基酸、兩個氨基酸、或一個氨基酸。
[0167] 本發明的多肽優選地包括SEQ ID Ν0:6的氨基酸序列或其等位基因變體或由它們 組成；或是其具有葡糖醛酸糖苷酶活性的片段。在另一個方面，多肽包括SEQ ID Ν0:6 的成熟多肽或由其組成。在另一個優選的方面，多肽包括SEQ ID Ν0:6的氨基酸16至690 或由其組成。
[0168] 在一個實施例中，本發明涉及與SEQ ID Ν0:8成熟多肽具有至少68%，例如至少 70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少 94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %的序列一致性的分離 多肽，這些多肽具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性。在一個方面，這些多肽與SEQ ID Ν0:8的成 熟多肽只有不超過十個氨基酸不同，例如九個氨基酸、八個氨基酸、七個氨基酸、六個氨基 酸、五個氨基酸、四個氨基酸、三個氨基酸、兩個氨基酸、或一個氨基酸。
[0169] 本發明的多肽優選地包括SEQ ID N0:8的氨基酸序列或其等位基因變體或由它們 組成；或是其具有葡糖醛酸糖苷酶活性的片段。在另一個方面，多肽包括SEQ ID N0:8 的成熟多肽或由其組成。在另一個優選的方面，多肽包括SEQ ID N0:8的氨基酸33至708 或由其組成。
[0170] 在另一個實施例中，本發明涉及由一種多核苷酸編碼的具有α-葡糖醛酸糖苷酶 活性的分離的多肽，該多核苷酸在非常低嚴謹度條件、低嚴謹度條件、中嚴謹度條件、中高 嚴謹度條件、高嚴謹度條件、或非常高嚴謹度條件下與以下各項雜交：（i)SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7的成熟多肽編碼序列，（ii)其cDNA序列，或（iii)⑴ 或（ii)的全長互補體（薩姆布魯克（Sambrook)等人，1989,分子克隆實驗指南（Molecular Cloning, A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港（Cold Spring Harbor)，紐約）。
[0171] 可以使用 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7或其子序列，以及 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8的多肽或其片段來設計核酸探針以 便根據本領域熟知的方法鑒定和克隆編碼來自不同屬或物種的菌株的具有α-葡糖醛酸 糖苷酶活性的多肽的DNA。具體而言，可以根據標準DNA印跡程序，使用這類探針與感興趣 的細胞的基因組DNA或cDNA雜交，以便鑒別和分離其中的對應基因。這類探針可以明顯短 于完整序列，但是長度應為至少15,例如至少25、至少35、或至少70個核苷酸。優選地，該 核酸探針的長度為至少100個核苷酸，例如長度為至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、 至少400個核苷酸、至少500個核苷酸、至少600個核苷酸、至少700個核苷酸、至少800個 核苷酸、或至少900個核苷酸。DNA和RNA探針都可使用。典型地將探針進行標記（例如， 用32p、3H、35s、生物素、或抗生物素蛋白），以檢測相應的基因。本發明涵蓋此類探針。
[0172] 可以針對與以上描述的探針雜交并且編碼出具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多 肽的DNA對從這類其他菌株制備的基因組DNA或cDNA庫進行篩選。來自這類其他菌株的 基因組DNA或其他DNA可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或其他分離技術來分離。 來自文庫的DNA或分離的DNA可轉移到并固定在硝酸纖維素或其他適合的載體材料上。為 鑒定與SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7或其子序列同源的克隆或 DNA，該運載體材料優選地在DNA印跡法中使用。
[0173] 出于本發明的目的，雜交指示該多核苷酸在非常低到非常高嚴謹度條件下與對應 于以下各項的經過標記的核酸探針雜交：（i)SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO: 7 ;(ii) SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7 的成熟多肽編碼序 列；（iii)cDNA序列；（iv)其全長補體；或（v)其子序列。在這些條件下，核酸探針雜交的 分子可以使用例如X-射線膠片而進行檢測。
[0174] 在另一個方面，該核酸探針是編碼 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8的多肽，其成熟多肽，或其片段的多核苷酸。在另一個方面，該核酸探針是SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7 或其 cDNA 序列。
[0175] 對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，非常低嚴謹度條件被定義為最佳地， 遵循標準 DNA 印跡（Southern blotting)程序，在 42°C下在 5X SSPE、0.3% SDS、200 毫克 /ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和25%甲酰胺中預雜交并雜交12至24小時。載體材料最 終使用2X SSC、0. 2% SDS，在45°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0176] 對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，低嚴謹度條件被定義為最佳地，遵循 標準 DNA 印跡（Southern blotting)程序，在 42°C下在 5X SSPE、0. 3% SDS、200 毫克 /ml 剪切并變性的鮭魚精子DNA和25%甲酰胺中預雜交并雜交12至24小時。載體材料最終使 用2X SSC、0. 2% SDS，在50°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0177] 對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，中嚴謹度條件被定義為最佳地，遵循 標準 DNA 印跡（Southern blotting)程序，在 42°C下在 5X SSPE、0. 3% SDS、200 毫克 /ml 剪切并變性的鮭魚精子DNA和35%甲酰胺中預雜交并雜交12至24小時。載體材料最終使 用2X SSC、0. 2% SDS，在55°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0178] 對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，中-高嚴謹度條件被定義為最佳地，遵 循標準 DNA 印跡（Southern blotting)程序，在 42°C下在 5X SSPE、0. 3% SDS、200 毫克 / ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和亦或35%甲酰胺中預雜交并雜交12至24小時。載體材 料最終使用2X SSC、0. 2% SDS，在60°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0179] 對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，高嚴謹度條件被定義為最佳地，遵循 標準 DNA 印跡（Southern blotting)程序，在 42°C下在 5X SSPE、0. 3% SDS、200 毫克 /ml 剪切并變性的鮭魚精子DNA和50%甲酰胺中預雜交并雜交12至24小時。載體材料最終使 用2X SSC、0. 2% SDS，在65°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0180] 對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，非常高嚴謹度條件被定義為最佳地， 遵循標準 DNA 印跡（Southern blotting)程序，在 42°C下在 5X SSPE、0.3% SDS、200 毫克 /ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和50%甲酰胺中預雜交并雜交12至24小時。載體材料最 終使用2X SSC、0. 2% SDS，在70°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0181] 在另一個實施例中，本發明涉及由與SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5、 SEQ ID N0:7的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至 少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至 少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的多核苷酸編碼的具有 α-葡糖醛酸糖苷酶活性的分離多肽。
[0182] 在另一個實施例中，本發明涉及 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8的成熟多肽的變體，這些變體在一個或多個（例如若干個）位置處包括取代、缺失和/ 或插入。優選地，氨基酸改變的性質較小，也就是說不會顯著影響蛋白質折疊和/或活性的 保守氨基酸取代或插入；典型地是1個至大約30個氨基酸的小段缺失；小段氨基或羧基末 端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小段接頭肽；或通過改變 凈電荷或另一功能而協助純化的小段延伸，例如多組氨酸區段、抗原表位、或結合結構域。
[0183] 保守取代的實例是在下組的范圍內：堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸及組氨酸）、酸 性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）、極性氨基酸（谷氨酰胺和天冬酰胺）、疏水性氨基酸（亮 氨酸、異亮氨酸及纈氨酸）、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸）及小氨基酸（甘 氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸及甲硫氨酸）。一般不會改變特異性活性的氨基酸取代是本 領域已知的并且例如由11.諾伊拉特（他1^ &也）和1?丄.希爾（把11)，1979在蛋白質（11^ Proteins)，學術出版社（Academic Press)，紐約中描述。常見取代是Ala/Ser、Val/Ile、 Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/ Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和 Asp/Gly〇
[0184] 可替代地，氨基酸改變具有這樣一種性質：改變多肽的物理化學特性。例如，氨基 酸改變可以提高多肽的熱穩定性、改變底物特異性、改變最適pH，等等。
[0185] 可以根據本領域中已知的程序，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變（坎寧漢 (Cunningham)和威爾斯（Wells)，1989,科學（Science) 244:1081-1085)來鑒定多膚中的必 需氨基酸。在后一項技術中，在該分子中的每個殘基處引入單個丙氨酸突變，并且對所得突 變體分子的α-葡糖醛酸糖苷酶活性進行測試以鑒別對于該分子的活性至關重要的氨基 酸殘基。還參見，希爾頓（Hilton)等人，1996,生物化學雜志271:4699-4708。也可結合假 定接觸位點氨基酸的突變，如通過以下技術例如核磁共振、結晶學、電子衍射、或光親和標 記進行確定的對結構進行物理學分析，從而確定酶的活性位點或其他生物學相互作用。參 見，例如，德弗斯（de Vos)等人，1992,科學255:306-312 ;史密斯（Smith)等人，1992,分子 生物學雜志224:899-904 ;烏樂達維爾（Wlodaver)等人，1992,歐洲生化學會聯合會快報 309:59-64。還可以從與相關多肽的比對來推斷鑒別必需氨基酸。
[0186] 使用已知的誘變、重組和/或改組方法、隨后進行一個相關的篩選程序可以做出 單一或多種氨基酸取代、缺失和/或插入并對其進行測試，這些相關的篩選程序例如由 1^1(11^31-018〇11(瑞德哈爾-奧爾森）和53脫1'(薩奧爾），1988，科學241:53-57出〇￥丨6(鮑 依）和薩奧爾，1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國國家科學院院刊）86:2152-2156 ;W0 95/17413;或者W0 95/22625所描述的那些。其他可以使用的方法包括易錯PCR、噬菌體展 不（例如洛曼（Lowman)等人，1991，生物化學（Biochemistry) 30:10832-10837 ;美國專利 號5, 223, 409 ;W0 92/06204)以及區域定向誘變（德比什爾（Derbyshire)等人，1986,基因 (Gene)46:145;內爾（Ner)等人，1988, DNA 7:127)。
[0187] 可以結合誘變/改組方法與高通量自動化篩選方法來檢測由宿主細胞表達的克 隆的、誘變的多肽的活性（內斯等人，1999,自然生物技術17:893-896)。編碼活性多肽的誘 變的DNA分子可以回收自宿主細胞，并且使用本領域的標準方法對其進行迅速測序。這些 方法允許迅速確定多肽中單個氨基酸殘基的重要性。
[0188] 在一個實施例中，引入 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8 的 成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的數目不超過10個，例如1、2、3、4、5、6、7、8或 9個。
[0189] 該多肽可以是一種雜合多肽，其中一種多肽的一個區域在另一種多肽的一個區域 的N-末端或C-末端處融合。
[0190] 該多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一種多肽在本發明多肽的 N-末端或C-末端處融合。通過將編碼另一多肽的多核苷酸融合到本發明的多核苷酸而 產生融合多肽。用于產生融合多肽的技術在本領域是已知的，并包括連接編碼多肽的編碼 序列，這樣使得它們在框內并且使得融合多肽的表達處于相同的一個或多個啟動子和終止 子的控制下。還可以使用內含肽技術構建融合多肽，其中在翻譯后產生融合多肽（庫珀 (Cooper)等人，1993,歐洲分子生物學學會雜志12:2575-2583 ;道森（Dawson)等人，1994， 科學 266:776-779)。
[0191] 融合多肽可以在兩個多肽之間進一步包括一個切割位點。在融合蛋白分泌 之時，該位點被切割，從而釋放出這兩個多肽。切割位點的實例包括但不局限于在以 下文獻中披露的位點：馬丁（Martin)等人，2003,工程微生物和生物技術雜志（J. Ind. Microbiol. Biotechnol.) 3:568-576 ;斯瓦蒂娜（Svetina)等人，2000，生物技術雜志 (J.Biotechnol.) 76:245-251 ;拉斯馬森-威爾遜（Rasmussen-Wilson)等人，1997， 應用與環境微生物學（Appl. Environ. Microbiol. )，63:3488-3493 ;沃德（Ward)等 人，1995，生物技術（Biotechnology) 13:498-503 ;以及孔特雷拉斯（Contreras)等 人，1991，生物技術（Biotechnology) 9:378-381 ;伊頓（Eaton)等人，1986，生物化學 (Biochemistry) 25:505-512 ;柯林斯-瑞思（Collins-Racie)等人，1995，生物技術 13:982-987 ;卡特（Carter)等人，1989,蛋白質：結構、功能以及遺傳學（Proteins:Struc ture, Function, and Genetics) 6:240-248 ;以及史蒂文斯（Stevens)，2003,世界藥物發現 (Drug Discovery World)4:35-48〇
[0192] 本發明的另一個方面涉及具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽和具有葡萄糖醛 酸酯酶活性的多肽的組合的作用。
[0193] 具有a -葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽的來源
[0194] 本發明的具有a -葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽可以從任何屬的微生物獲得。出于 本發明的目的，如在此結合一種給定的來源使用的術語"從...中獲得"應意指由多核苷酸 編碼的多肽是由該來源或者由其中已經插入來自該來源的多核苷酸的一種菌株產生的。在 一個方面，獲得自給定來源的多肽被分泌到細胞外。
[0195] 該多肽可以是細菌多肽。例如，該多肽可以是一種革蘭氏陽性細菌多肽，如具 有ct-葡糖醒酸糖苷酶活性的芽孢桿菌屬（Bacillus)、梭菌屬（Clostridium)、腸球菌 屬（Enterococcus)、土芽抱桿菌屬（Geobacillus)、乳酸桿菌屬（Lactobacillus)、乳球菌 屬（Lactococcus)、海洋芽抱桿菌屬（Oceanobacillus)、葡萄球菌屬（Staphylococcus)、 鏈球菌屬（Streptococcus)、或鏈霉菌屬（Streptomyces)多肽；或一種革蘭氏陰性細菌 多肽，如彎曲桿菌屬（Campylobacter)、大腸桿菌（E.coli)、黃桿菌屬（Flavobacterium) (例如約氏黃桿菌（Flavobacterium johnsoniae))、梭桿菌屬（Fusobacterium)、螺旋桿 菌屬（Helicobacter)、泥桿菌屬（Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬（Neisseria)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)、沙門氏菌屬（Salmonella)或脲原體屬（Ureaplasma)多肽。
[0196] 在一個方面，該多肽是嗜堿芽孢桿菌（Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢 桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)、短芽抱桿菌（Bacillus brevis)、環狀芽抱桿菌 (Bacillus circulans)、克勞氏芽抱桿菌（Bacillus clausii)、凝結芽抱桿菌（Bacillus coagulans)、堅強芽抱桿菌（Bacillus firmus)、燦爛芽抱桿菌（Bacillus lautus)、遲 緩芽抱桿菌（Bacillus lentus)、地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)、巨大芽抱 桿菌（Bacillus megaterium)、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌 (Bacillus stearothermophilus)、枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)、或蘇云金芽抱桿 菌（Bacillus thuringiensis)多月太。
[0197] 在另一個方面，該多肽是似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌、或馬鏈球菌獸瘟 亞種多肽。
[0198] 在另一個方面，該多肽是不產色鏈霉菌、阿維鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、灰色鏈絲菌、 或變鉛青鏈霉菌多肽。
[0199] 該多肽還可以是真菌多肽。例如，該多肽可以是酵母多肽，例如假絲酵母 屬（Candida)、克魯維酵母屬（Kluyveromyces)、畢赤酵母屬（Pichia)、酵母菌屬 (Saccharomyces)、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母屬（Yarrowia) 多肽；或絲狀真菌多肽，例如枝頂孢霉屬（Acremonium)、傘菌屬（Agaricus)、鏈格孢 屬（Alternaria)、曲霉屬（Aspergillus)、短梗霉屬（Aureobasidium)、葡萄座腔菌 屬（Botryospaeria)、擬錯菌屬（Ceriporiopsis)、毛 _ 殼屬（Chaetomidium)、金抱 子菌屬（Chrysosporium)、麥角菌屬（Claviceps)、旋孢腔菌屬（Cochliobolus)、鬼傘 屬（Coprinopsis)、乳白蟻屬（Coptotermes)、棒囊殼屬（Corynascus)、隱叢赤殼菌屬 (Cryphonectria)、隱球菌屬（Cryptococcus)、色二抱屬（Diplodia)、黑耳屬（Exidia)、 線黑粉酵母屬（Filibasidium)、鐮刀菌屬（Fusarium)、赤霉屬（Gibberella)、全鞭毛蟲 屬（Holomastigotoides)、腐質霉屬（Humicola)、耙齒菌屬（Irpex)、蘑燕屬（Lentinula)、 小腔球菌屬（Leptospaeria)、梨抱菌屬（Magnaporthe)、黑果菌屬（Melanocarpus)、 多孔菌屬（Meripilus)、毛霉屬（Mucor)、毀絲霉屬（Myceliophthora)、新美鞭菌 屬（Neocallimastix)、脈抱菌屬（Neurospora)、擬青霉屬（Paecilomyces)、青霉菌 屬（Penicillium)、平革菌屬（Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬（Piromyces)、某真菌屬 (Poitrasia)、假黑盤菌屬（Pseudoplectania)、假披發蟲屬（Pseudotrichonympha)、 根毛霉菌屬（Rhizomucor)、裂糟菌屬（Schizophyllum)、柱頂孢屬（Scytalidium)、踝 節菌屬（Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus)、梭孢殼霉屬（Thielavia)、彎頸 霉屬（Tolypocladium)、木霉屬（Trichoderma)、長毛盤菌屬（Trichophaea)、輪枝孢屬 (Verticillium)、小包腳燕屬（Volvariella)或炭角菌屬（Xylaria)多肽。
[0200] 在另一個方面，該多肽是卡爾斯伯酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克魯 維酵母、諾地酶母、或卵形酵母多肽。
[0201] 在另一個方面，該多肽是解纖維枝頂孢霉（Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲 霉（Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉（Aspergillus awamori)、臭曲霉（Aspergillus foetidus)、煙曲霉（Aspergillus fumigatus)、日本曲霉（Aspergillusjaponicus)、構 巢曲霉（Aspergillus nidulans)、黑曲霉（Aspergillus niger)、米曲霉（Aspergillus oryzae)、狹邊金孢子菌（Chrysosporium inops)、嗜角質金孢子菌（Chrysosporium keratinophilum) λ Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、 租金 抱子菌（Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、熱帶金抱子 菌（Chrysosporium tropicum)、帶紋金抱子菌（Chrysosporium zonatum)、桿抱狀嫌 抱（Fusarium bactridioides)、谷類嫌抱（Fusarium cerealis)、庫威嫌抱（Fusarium crookwellense)、大刀嫌抱（Fusarium culmorum)、禾谷嫌抱（Fusarium graminearum)、 禾赤嫌抱（Fusarium graminum)、異抱嫌抱（Fusarium heterosporum)、合歡木嫌抱 (Fusarium negundi)、尖嫌抱（Fusarium oxysporum)、多枝嫌抱（Fusarium reticulatum)、 粉紅嫌抱（Fusarium roseum)、接骨木嫌抱（Fusarium sambucinum)、膚色嫌抱（Fusarium sarcochroum)、擬分枝抱嫌抱（Fusarium sporotrichioides)、硫色嫌抱（Fusarium sulphureum)、圓嫌抱（Fusarium torulosum)、擬絲抱嫌抱（Fusarium trichothecioides)、 壤片嫌抱（Fusarium venenatum)、灰腐質霉（Humicola grisea)、特異腐質霉（Humicola insolens)、疏棉狀腐質霉（Humicola lanuginosa)、白耙齒菌（Irpex lacteus)、米 黑毛霉（Mucor miehei)、嗜熱毀絲霉（Myceliophthora thermophila)、粗糖鏈抱菌 (Neurospora crassa)、黃灰青霉、繩狀青霉菌（Penicillium funiculosum)、產紫青霉菌 (Penicillium purpurogenum)、黃抱原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium)、無色 梭抱殼霉（Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、白毛梭抱殼霉（Thielavia albopilosa)、澳洲梭抱殼霉（Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小抱梭抱 殼霉（Thielavia microspora)、卵抱梭抱殼霉（Thielavia ovispora)、秘魯梭抱殼霉 (Thielavia peruviana)、毛梭抱殼霉（Thielavia setosa)、瘤抱梭抱殼霉（Thielavia spededonium)、耐熱梭抱殼（Thielavia subthermophila)、土生梭抱殼霉（Thielavia terrestris)、哈茨木霉（Trichoderma harzianum)、康寧木霉（Trichoderma koningii)、長 枝木霉（Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉（Trichoderma reesei)、或綠色木霉 (Trichoderma viride)多月太。
[0202] 將理解的是，對于以上提到的物種而言，本發明涵蓋完全狀態和不完全狀態 (perfect and imperfect states)二者、以及其他分類學等效物，例如無性型，而不管它們 已知的物種名稱是什么。本領域的普通技術人員將容易地識別適當等效物的身份。
[0203] 這些物種的株系可以容易地在許多培養物保藏中心為公眾所獲得，如美國 典型培養物保藏中心（ATCC)、德國微生物菌種保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷蘭菌種保藏中心（Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、以及美國農業研究菌種保藏中心北方地區研究中心 (NRRL)〇
[0204] 可以使用上述探針，從其他來源包括從自然界（例如，土壤、堆肥、水，等等）分離 的微生物鑒定并獲得該多肽。用于從自然生境分離微生物的技術是本領域熟知的。然后可 以通過類似地篩選另一微生物的基因組DNA或cDNA文庫或混合的DNA樣品來獲得編碼該 多肽的多核苷酸。一旦用這種或這些探針檢測到編碼一種多肽的多核苷酸，就可以通過使 用本領域普通技術人員眾所周知的的技術分離或克隆該多核苷酸（參見，例如，薩姆布魯 克（Sambrook)等人，1989,見上文）。
[0205] 結構域
[0206] 本發明還涉及催化結構域。
[0207] 在一個實施例中，該催化結構域與SEQ ID N0:2的氨基酸23至702具有至少80%， 例如至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100% 的序列一致性。在一個方面，該催化結構域包括與SEQ ID N0:2的氨基酸23至702有十個 氨基酸不同，例如九個氨基酸、八個氨基酸、七個氨基酸、六個氨基酸、五個氨基酸、四個氨 基酸、三個氨基酸、兩個氨基酸、或一個氨基酸不同的氨基酸序列。
[0208] 該催化結構域優選地包括SEQ ID N0:2的氨基酸23到702或其等位基因變體或 由它們組成；或為其具有α -葡糖醛酸糖苷酶活性的片段。
[0209] 在另一個實施例中，該催化結構域是由在非常低嚴謹度條件、低嚴謹度條件、中嚴 謹度條件、中-高嚴謹度條件、高嚴謹度條件、或非常高嚴謹度條件（如以上定義的）下與 以下雜交的多核苷酸編碼的：（i)SEQ ID Ν0:1的核苷酸67至2544,（ii)其cDNA序列，或 (iii) (i)或（ii)的全長互補體（薩姆布魯克（Sambrook)等人，1989,同上）。
[0210] 在另一個實施例中，該催化結構域是由與SEQ ID NO: 1的核苷酸67至2544或其 cDNA序列具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %序列一致性的多核苷 酸所編碼的。
[0211] 在另一個方面，編碼該催化結構域的多核苷酸包括SEQ ID NO: 1的核苷酸67至 2544或由其組成。
[0212] 在另一個實施例中，該催化結構域是SEQ ID N0:2的氨基酸23到702的一個變體， 該變體在一個或多個（例如若干個）位置處包括取代、缺失和/或插入。在一個實施例中， 引入SEQ ID N0:2的氨基酸23到702的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的數目是10 個，例如 1、2、3、4、5、6、8 或 9 個。
[0213] 在一個實施例中，該催化結構域與SEQ ID N0:4的氨基酸21至696具有至少95%， 例如至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %的序列一致性。在一個方面，該催 化結構域包括與SEQ ID N0:4的氨基酸21至696有十個氨基酸不同，例如九個氨基酸、八 個氨基酸、七個氨基酸、六個氨基酸、五個氨基酸、四個氨基酸、三個氨基酸、兩個氨基酸、或 一個氨基酸不同的氨基酸序列。
[0214] 該催化結構域優選地包括SEQ ID N0:4的氨基酸21到696或其等位基因變體或 由它們組成；或為其具有α -葡糖醛酸糖苷酶活性的片段。
[0215] 在另一個實施例中，該催化結構域是由在非常低嚴謹度條件、低嚴謹度條件、中嚴 謹度條件、中-高嚴謹度條件、高嚴謹度條件、或非常高嚴謹度條件（如以上定義的）下與 以下雜交的多核苷酸編碼的：（i)SEQIDN0 :3的核苷酸61至 2526，（ii)其cDNA序列，或 (iii) (i)或（ii)的全長互補體（薩姆布魯克（Sambrook)等人，1989,同上）。
[0216] 在另一個實施例中，該催化結構域是由與SEQ ID N0:3的核苷酸61至2526或其 cDNA序列具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %序列一致性的多核苷 酸所編碼的。
[0217] 在另一個方面，編碼該催化結構域的多核苷酸包括SEQ ID N0:3的核苷酸61至 2526或由其組成。
[0218] 在另一個實施例中，該催化結構域是SEQ ID N0:4的氨基酸21到696的一個變體， 該變體在一個或多個（例如若干個）位置處包括取代、缺失和/或插入。在一個實施例中， 引入SEQ ID N0:4的氨基酸21到696的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的數目是10 個，例如 1、2、3、4、5、6、8 或 9 個。
[0219] 在一個實施例中，該催化結構域與SEQ ID N0:6的氨基酸16至690具有至少90%， 例如至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %的序列一致性。在一 個方面，該催化結構域包括與SEQ ID N0:6的氨基酸16至690有十個氨基酸不同，例如九 個氨基酸、八個氨基酸、七個氨基酸、六個氨基酸、五個氨基酸、四個氨基酸、三個氨基酸、兩 個氨基酸、或一個氨基酸不同的氨基酸序列。
[0220] 該催化結構域優選地包括SEQ ID N0:6的氨基酸16到690或其等位基因變體或 由它們組成；或為其具有α -葡糖醛酸糖苷酶活性的片段。
[0221] 在另一個實施例中，該催化結構域是由在非常低嚴謹度條件、低嚴謹度條件、中嚴 謹度條件、中-高嚴謹度條件、高嚴謹度條件、或非常高嚴謹度條件（如以上定義的）下與 以下雜交的多核苷酸編碼的 ：（i)SEQIDN0:5的核苷酸46至 2508，（ii)其cDNA序列，或 (iii) (i)或（ii)的全長互補體（薩姆布魯克（Sambrook)等人，1989,同上）。
[0222] 在另一個實施例中，該催化結構域是由與SEQ ID N0:5的核苷酸46至2508或其 cDNA序列具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %序列一致性的多核苷 酸所編碼的。
[0223] 在另一個方面，編碼該催化結構域的多核苷酸包括SEQ ID N0:5的核苷酸46至 2508或由其組成。
[0224] 在另一個實施例中，該催化結構域是SEQ ID N0:6的氨基酸21到690的一個變體， 該變體在一個或多個（例如若干個）位置處包括取代、缺失和/或插入。在一個實施例中， 引入SEQ ID N0:6的氨基酸16到690的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的數目是10 個，例如 1、2、3、4、5、6、8 或 9 個。
[0225] 在一個實施例中，該催化結構域與SEQ ID N0:8的氨基酸33至708具有至少70%， 例如至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97%、至少 98%、至少99%、或100%的序列一致性。在一個方面，該催化結構域包括與SEQ ID N0:8的 氨基酸33至708有十個氨基酸不同，例如九個氨基酸、八個氨基酸、七個氨基酸、六個氨基 酸、五個氨基酸、四個氨基酸、三個氨基酸、兩個氨基酸、或一個氨基酸不同的氨基酸序列。
[0226] 該催化結構域優選地包括SEQ ID N0:8的氨基酸33到708或其等位基因變體或 由它們組成；或為其具有α -葡糖醛酸糖苷酶活性的片段。
[0227] 在另一個實施例中，該催化結構域是由在非常低嚴謹度條件、低嚴謹度條件、中嚴 謹度條件、中-高嚴謹度條件、高嚴謹度條件、或非常高嚴謹度條件（如以上定義的）下與 以下雜交的多核苷酸編碼的 ：（i)SEQIDN0:7的核苷酸82至2124，（ii)其CDNA序列，或 (iii) (i)或（ii)的全長互補體（薩姆布魯克（Sambrook)等人，1989,同上）。
[0228] 在另一個實施例中，該催化結構域是由與SEQ ID N0:7的核苷酸82至2124或其 cDNA序列具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %序列一致性的多核苷 酸所編碼的。
[0229] 在另一個方面，編碼該催化結構域的多核苷酸包括SEQ ID N0:7的核苷酸82至 2124或由其組成。
[0230] 在另一個實施例中，該催化結構域是SEQ ID N0:8的氨基酸33到708的一個變體， 該變體在一個或多個（例如若干個）位置處包括取代、缺失和/或插入。在一個實施例中， 引入SEQ ID N0:8的氨基酸33到708的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的數目是10 個，例如 1、2、3、4、5、6、8 或 9 個。
[0231] 本發明還涉及纖維素結合結構域。
[0232] 在另一個實施例中，該纖維素結合結構域是由在非常低嚴謹度條件、低嚴謹度條 件、中嚴謹度條件、中-高嚴謹度條件、高嚴謹度條件、或非常高嚴謹度條件（如以上定義 的）下與以下雜交的多核苷酸編碼的：（i)SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO: 7的核苷酸，（ii)其cDNA序列，或（iii) (i)或（ii)的全長互補體（薩姆布魯克 (Sambrook)等人，1989,同上）。
[0233] 在另一個實施例中，該纖維素結合結構域是SEQ ID N0:2的一個變體，該變體在 一個或多個（例如若干個）位置處包括取代、缺失和/或插入。在一個方面，引入SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID勵:8的氨基酸取代、缺失和/或插入的數目是10 個，例如 1、2、3、4、5、6、8、
[0234] 或 9 個。
[0235] 可操作地連接到該纖維素結合結構域的催化結構域可以來自水解酶、異構酶、連 接酶、裂解酶、氧化還原酶或轉移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、過氧化氫 酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、內 切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖 苷酶、轉化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶（mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化 物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β -木糖 苷酶。編碼催化結構域的多核苷酸可以從任何原核、真核或其他來源獲得。
[0236] 多核苷酸
[0237] 本發明還涉及編碼如以上所述的本發明的多肽、催化結構域或纖維素結合結構域 的分離的多核苷酸。
[0238] 用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術是本領域已知的并且包括分離自基 因組DNA或cDNA或其組合。來自基因組DNA的多核苷酸的克隆可以例如通過使用眾所周 知的聚合酶鏈反應（PCR)或用以對具有共有的結構特征的克隆的DNA片段進行檢測的表達 庫抗體篩選來實現。參見例如，伊尼斯（Innis)等人，1990, PCR:方法和應用指南（PCR:A Guide to Methods and Application),學術出版社，紐約。可以使用其他核酸擴增程序例 如連接酶鏈式反應（LCR)、連接激活轉錄（LAT)和基于多核苷酸的擴增（NASBA)。這些多核 苷酸可以從任何相關的微生物克隆，并且因此，例如可以是該多核苷酸的多肽編碼區的等 位基因或物種變體。
[0239] 編碼本發明多肽的多核苷酸的修飾對于合成實質上類似于該多肽的多肽可以是 必需的。術語"基本上類似于"該多肽是指該多肽的非天然發生的形式。這些多肽可能以某 種工程化方式而不同于從其天然來源分離的多肽，例如在比活性、熱穩定性、pH最佳值等方 面不同的變體。這些變體可以基于以SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7 的成熟多肽編碼序列、或其cDNA序列（例如其子序列）形式呈現的多核苷酸，和/或通過 引入不會改變該多肽的氨基酸序列，但對應于預定用于產生該酶的宿主有機體的密碼子用 法的核苷酸取代，或通過引入可以產生不同氨基酸序列的核苷酸取代來構建。對于核苷酸 取代的一般描述，參見例如福德（Ford)等人，1991，蛋白表達與純化（Protein Expression and Purification) 2:95-107。
[0240] 核酸構建體
[0241] 本發明還涉及核酸構建體，這些核酸構建體包括可操作地連接至一個或多個控制 序列的本發明的多核苷酸，在與控制序列相容的條件下，這些控制序列指導編碼序列在合 適的宿主細胞中的表達。
[0242] 可以按多種方式操縱多核苷酸，以提供多肽的表達。取決于表達載體，在其插入載 體以前操縱多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重組DNA方法修飾多核苷酸的技術 是本領域熟知的。
[0243] 控制序列可以是啟動子序列，S卩，被宿主細胞識別以對編碼本發明的多肽的多核 苷酸進行表達的一種多核苷酸。啟動子序列包括介導多肽表達的轉錄控制序列。該啟動 子可以是在選擇的宿主細胞中顯示出轉錄活性的任何多核苷酸，包括突變型、截短型及雜 合型啟動子，并且可以是由編碼與該宿主細胞同源或異源的細胞外或細胞內多肽的基因獲 得。
[0244] 用于在細菌宿主細胞中指導本發明的核酸構建體的轉錄的合適啟動子的實例 是從以下各項中獲得的啟動子：解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因（amyQ)、地衣芽孢桿菌 α-淀粉酶基因（amyL)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因（penP)、嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖淀 粉酶基因（amyM)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因（sacB)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基 因、大腸桿菌lac操縱子、大腸桿菌trc啟動子（埃貢（Egon)等人，1988,基因69:301-315)、 天藍色鏈霉菌瓊脂水解酶基因（dagA)、以及原核β -內酰胺酶基因（維拉-卡馬洛夫 (Villa-Kamaroff)等人，1978,美國國家科學院院刊75:3727-3731)、以及tac啟動子（德 波爾（DeBoer)等人，1983,美國國家科學院院刊80:21-25)。另外的啟動子描述于吉爾伯 特（Gilbert)等人，1980,科學美國人（ScientificAmerican) 242:74-94中的"來自重組細 菌的有用蛋白"（"Useful proteins from recombinant bacteria"）、以及薩姆布魯克 (Sambrook)等人，1989,見上文。
[0245] 用于在絲狀真菌宿主細胞中指導本發明的核酸構建體轉錄的合適啟動子的實例 是從以下各項的基因獲得的啟動子：構巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸 穩定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶（glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉堿性 蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶（W0 96/00787)、鑲片鐮孢淀粉 葡糖苷酶（W0 00/56900)、鑲片鐮孢 Daria (W0 00/56900)、鑲片鐮孢 Quinn (W0 00/56900)、 曼赫根毛霉（Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖 苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內切葡聚糖酶I、 里氏木霉內切葡聚糖酶II、里氏木霉內切葡聚糖酶III、里氏木霉內切葡聚糖酶IV、里氏木 霉內切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β -木糖苷酶、以 及NA2-tpi啟動子（來自編碼中性α-淀粉酶的曲霉屬基因的一種修飾的啟動子，其中未 翻譯的前導子已被來自編碼磷酸丙糖異構酶的曲霉屬基因的未翻譯的前導子替代；非限制 性實例包括來自編碼中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修飾的啟動子，其中未翻譯的前導子 已被來自編碼磷酸丙糖異構酶的構巢曲霉或米曲霉基因的未翻譯的前導子替代）；及其突 變型、截短型、以及雜合型啟動子。
[0246] 在酵母宿主中，有用的啟動子從以下的基因獲得：釀酒酵母烯醇酶（ΕΝ0-1)、釀 酒酵母半乳糖激酶（GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3磷酸脫氫酶（ADH1/GAP、ADH2/ GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構酶（ΤΡΙ)、釀酒酵母金屬硫蛋白（CUP1)、以及和釀酒酵母3-磷 酸甘油酸激酶。羅馬諾斯（Romanos)等人，1992,《酵母》（Yeast)8:423-488描述了酵母宿 主細胞的其他有用的啟動子。
[0247] 控制序列也可以是被宿主細胞識別以終止轉錄的合適轉錄終止子序列。終止子序 列與編碼多肽的多核苷酸的3'-末端可操作地連接。在選擇的宿主細胞中有功能的任何終 止子可以用于本發明中。
[0248] 絲狀真菌宿主細胞的優選終止子是從以下各項的基因中獲得的：構巢曲霉鄰氨基 苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α -葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢鐮刀 菌胰蛋白酶樣蛋白酶。
[0249] 用于酵母宿主細胞的優選終止子從以下基因獲得：釀酒酵母烯醇酶、釀酒酵母細 胞色素 C (CYC1)、以及釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。用于酵母宿主細胞的其他有用的終 止子由羅馬努斯等人，1992,見上文描述。
[0250] 控制序列還可以是一個合適的前導子序列，當被轉錄時是對于通過宿主細胞來翻 譯而言重要的mRNA的一個非翻譯區。該前導子序列與編碼多肽的多核苷酸的5' -末端可 操作地連接。可以使用在選擇的宿主細胞中具有功能的任何前導子序列。
[0251] 用于絲狀真菌宿主細胞的優選前導子從以下基因獲得：米曲霉TAKA淀粉酶和構 巢曲霉丙糖磷酸異構酶。
[0252] 適用于酵母宿主細胞的前導子從以下基因獲得：釀酒酵母烯醇酶（EN0-1)、釀酒 酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α因子、以及釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫 酶（ADH2/GAP)。
[0253] 控制序列還可以是一種聚腺苷酸化序列，可操作地連接至該多核苷酸的3' -末端 并且當轉錄時由宿主細胞識別為將聚腺苷酸殘基添加至所轉錄的mRNA的信號的序列。可 以使用在選擇的宿主細胞中具有功能的任何聚腺苷酸化序列。
[0254] 絲狀真菌宿主細胞的優選的聚腺苷酸化序列是從以下各項的基因中獲得的：米曲 霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖孢鐮刀菌胰蛋白酶樣 蛋白酶、和黑曲霉α-葡糖苷酶。
[0255] 有用于酵母宿主細胞的有用的聚腺苷酸化序列由郭（Guo)和舍曼（Sherman)， 1995,分子細胞生物學（Mol. Cellular Biol. ) 15:5983-5990 描述。
[0256] 控制序列也可以是編碼與多肽的N-端連接并指導多肽進入細胞的分泌通路的信 號肽的信號肽編碼區。多核苷酸的編碼序列的5' -端可以固有地包括在翻譯閱讀框架中 與編碼多肽的編碼序列的區段天然地連接的一個信號肽編碼序列。可替代地，編碼序列 5末端可以包括對于該編碼序列是外源的信號肽編碼序列。在編碼序列不天然地包含信 號肽編碼序列的情況下，可能需要外源信號肽編碼序列。可替代地，外源信號肽編碼序列可 簡單地替換天然的信號肽編碼序列以便增強該多肽的分泌。然而，可以使用指導表達的多 肽進入選擇的宿主細胞的分泌途徑中的任何信號肽編碼序列。
[0257] 用于細菌宿主細胞的有效信號肽編碼序列是從以下基因獲得的信號肽編碼序列： 芽孢桿菌屬NCIB 11837產麥芽糖淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌 β -內酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶（nprT、nprS、 nprM)、以及枯草芽孢桿菌prsA。其他信號序列由西莫寧（Simonen)和帕爾瓦（Palva)， 1993,微生物評論（Microbiological Reviews) 57:109-137 描述。
[0258] 用于絲狀真菌宿主細胞的有效信號肽編碼序列是從以下基因獲得的信號肽編碼 序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特異腐質霉纖維素酶、 特異腐質霉內切葡聚糖酶V、疏棉狀腐質霉脂肪酶、以及曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
[0259] 有用于酵母宿主細胞的有用的信號肽是從釀酒酵母α因子和釀酒酵母轉化酶的 基因獲得。其他有用的信號肽編碼序列由羅馬努斯等人，1992,見上文描述。
[0260] 該控制序列還可以是編碼位于多肽的Ν-末端處的前肽的一個前肽編碼序 列。生成的多肽被稱為前體酶（proenzyme)或多肽原（或者在一些情況下被稱為酶原 (zymogen))。多肽原通常是無活性的并且可以通過從該多肽原上催化切割或自動催化切割 前肽而被轉化成一種活性多肽。前肽編碼序列可以從以下各項的基因獲得：枯草芽孢桿菌 堿性蛋白酶（aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶（nprT)、嗜熱毀絲霉漆酶（W0 95/33836)、曼 赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及釀酒酵母α因子。
[0261] 在多肽的Ν-末端處信號肽序列和前肽序列都存在的情況下，前肽序列定位成緊 鄰多肽的Ν-末端并且信號肽序列定位成緊鄰前肽序列的Ν-末端。
[0262] 還可以希望添加調節序列，這些調節序列相對于宿主細胞的生長來調節多肽的表 達。調節系統的實例是響應于化學或物理刺激而引起基因的表達開啟或關閉的那些，包括 調節化合物的存在。原核系統中的調節序列包括lac、tac、以及trp操縱子系統。在酵母 中，可以使用ADH2系統或GAL1系統。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子、 米曲霉TAKA α -淀粉酶啟動子、以及米曲霉葡糖淀粉酶啟動子。調節序列的其他實例是允 許基因擴增的那些。在真核系統中，這些調節序列包括在氨甲蝶呤存在下被擴增的二氫葉 酸還原酶基因以及用重金屬擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼該多肽的多核苷 酸將與調節序列可操作地連接。
[0263] 表達載體
[0264] 本發明還涉及包括本發明的多核苷酸、啟動子、以及轉錄和翻譯終止信號的重組 表達載體。不同的核苷酸和控制序列可以連接在一起以產生一個重組表達載體，這一重組 表達載體可以包括一個或多個便利的限制酶切位點以允許在這些位點處插入或取代編碼 該變體的多核苷酸。可替代地，通過將該多核苷酸或者包括該序列的核酸構建體插入到用 于表達的適當載體中可以表達該多核苷酸。在產生表達載體時，編碼序列是位于該載體中， 以使得該編碼序列與用于表達的適當控制序列可操作地連接。
[0265] 重組表達載體可以是任何載體（例如，質粒或病毒），其能夠方便地進行重組DNA 程序，并且能夠引起多核苷酸的表達。載體的選擇將典型地取決于該載體與有待引入該載 體的宿主細胞的相容性。該載體可以是一種線性的或閉合的環狀質粒。
[0266] 載體可以是自主復制載體，S卩，作為染色體外實體存在的載體，其復制獨立于染色 體復制，例如，質粒、染色體外元件、微染色體、或人工染色體。該載體可以包含用于確保自 我復制的任何裝置。可替代地，該載體可以是這樣一種載體，當它被引入該宿主細胞中時， 被整合到基因組中并且與其中已整合了它的一個或多個染色體一起復制。此外，可以使用 單一載體或質粒或兩個或更多個載體或質粒（這些載體或質粒共同包含有待引入到宿主 細胞的基因組中的總DNA)或轉座子。
[0267] 該載體優選包含允許容易選擇轉化細胞、轉染細胞、轉導細胞或類似細胞的一個 或多個選擇性標記。選擇性標記是一種基因，該基因的產物提供了殺生物劑抗性或病毒抗 性、重金屬抗性、營養缺陷型的原養型、等。
[0268] 細菌選擇性標記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予 抗生素抗性（例如氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、或四環素抗性）的標記。酵母宿主細 胞的適合的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在絲狀真菌宿主 細胞中使用的可選擇標記包括但不局限于amdS (乙酰胺酶）、argB (鳥氨酸氨甲酰基轉移 酶）、bar (草胺膦乙酰轉移酶）、hph (潮霉素磷酸轉移酶）、niaD (硝酸還原酶）、pyrG (乳 清苷-5' -磷酸脫羧酶）、sC(硫酸腺嘌呤基轉移酶）、以及trpC(鄰氨基苯甲酸合酶）、連 同其等效物。優選在曲霉屬細胞中使用的是構巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水 鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus) bar 基因。
[0269] 載體優選含有允許載體整合到宿主細胞的基因組中或載體在細胞中獨立于基因 組自主復制的一個或多個元件。
[0270] 對于整合到該宿主細胞基因組中，該載體可以依靠編碼該多肽的多核苷酸序列或 者通過同源或非同源重組整合到該基因組中的該載體的任何其他元件。可替代地，該載體 可以包含用于指導通過同源重組而整合到宿主細胞基因組中的一個或多個染色體中的一 個或多個精確位置處的另外的多核苷酸。為了增加在精確位置處整合的可能性，這些整合 的元件應包含足夠數量的核酸，例如100至10, 〇〇〇個堿基對、400至10, 000個堿基對、以 及800至10, 000個堿基對，這些堿基對與對應的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源 重組的可能性。這些整合元件可以是與宿主細胞的基因組內的靶序列同源的任何序列。此 夕卜，這些整合元件可以是非編碼多核苷酸或編碼多核苷酸。另一方面，該載體可以通過非同 源重組整合到宿主細胞的基因組中。
[0271] 對于自主復制，載體可以進一步包含使該載體能夠在所討論的宿主細胞中自主復 制的復制起點。復制起點可以是在細胞中起作用的介導自主復制的任何質粒復制子。術語 "復制起點"或"質粒復制子"意指使質粒或載體能夠在體內復制的多核苷酸。
[0272] 細菌復制起點的實例是允許在大腸桿菌中復制的質粒pBR322、pUC19、pACYC177、 以及PACYC184的復制起點，以及允許在芽孢桿菌中復制的質粒pUB110、pE194、pTA1060、以 及ρΑΜβ 1的復制起點。
[0273] 用于在酵母宿主細胞中使用的復制起點的實例是2微米復制起點、ARS1、ARS4、 ARS1與CEN3的組合、以及ARS4與CEN6的組合。
[0274] 適用于絲狀真菌細胞的復制起點的實例是AMA1和ANS1(格姆斯（Gems)等 人，1991，基因（Gene)98:61_67;卡倫（Cullen)等人，1987，核酸研究（Nucleic Acids Res. ) 15:9163-9175 ;W0 00/24883)。AMA1基因的分離和包括該基因的質粒或載體的構建 可根據W0 00/24883披露的方法完成。
[0275] 可以將本發明的多核苷酸的多于一個的拷貝插入到宿主細胞中以增加多肽的產 生。通過將序列的至少一個另外的拷貝整合到宿主細胞基因組中或者通過包含一個與該多 核苷酸的可擴增的選擇性標記基因可以獲得增加的多核苷酸拷貝數目，其中通過在適當選 擇性試劑的存在下培養細胞可以選擇包含選擇性標記基因的經擴增的拷貝的細胞、以及由 此該多核苷酸的另外的拷貝。
[0276] 用于連接以上所描述的元件以構建本發明的重組表達載體的程序是本領域的普 通技術人員熟知的（參見，例如，薩姆布魯克等人，1989,同上文）。
[0277] 宿主細胞
[0278] 本發明還涉及重組宿主細胞，這些重組宿主細胞包括本發明的多核苷酸，該多核 苷酸可操作地連接至一個或多個控制序列，該一個或多個控制序列指導本發明的多肽的產 生。將包含多核苷酸的構建體或載體引入到宿主細胞中，這樣使得該構建體或載體被維持 作為染色體整合體或作為自主復制的染色體外載體，如早前所描述。術語"宿主細胞"涵蓋 由于復制期間發生的突變與親本細胞不同的親本細胞的任何后代。宿主細胞的選擇在很大 程度上取決于編碼該多肽的基因及其來源。
[0279] 該宿主細胞可以是有用于重組產生本發明的多肽的任何細胞，例如原核細胞或真 核細胞。
[0280] 原核宿主細胞可以是任何革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括但 不局限于芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、土芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬、乳球菌屬、海洋芽孢 桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬以及鏈霉菌屬。革蘭氏陰性細菌包括但不局限于彎曲桿菌 屬、大腸桿菌、黃桿菌屬、梭桿菌屬、螺旋桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬、假單孢菌屬、沙門 氏菌屬、以及脲原體屬。
[0281] 細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌細胞，包括但不限于：嗜堿芽孢桿菌、解淀粉 芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦 爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿 菌、枯草芽孢桿菌、以及蘇云金芽孢桿菌的細胞。
[0282] 細菌宿主細胞還可以是任何鏈球菌屬細胞，包括但不限于：似馬鏈球菌、釀膿鏈球 菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種的細胞。
[0283] 細菌宿主細胞還可以是任何鏈霉菌屬細胞，包括但不限于：不產色鏈霉菌、阿維鏈 霉菌、天藍色鏈霉菌、灰色鏈霉菌以及變鉛青鏈霉菌細胞。
[0284] 通過原生質體轉化（參見例如，常（Chang)和科恩（Cohen)，1979,分子和普通 遺傳學（Mol. Gen. Genet.) 168:111-115)，使用感受態細胞（參見，例如，楊格（Young) 和斯皮宰曾（Spizizen)，1961，細菌學雜志（J.Bacteriol. )81:823-829 ;或者杜博楠 (Dubnau)和大衛多夫-阿貝爾森（Davidoff-Abelson)，1971，分子生物學雜志（J.Mol. Biol. )56:209-221)、電穿孔（參見，例如，茂川（Shigekawa)和道爾（Dower)，1988,生物技 術（Biotechniques)6:742-751)、或者接合（參見，例如凱勒（Koehler)和索恩（Thorne), 1987,細菌學雜志（J.BacterioU 169:5271-5278)可以實現將DNA引入到芽孢桿菌屬 細胞中。可以通過原生質體轉化（參見，例如，哈那汗（Hanahan)，1983,分子生物學雜志 166:557-580)或者電穿孔（參見，例如，道爾（Dower)等人，1988,核酸研究16:6127-6145) 實現DNA到大腸桿菌細胞中的引入。可以通過原生質體轉化和電穿孔（參見，例如貢（Gong) 等人，2004，Folia Microbiol. (Praha) 49:399-405)、接合（參見，例如馬卓德（Mazodier) 等人，1989,細菌學雜志171:3583-3585)或轉導（參見，例如伯克（Burke)等人，2001，美國 國家科學院院刊98:6289-6294)實現向鏈霉菌屬細胞中引入DNA。可以通過如下方式實現 將DNA引入到假單胞菌屬細胞中：電穿孔（參見，例如，蔡（Choi)等人，2006,微生物學方法 雜志（J.Microbiol.Methods)64:391_397)、或接合（參見，例如，皮內多（Pinedo)和斯梅 茨（Smets)，2005,應用與環境微生物學（Appl. Environ. Microbiol.) 71:51-57)。可以通過 如下方式實現將DNA引入鏈球菌屬細胞中：天然感受態（參見，例如，佩里（Perry)和藏滿 (Kuramitsu)，1981，傳染與免疫（Infect. Immun. )32:1295-1297)、原生質體轉化（參見，例 如，卡特（Catt)和約里克（Jollick)，1991，微生物（Microbios)68:189-207)、電穿孔（參 見，例如，布克萊（Buckley)等人，1999,應用與環境微生物學65:3800-3804)、或接合（參 見，例如，克萊懷爾（Clewell)，1981，微生物學綜述（Microbiol. Rev. )45:409-436)。然而， 可以使用本領域已知的用于將DNA引入宿主細胞中的任何方法。
[0285] 宿主細胞還可以是真核細胞，如哺乳動物、昆蟲、植物、或真菌細胞。
[0286] 宿主細胞可以是真菌細胞。如在此所用的"真菌"包括子囊菌門、擔子菌門、壺 菌門和接合菌門（如霍克斯沃思（Hawksworth)等人在安-倍氏菌物辭典（Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi),第 8 版，1995，國際 CAB,大學出版社，劍橋 (Cambridge),英國中所定義的）以及卵菌門（Oomycota)(如在霍克斯沃思（Hawksworth) 等人，1995,見上文，第171頁中所引用的）和所有有絲分裂孢子真菌（霍克斯沃思 (Hawksworth)等人，I" 5,見上文）。
[0287] 該真菌宿主細胞可以是酵母細胞。如在此使用，"酵母"包括產子囊酵母（內孢霉 目）、產擔子酵母以及屬于半知菌類（芽生菌）的酵母。由于酵母的分類在將來可能改變， 為了本發明的目的，酵母應如在酵母生物學與活性（Biology and Activities of Yeast) (斯金納（Skinner)，F. A.，帕斯莫爾（Passmore)，S. M.和達文波特（Davenport)，R. R.編 著，應用細菌學研討會系列第 9 期（Soc.App.Bacteriol.Symposium Series Ν〇·9)，1980) 中所述進行定義。
[0288] 酵母宿主細胞可以是假絲酵母屬、漢遜酵母屬（Hansenula)、克魯維酵母屬、畢 赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、或耶氏酵母屬細胞，如乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis)、卡爾斯伯酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克魯維酵母、諾地酵母、卵形 酵母、或解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica)細胞。
[0289] 真菌宿主細胞可以是絲狀真菌細胞。"絲狀真菌"包括真菌門（Eumycota)和卵菌 門的亞門（如由霍克斯沃思等人，1995,見上文所定義）的所有絲狀形式。絲狀真菌通常 的特征在于由殼多糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖、以及其他復雜多糖構成的菌絲體 壁。營養生長是通過菌絲延長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母（如釀酒酵母）的 營養生長是通過單細胞菌體的出芽（budding)，而碳分解代謝可以是發酵的。
[0290] 絲狀真菌宿主細胞可以是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管菌屬、擬蠟菌屬、金 孢子菌屬、鬼傘菌屬、革蓋菌屬、隱球菌屬、線黑粉酵母屬（Filibasidium)、鐮刀菌屬、腐質 霉屬、稻瘟菌屬、毛霉菌屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌 屬、白腐菌屬、瘤胃壺菌屬、側耳屬、裂褶菌屬、踝節菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼菌屬、彎頸 霉屬、檢囷屬、或木霉屬的細胞。
[0291] 例如，絲狀真菌宿主細胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、煙曲霉、日本曲霉、構巢 曲霉、黑曲霉、米曲霉、煙管菌、干擬錯菌、卡內基擬錯菌（Ceriporiopsiscaregiea)、 淺黃擬錯孔菌、潘諾希塔擬錯菌（Ceriporiopsispannocinta)、環帶擬錯 菌（Ceriporiopsisrivulosa)、微紅擬錯菌（Ceriporiopsissubrufa)、蟲擬錯 菌、狹邊金孢子菌（Chrysosporiuminops)、嗜角質金孢子菌、拉克悼金孢子菌 (Chrysosporiumlucknowense)、奠狀金抱子菌（Chrysosporiummerdarium)、租金抱子菌、 女王杜香金孢子菌（Chrysosporiumqueenslandicum)、熱帶金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰蓋 鬼傘、毛云芝菌、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、黃色鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、禾赤鐮孢、異 孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖孢鐮刀菌、多枝鐮孢、粉紅鐮孢菌、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢 鐮刀菌、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮刀菌、鑲片鐮孢菌、特異腐質霉、疏棉狀腐質霉、米黑毛 霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產紫青霉、黃孢原毛平革菌、射紋革菌、杏鮑菇、土生梭孢殼、 長絨毛栓菌、變色栓菌（Trametes versicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉、 或綠色木霉的細胞。
[0292] 可以將真菌細胞通過涉及原生質體形成、原生質體轉化、以及細胞壁再生的方 法以本身已知的方式轉化。用于轉化曲霉屬和木霉屬宿主細胞的適合程序在EP 238023 和約爾頓（Yelton)等人，1984,美國國家科學院院刊81:1470-1474、以及克里斯滕森 (Christensen)等人，1988,生物 / 技術（Bio/Technology)6:1419-1422 中描述。用于轉化 鐮刀菌屬物種的適合方法由馬拉迪爾（Malardier)等人，1989,基因（Gene) 78:147-156、以 及W0 96/00787描述。可以使用由如以下文獻描述的程序轉化酵母：貝克爾（Becker)和瓜 倫特（Guarente)，在阿貝爾森（Abelson)，J.N.和西蒙（Simon), Μ· I.編，酵母遺傳學與分 子生物學指南，酶學方法（Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology)，第 194 卷，第 182-187 頁，學術出版社有限公司（Academic Press, Inc.)，紐 約；伊藤（Ito)等人，1983,細菌學雜志（J. Bacteriol.) 153:163 ;以及哈尼恩（Hinnen)等 人，1978,美國科學院院刊（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 75:1920。
[0293] 產生方法
[0294] 本發明還涉及產生本發明多肽的方法，該方法包括：(a)培養細胞，該細胞處于其 野生型形式，在有益于產生該多肽的條件下產生該多肽；以及（b)回收該多肽。在一個優選 方面，該細胞是裸孢殼屬（針對SEQ ID N0:2)、曲霉屬（針對SEQ ID N0:4)、青霉屬（針對 SEQ ID N0:6)或黃桿菌屬（針對SEQ ID N0:8)細胞。在一個更優選方面，該細胞是構巢裸 孢殼菌（針對SEQ ID N0:2)、黑曲霉（針對SEQ ID N0:4)、橘灰青霉（針對SEQ ID N0:6) 或約氏黃桿菌（針對SEQ ID N0:8)細胞。
[0295] 本發明還涉及產生本發明多肽的方法，該方法包括：(a)在有益于產生該多肽的 條件下培養本發明的重組宿主細胞；以及（b)回收該多肽。
[0296] 使用本領域熟知的方法，在適合產生該多肽的營養培養基中培養宿主細胞。例如， 可以通過在適合的培養基中和在允許表達和/或分離該多肽的條件下，進行搖瓶培養，以 及在實驗室或工業發酵罐中進行小規模或大規模發酵（包括連續，分批，分批補料，或固態 發酵）來培養細胞。該培養是使用本領域中已知的程序，在一種適合營養培養基中發生，該 培養基包含碳和氮來源及無機鹽。合適的培養基可從商業供應商獲得或可以根據公開的組 成（例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中）制備。如果多肽分泌到該營養培養基中， 那么可直接從培養基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可從細胞裂解液中進行回 收。
[0297] 可以使用特異性針對該多肽的本領域已知的方法來檢測該多肽。這些檢測方法可 包括使用特異抗體、形成酶產物、或酶底物的消失。例如，可以使用酶測定來確定該多肽的 活性。
[0298] 可以使用本領域已知的方法來回收多肽。例如，可以通過常規程序，包括，但不局 限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發、或沉淀，從營養培養基中回收該多肽。
[0299] 可以通過本領域已知的多種方法純化該多肽，該方法包括但不限于色譜法（例 如，離子交換色譜法、親和色譜法、疏水色譜法、聚焦色譜法和大小排阻色譜法）、電泳方法 (例如，制備性等電聚焦）、差別溶解度（例如，硫酸銨沉淀）、SDS-PAGE或提取（參見，例如， 蛋白純化（Protein Purification)，編者 J. -C.詹森（Janson)和拉爾斯賴登（Lars Ryden)， VCH出版公司，紐約，1989)，以便獲得基本上純的多肽。
[0300] 在一個替代方面，沒有回收該多肽，而是將表達該多肽的本發明的宿主細胞用作 該多肽的來源。
[0301] 植物
[0302] 本發明還涉及分離的植物，例如轉基因植物、植物部分或植物細胞，這些植物包括 本發明的多肽，從而表達并且產生可回收的量的多肽或結構域。多肽或結構域可從植物或 植物部分回收。作為替代方案，包括該多肽或結構域的植物或植物部分可以按原樣用于改 善食品或飼料的質量，例如改善營養價值、可口性及流變學特性，或破壞抗營養因素。
[0303] 轉基因植物可以是雙子葉的（雙子葉植物）或單子葉的（單子葉植物）。單子葉 植物的實例是草例如草地早熟禾（藍草，早熟禾屬），飼草例如羊茅屬（Festuca)、黑麥草 屬（Lolium)，溫帶草例如剪股穎屬（Agrostis)和谷物例如小麥、燕麥、黑麥、大麥、水稻、高 粱、和玉蜀黍（玉米）。
[0304] 雙子葉植物的實例是煙草、豆類（如羽扇豆（lupins)、馬鈴薯、糖甜菜（sugar beet)、豌豆、豆（bean)和大豆（soybean))、以及十字花科植物（十字花科（family Brassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及緊密相關的模型生物擬南芥）。
[0305] 植物部分的實例是莖、愈傷組織、葉、根、果實、種子、以及塊莖、以及包括這些部分 的獨立組織，例如，表皮、葉肉、薄壁組織（parenchyme)、維管組織、分生組織。特定植物細胞 區室，如葉綠體、質外體（apoplast)、線粒體、液泡、過氧化物酶體以及細胞質也被認為是植 物部分。此外，任何植物細胞，無論是何種組織來源，都被認為是植物部分。同樣地，植物部 分，如分離以有助于本發明的利用的特定組織和細胞也被認為是植物部分，例如胚、胚乳、 糊粉和種皮。
[0306] 同樣包含于本發明范圍內的是這類植物、植物部分以及植物細胞的子代。
[0307] 可以根據本領域已知方法構建表達該多肽或結構域的轉基因植物或植物細胞。簡 而言之，通過將編碼該多肽或結構域的一個或多個表達構建體結合到植物宿主基因組或葉 綠體基因組中并且將所得改性植物或植物細胞繁殖成轉基因的植物或植物細胞來構建植 物或植物細胞。
[0308] 表達構建體方便地是核酸構建體，它包括編碼多肽或結構域的多核苷酸，該多核 苷酸可操作地與選擇的植物或植物部分中表達該多核苷酸所需的適當調節序列連接。而 且，表達構建體可包含用于鑒別整合了此表達構建體的宿主細胞的選擇性標記，和將此構 建體引入所討論的植物所必需的DNA序列（后者取決于所用的引入DNA的方法）。
[0309] 例如基于希望在何時、何處、和怎樣表達該多肽或結構域來確定調節序列，例如啟 動子和終止子序列以及任選的信號序列或轉運序列的選擇。例如編碼多肽或結構域的基 因的表達可以是組成型的或誘導型的，或者可以是發育、階段或組織特異性的，并且基因產 物可以被祀向至特定組織或植物部分，例如種子或葉。調節序列由例如塔格（Tague)等人， 1988,植物生理學（Plant Physiology)86:506 描述。
[0310] 對于組成型表達，可以使用35S_CaMV、玉米泛素1、或稻肌動蛋白1啟動子 (弗蘭克（Franck)等人，1980,細胞（Cell)21:285-294 ;克里斯滕森等人，1992,植物 分子生物學（Plant Mol. Biol.) 18:675-689;張（Zhang)等人，1991，植物細胞（Plant Cell)3:1155-1165)。器官特異性啟動子可以是以下各項的啟動子，例如來自貯藏庫組織 (例如種子、馬鈴薯塊莖、和果實）（Edwards (愛德華茲）和Coruzzi (科魯茲），1990, Ann. Rev. Genet.(遺傳學年鑒）24:275-303)，或來自代謝庫組織（例如分生組織）（Ito (伊 藤）等人，1994, Plant Mol. Biol.(植物分子生物學）24:863-878)，種子特異性啟動子， 例如來自水稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白或白蛋白啟動子（Wu(吳）等人，1998, Plant Cell Physiol.(植物與細胞生理學）39:885-889)，來自豆球蛋白Μ的蠶豆啟動子和來 自蠶豆的未知種子蛋白基因（Conrad(康拉德）等人，1998，J. Plant Physiol.(植物生理 學雜志）152:708-711)，來自種子油體蛋白的啟動子（Chen(陳）等人，1998, Plant Cell Physiol.(植物與細胞生理學）39:935-941)，來自歐洲油菜的C藏蛋白napA啟動子，或本 領域已知的任何其他種子特異性啟動子，例如，如在W0 91/14772中所述的。此外，啟動 子可以是葉特異性啟動子，例如來自水稻或番爺的rbcs啟動子（Kyozuka(京冢）等人， 1993, Plant Physiol.(植物生理學）），102:991-1000)，小球藻病毒腺嘌呤甲基轉移酶基 因啟動子（Mitra (密特拉）和Higgins (希金斯），1994, Plant Mol. Biol.(植物分子生物 學）26:85-93)，來自水稻的aldP基因啟動子（Kagaya(加賀）等人，1995，Mol. Gen. Genet. (分子和普通遺傳學）248:668-674)，或傷口可誘導的啟動子，例如馬鈴薯pin2啟動子 (Xu(徐）等人，1993, Plant Mol. Biol.(植物分子生物學）22:573-588)。同樣，啟動子可 通過非生物處理，例如溫度、干旱、或鹽度變化來誘導，或通過外源施加激活啟動子的物質 (例如乙醇，雌激素，植物激素例如乙烯、脫落酸、和赤霉酸，以及重金屬）來誘導。
[0311] 還可使用啟動子增強子元件，從而在植物中達到多肽或結構域的更高表達。例如， 啟動子增強子元件可以是位于啟動子和編碼多肽或結構域的多核苷酸序列之間的內含子。 例如Xu(徐）等人，1993,同上披露了使用水稻肌動蛋白1基因的第一內含子來增強表達。
[0312] 該選擇性標記基因及該表達構建體的任何其他部分可以選自本領域中可用的那 些。
[0313] 可以根據本領域中已知的常規技術將核酸構建體結合到植物基因組中，這些常規 技術包括農桿菌介導的轉化、病毒介導的轉化、微注射、粒子轟擊、生物射彈轉化、以及電 穿孔（Gasser (加塞爾）等人，1990，Science (科學）244:1293 ;Potrykus (波特里庫斯）， 1990，Bio/Technology (生物 / 技術）8:535 ;Shimamoto (島本）等人，1989，Nature (自 然）338:274)。
[0314] 目前，根癌農桿菌介導的基因轉移是用于產生轉基因雙子葉植物的所選方法（關 于綜述，請參見霍伊卡（Hooykas)和施爾伯魯特（Schilperoort)，1992,植物分子生物學 19:15-38)，并且還可被用于轉化單子葉植物，雖然對于這些植物常常使用其他的轉化方 法。目前，用于產生轉基因單子葉植物的所選方法是粒子（用轉化DNA涂覆的微觀的金或 鶴粒子）轟擊胚愈傷組織或發育中的胚（克里斯托（Christou)，1992,植物雜志（Plant J.) 2:275-281 ;島本，1994,生物技術當前述評（Curr. Opin. Biotechnol.) 5:158-162 ;瓦西 爾（Vasil)等人，1992,生物 / 技術 10:667-674)。如 Omirulleh(奧米如列）等人，1993， Plant Molecular Biology (植物分子生物學）21:415-428中所述，單子葉植物轉化的替代 方法是基于原生質體轉化。根據本披露使用的另外的轉化方法包括美國專利號6, 395, 966 和7, 151，204中所述的那些（這二者都通過引用以其全文結合在此）。
[0315] 在轉化后，根據本領域熟知的方法選出已并入了表達構建體的轉化體，并使其再 生成為完整植物。通常設計轉化程序用于通過如下方法在再生期間或在后續世代中選擇性 消除選擇基因：例如，使用帶有兩個獨立的T-DNA構建體的共轉化或利用特異性重組酶位 點特異性地切除選擇基因。
[0316] 除用本發明的構建體直接轉化特定植物基因型外，還可以通過使具有該構建體的 植物與缺乏該構建體的第二植物進行雜交來產生轉基因植物。例如，可以通過雜交將編碼 多肽或結構域的構建體引入特定植物品種中，無需總是直接地轉化該給定品種的植物。因 此，本發明不僅涵蓋了從根據本發明已經轉化的細胞直接再生的植物，而且還涵蓋了這類 植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根據本發明制備的親本植物的任何代的后代。此 類后代可以包含根據本發明制備的DNA構建體。雜交導致通過供體植物系與起始系交叉授 粉，將轉基因引入植物系。此類步驟的非限制性實例描述于美國專利號7, 151，204中。
[0317] 植物可以通過回交轉化方法生成。例如，植物包含被稱為回交轉化的基因型、種 系、近交體、或雜交體的植物。
[0318] 可以使用遺傳標記以協助本發明的一種或多種轉基因從一個遺傳背景滲入到另 一個。標記協助的選擇提供了相對于常規育種的優勢，在于其可以用于避免由表型變異導 致的錯誤。另外，遺傳標記可以在具體雜交的個別后代中提供有關良種種質相對程度的數 據。例如，當具有所希望性狀并且另外具有非農藝學所希望的遺傳背景的植物與良種親本 雜交時，可以使用遺傳標記來選擇不僅具有感興趣的性狀，還具有相對較大比例所希望種 質的后代。以此方式，使一種或多種性狀滲入特定遺傳背景所需的世代數得以最小化。
[0319] 本發明還涉及產生本發明多肽或結構域的方法，該方法包括：(a)在有益于產生 多肽或結構域的條件下，培養包括編碼該多肽或結構域的多核苷酸的轉基因植物或植物細 胞，以及（b)回收該多肽或結構域。
[0320] α -葡糖醛酸糖苷酶活性的除去或降低
[0321] 本發明還涉及產生親本細胞的突變體的方法，該方法包括破壞或缺失編碼本發明 的多肽的多核苷酸或其部分，這導致突變體細胞比在相同條件下培養的親本細胞產生的多 肽少。
[0322] 可以使用本領域熟知的方法通過降低或消除該多核苷酸的表達來構建突變體細 胞，例如插入、破壞、替換、或缺失。在一個優選方面，將該多核苷酸失活。例如，待修飾或失 活的多核苷酸可以是活性必需的編碼區或其部分，或編碼區的表達所需的調節元件。這種 調節或控制序列的實例可以是啟動子序列或其功能部分，即足以影響該多核苷酸的表達的 部分。可修飾的其他控制序列包括但不局限于前導子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽 序列、轉錄終止子、和轉錄激活因子。
[0323] 該多核苷酸的修飾或失活可以通過使親本細胞經受誘變，并且選擇該多核苷酸的 表達被降低或消除的突變體細胞來進行。所述誘變可以是特異的或隨機的，例如通過使用 適宜的物理或化學誘變劑、通過使用適宜的寡核苷酸、或通過對DNA序列PCR產生誘變來進 行。此外，誘變可通過使用這些誘變劑的任意組合來進行。
[0324] 適用于本發明目的的物理或化學誘變劑的實例包括紫外線（UV)照射、羥胺、N-甲 基-Ν'-硝基-N-亞硝基胍（MNNG)、0-鄰甲基羥胺、亞硝酸、乙基甲磺酸酯（EMS)、亞硫酸氫 鈉、甲酸和核苷酸類似物。
[0325] 當使用這些試劑時，誘變一般是在適宜條件下在所選的誘變處理試劑的存在下通 過孵育有待誘變的親本細胞并篩選和/或選擇展示基因表達降低或不表達的突變體細胞 來進行的。
[0326] 該多核苷酸的修飾或失活可以通過在基因中或在其轉錄或翻譯所需的調節元件 中插入、取代、或缺失一個或多個核苷酸來完成。例如，可插入或除去核苷酸從而形成終止 密碼子的引入、起始密碼子的除去、或開放讀碼框的改變。這些修飾或失活可根據本領域已 知的方法通過定點誘變或PCR產生的誘變來完成。盡管原則上，修飾可以在體內進行，即直 接在表達待修飾的多核苷酸的細胞上進行，但是優選的是如下所示例地在體外進行修飾。
[0327] 便利的消除或降低多核苷酸的表達的方法的實例是基于基因替換、基因缺失、或 基因破壞技術的。例如，在基因破壞方法中，將對應于內源多核苷酸的核酸序列在體外進行 誘變以產生缺陷的核酸序列，然后將其轉化到親本細胞中以產生缺陷基因。通過同源重組， 該缺陷的核酸序列替換內源多核苷酸。令人希望的是，缺陷的多核苷酸還編碼可用于選擇 其中該多核苷酸已經被修飾或破壞的轉化體的標記。在一個方面，用例如在此描述的那些 選擇性標記來破壞該多核苷酸。
[0328] 本發明還涉及抑制具有α -葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽在細胞中的表達的方法， 這些方法包括向該細胞給予或在其中表達一種雙鏈RNA (dsRNA)分子，其中該dsRNA包括本 發明的多核苷酸的一個子序列。在一個優選方面，該dsRNA長約15個、16個、17個、18個、 19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個或更多個雙核苷酸。
[0329] 該dsRNA優選是一個小干擾RNA (siRNA)或微小RNA (miRNA)。在一個優選方面，該 dsRNA是用于抑制轉錄的小干擾RNA。在另一個優選方面，該dsRNA是用于抑制翻譯的微小 RNA。
[0330] 本發明還涉及此類雙鏈RNA (dsRNA)分子，包括用于抑制該多肽在細胞中的表達 的SEQ ID NO: 1的成熟多肽編碼序列的部分。雖然本發明不局限于任何具體的作用機制，但 是該dsRNA可以進入一個細胞并且導致相似的或相同的序列的單鏈RNA (ssRNA)(包括內源 mRNA)的降解。當細胞被暴露于dsRNA時，來自同源基因的mRNA選擇性地被一種叫做RNA 干擾（RNAi)的過程所降解。
[0331] 本發明的dsRNA可以用于基因沉默。在一個方面，本發明提供了使用本發明的 dsRNAi來選擇性地降解RNA的方法。可以在體外、離體或體內進行該過程。在一個方面， 可以使用這些dsRNA分子來在細胞、器官或動物中產生功能缺失突變。用于制備并使用 dsRNA分子選擇性降解RNA的方法在本領域中是熟知的；參見例如美國專利號6, 489, 127 ; 6, 506, 559 ;6, 511，824 ;以及 6, 515, 109。
[0332] 本發明進一步涉及在編碼該多肽的多核苷酸或其控制序列或編碼該多肽的沉默 基因中包括破壞或缺失的親本細胞的突變體細胞，這導致與親本細胞相比，該突變體細胞 產生的多肽少或不產生多肽。
[0333] 這些多肽缺陷的突變體細胞作為用于原生和異源多肽的表達的宿主細胞尤其有 用。因此，本發明進一步涉及產生原生或異源多肽的方法，包括：(a)在有益于產生該多肽 的條件下培養該突變體細胞；并且（b)回收該多肽。術語"異源多肽"是指對該宿主細胞來 說不是原生的多肽，例如天然蛋白質的變體。該宿主細胞可以包括多于一個拷貝的編碼該 原生或異源多肽的多核苷酸。
[0334] 可使用本領域已知的方法進行培養和目的產物的純化。
[0335] 本發明用于生產基本上不含α-葡糖醛酸糖苷酶的產物的方法在真核多肽的生 產中特別是感興趣的，尤其是真菌蛋白質，例如酶。α -葡糖醛酸糖苷酶缺陷的細胞還可用 于表達藥學感興趣的異源蛋白，例如激素、生長因子、受體等。術語"真核多肽"不僅包括原 生多肽，還包括經過氨基酸替代、缺失或添加的修飾或用以增強活性、熱穩定性、pH耐受性 等的其他此類修飾的多肽，例如酶。
[0336] 在另一個方面，本發明涉及通過本發明的方法生產的基本上不含α-葡糖醛酸糖 苷酶活性的蛋白產物。
[0337] 處理纖維素材料的方法
[0338] 本發明還涉及用于降解或轉化纖維素材料的方法，該方法包括：在本發明的具有 α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽的存在下，用一種酶組合物處理該纖維素材料。在一個優選 方面，該方法進一步包括對降解的或轉化的纖維素材料進行回收。
[0339] 本發明還涉及產生一種發酵產物的方法，這些方法包括：（a)在本發明的具有 α -葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽的存在下，用一種酶組合物使纖維素材料糖化；(b)用一種 或多種（若干種）發酵微生物發酵糖化的纖維素材料，以產生該發酵產物；并且（c)從發酵 中回收該發酵產物。
[0340] 本發明還涉及對纖維素材料進行發酵的方法，該方法包括用一種或多種（若干 種）發酵微生物對纖維素材料進行發酵，其中纖維素材料是在本發明的具有α-葡糖醛酸 糖苷酶活性的多肽的存在下用酶組合物進行糖化。在一個優選方面，發酵該纖維素材料產 生一種發酵產物。在另一個優選方面，該方法進一步包括從發酵中回收發酵產物。
[0341] 本發明的方法可被用于將一種纖維素材料糖化成可發酵糖，并且將這些可發酵糖 轉化成許多有用的物質，例如燃料、飲用乙醇、和/或發酵產物（例如酸類、醇類、酮類、氣體 等）。由該纖維素材料產生所希望的發酵產物典型地涉及預處理、酶水解（糖化）、以及發 酵。
[0342] 根據本發明，可以使用本領域常規的過程來完成纖維素材料的加工。此外，可以使 用被配置為根據本發明進行操作的常規生物質加工裝置來實施本發明的方法。
[0343] 分開或同時的水解（糖化）和發酵包括但不限于：分開水解和發酵（SHF)、同時 糖化和發酵（SSF)、同時糖化和共發酵（SSCF)、雜合的水解和發酵（HHF)、分開水解和共 發酵（SHCF)、雜合的水解和共發酵（HHCF)，以及直接微生物轉化（DMC)。SHF使用分開 的處理步驟以首先將纖維素材料酶促水解為可發酵糖，例如，葡萄糖、纖維二糖、纖維三 糖、以及戊糖，并且然后將這些可發酵糖發酵成乙醇。在SSF中，纖維素材料的酶水解和 糖發酵成乙醇被組合在一個步驟中（菲利皮迪斯· G. P. (Philippidis, G. P.)，1996,纖維 素生物轉化技術（Cellulose bioconversion technology),生物乙醇手冊：生產和利用 (Handbook on Bioethanol:Production and Utilization),懷曼 *C. E (Wyman, C. Ε·)編輯， 泰勒-弗朗西斯出版集團（Taylor&Francis)，華盛頓特區（Washington, DC)，179-212))。 SSCF涉及多種糖的共發酵（希恩· J. (Sheehan, J.)和希默爾· M. (Himmel，Μ.)，1999,酶、 能量與環境：美國能源部研究和開發生物乙醇活性的戰略性觀點（Enzymes, energy and the environment:A strategic perspective on the U. S. Department of Energy' s research and development activities for bioethanol),生物技術進展（Biotechnol. Prog.) 15:817-827)。HHF涉及一個分開的水解步驟，并且另外涉及一個同時糖化和水解步 驟，這些步驟可以在同一反應器中進行。HHF過程中的步驟可以在不同的溫度下進行，即高 溫酶糖化，接著在發酵菌株能夠耐受的更低溫度下進行SSF。DMC將全部三個過程（酶產 生、水解以及發酵）組合在一個或多個（若干個）步驟中，其中相同生物被用來產生用于將 纖維素材料轉化成可發酵糖的酶并且將可發酵糖轉化成最終產物（林德· L. R. (Lynd, L. R. )、韋默· Ρ· J. (Weimer，Ρ· J.)，范澤爾· W. Η· (van Zyl，W. Η·)、以及普利特瑞斯*1· S. (Pretorius，I.S.)，2002,微生物纖維素利用：基礎與生物技術（Microbial cellulose utilization:Fundamentals and biotechnology)，微生物分子生物學綜述（Microbiol. Mol. Biol. Reviews)66:506-577)。在此應理解的是，本領域中已知的包括預處理、酶水解 (糖化）、發酵、或其組合的任何方法，可以用于實施本發明的方法。
[0344] 常規設備可以包括分批補料攪拌反應器、分批攪拌反應器、具有超濾的連續流攪 拌反應器、和/或連續活塞流柱式反應器（費爾南達.德.卡斯蒂柳斯.柯瑞芝（Fernanda de Castilhos Corazza)、弗拉維奧.法里亞.德.莫賴斯（Flcivio Faria de Moraes)、 吉塞拉.瑪麗亞.扎寧（Gisella Maria Zanin)以及伊沃.雷特澤爾（Ivo Neitzel)， 2003,用于纖維二糖水解的分批補料反應器的優化控制（Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis)，科技學報（自然科學版）（Acta Scientiarum. Technology) 25:33-38 ;古薩科夫· A. V. (Gusakov, A. V.)和辛捏特西· A. P. (Sinitsyn, A. P.)，1985,纖維素的酶水解動力學：1.分批反應器加工的數學模型（Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose:1. A mathematical model for a batch reactor process)，酶與微生物技術（Enz. Microb. Technol.) 7:346-352);摩擦反應器（隆*3· K. (Ryu，S. K.)和李· J. M. (Lee，J. Μ.)，1983,通過使用摩擦生物反應器進行的廢棄纖維素 的生物轉化（Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor), 生物技術與生物工程（Biotechnol. Bioeng.) 25:53-65);或具有由電磁場引起的強烈攪拌 的反應器（古薩科夫· A. V.、辛涅特西· A. P.、謝爾蓋· I. Y. (Davydkin，I. Y.)、謝爾蓋· V. Y.、普羅塔斯·〇. V. (Protas，0. V.)，1996,使用具有由電磁場引起的強烈攪拌的新型反應器 增強酶纖維素水角軍（Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field),應 用生物化學與生物技術（Appl. Biochem. Biotechnol.) 56:141-153)。另外的反應器類型包 括：用于水解和/或發酵的流化床反應器、升流層（upflow blanket)反應器、固定化反應 器、以及擠出機型反應器。
[0345] 預處理。在本發明的方法的實踐中，可以使用本領域已知的仟何預處理方法來破 壞植物細胞壁的纖維素材料組分（錢德拉（Chandra)等人，2007,底物預處理：木質纖維 素的有效酶水解的關鍵？（Substrate pretreatment:The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics?)，生物化學工程 / 生物技術的進展（Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. ) 108:67-93 ;蓋博（Galbe)和小林（Zacchi)，2007,用于高效生物乙 醇生產的木質纖維素材料的預處理（Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production),生物化學工程/生物技術的進展108:41-65;亨德 里克斯（Hendriks)和季曼（Zeeman) ,2009,用以增強木質纖維素生物質的消化性的預處 理(Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass), 生物資源技術（Bioresource Technol. )100:10-18;莫熱（Mosier)等人，2005,用于木 質纖維素生物質的預處理的有前景技術的特征（Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass)，生物資源技術 96:673-686;塔希爾扎 德（Taherzadeh)和卡里米（Karimi)，2008,預處理木質纖維素廢棄物以改善乙醇和生物 氣體產生：綜述（Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production:A review)，分子科學國際雜志（Int.J. of Mol. Sci. )9:1621-1651 ;楊 (Yang)和懷曼,2008,預處理：釋放低成本纖維素乙醇的關鍵（Pretreatment:the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol)，生物燃料、生物產品與生物精煉（Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr.) 2:26-40) 〇
[0346] 纖維素材料也可以在預處理之前使用本領域中已知的方法進行顆粒尺寸減縮、預 浸泡、潤濕、洗滌、或調理。
[0347] 常規預處理包括但不局限于蒸汽預處理（用或不用爆發）、稀酸預處理、熱水預處 理、堿預處理、石灰預處理、濕氧化、濕爆發、氨纖維爆發、有機溶劑預處理、和生物預處理。 另外的預處理包括氨滲濾、超聲、電穿孔、微波、超臨界C0 2、超臨界4〇、臭氧、以及Y輻射預 處理。
[0348] 可以在水解和/或發酵之前對纖維素材料進行預處理。優選在水解前進行預處 理。可替代地，可以同時用酶水解進行預處理，以釋放可發酵糖，例如葡萄糖、木糖、和/或 纖維二糖。在多數情況下，預處理步驟自身導致將生物質轉化為可發酵糖（即使在沒有酶 的情況下）。
[0349] 蒸汽預處理。在蒸汽預處理中，加熱纖維素材料以破壞植物細胞壁組分，包括木質 素、半纖維素、和纖維素以使纖維素和其他級分，例如半纖維素可接近酶。纖維素材料經過 或穿過反應容器，將蒸汽注入該反應容器以增加溫度至所需溫度和壓力，并且將蒸汽保持 在其中持續希望的反應時間。蒸汽預處理優選在140°C -230°C，更優選160°C -200°C，并且 最優選170°C -190°C下執行，其中最佳溫度范圍取決于化學催化劑的任意添加。蒸汽預處 理的停留時間優選是1-15分鐘，更優選3-12分鐘，并且最優選4-10分鐘，其中最佳停留時 間取決于溫度范圍和化學催化劑的任意添加。蒸汽預處理允許相對較高的固體加載量，這 樣使得纖維素材料在預處理過程中通常僅變得潮濕。蒸汽預處理經常與預處理后的材料的 爆發放料（explosive discharge)合并，這被稱為蒸汽爆發，即，快速急驟蒸發至大氣壓和 材料的湍流，以通過破碎增加可接觸的表面積（Duff (迪福）和Murray (默里），1996,生物 資源技術855:1-33 ;蓋爾貝和賽琪，2002, Appl. Microbiol. Biotechnol.(應用微生物學與 生物技術）59:618-628 ;美國專利申請號20020164730)。在蒸汽預處理過程中，半纖維素乙 酰基被裂解，并且所得到的酸自催化半纖維素部分水解成單糖和寡糖。僅在有限的程度上 去除木質素。
[0350] 經常在蒸汽預處理之前添加催化劑，如H2S04或S0 2 (典型地0. 3 %至3 % w/w)， 這降低時間和溫度、增加回收率、并且改善酶水解（巴列斯特羅斯（Ballesteros)等人， 2006,應用生物化學與生物技術129-132:496-508 ;瓦爾加（Varga)等人，2004,應用生物化 學與生物技術113-116:509-523;薩斯那（Sassner)等人，2006,酶與微生物技術（Enzyme Microb. Technol. )39:756-762)〇
[0351] 化學預處理：術語"化學處理"是指能促進纖維素、半纖維素、和/或木質素的分離 和/或釋放的任何化學預處理。適合的化學預處理方法的實例包括：（例如）稀酸預處理、 石灰預處理、濕氧化、氨纖維/冷凍爆發（AFEX)、氨滲濾（APR)、以及有機溶劑預處理。
[0352] 在稀酸預處理中，纖維素材料與稀酸（典型地是H2S04)和水混合，以形成漿液，由 蒸汽加熱至希望的溫度，并且在停留時間后急驟蒸發至大氣壓。可以用許多反應器設計來 進行稀酸預處理，例如，活可采用多種反應器設計來進行稀酸預處理，例如活塞流反應器、 逆流反應器或連續逆流收縮床反應器（達夫（Duff)和默里（Murray)，1996,同上；謝爾 (Schell)等人，2004,生物資源技術（Bioresource Technol.) 91 :179-188 ;李（Lee)等人， 1999,生物化學工程 / 生物技術進展（Adv. Biochem. Engin. /Biotechnol.) 65 :93-115)。
[0353] 還可以使用在堿性條件下的幾種預處理方法。這些堿性預處理包括但不限于：石 灰預處理、濕氧化、氨滲濾（APR)、以及氨纖維/冷凍爆發（AFEX)。
[0354] 用碳酸鈣、氫氧化鈉、或氨，在85 °C _150°C的低溫下進行石灰預處理，并且 停留時間為從1小時到幾天（懷曼（Wyman)等人，2005,生物資源技術（Bioresource Technol. )96:1959-1966 ;莫熱（Mosier)等人，2005，生物資源技術（Bioresource Technol.)96:673-686)〇 W0 2006/11089U W0 2006/11899, W0 2006/11900,以及 TO 2006/110901披露了使用氨的預處理方法。
[0355] 濕氧化是一種熱預處理，其典型地在添加氧化劑（如過氧化氧或過壓 氧）的情況下在180°C至200°C下持續5-15分鐘進行（施密特（Schmidt)和湯姆 森（Thomsen)，1998,生物資源技術64:139-151 ;帕羅內（Palonen)等人，2004,應用生 物化學與生物技術117:1-17 ;瓦爾加等人，2004,生物技術與生物工程（Biotechnol. Bioeng. )88:567-574 ;馬丁（Martin)等人，2006,化學技術與生物技術雜志（J.Chem. Technol. Biotechnol.) 81:1669-1677)。預處理優選以1 %至40 %干物質，更優選2 %至 30%干物質，并且最優選5%至20%干物質進行，并且經常通過添加堿如碳酸鈉來增加初 始pH。
[0356] 濕氧化預處理方法的修改，稱為濕爆發（濕氧化與蒸汽爆發組合）可以處理高 達30%的干物質。在濕爆發中，在某一停留時間后，在預處理期間引入氧化劑（oxidizing agent)。然后通過急驟蒸發至大氣壓結束預處理（W0 2006/03228)。
[0357] 氨纖維爆發（AFEX)涉及在如90°C _100°C的中等溫度和如17至20bar的高壓下， 用液體或氣態氨處理纖維素材料5至10分鐘，其中干物質含量可以高達60% (格拉帕里 (Gollapalli)等人，2002,應用生物化學與生物技術98:23-35;俊達瓦特（Chundawat)等 人，2007,生物技術與生物工程（Biotechnol.Bioeng. )96:219-231 ;阿里扎德（Alizadeh) 等人，2005,應用生物化學與生物技術121:1133-1141 ;泰莫里（Teymouri)等人，2005,生物 資源技術96:2014-2018)。AFEX預處理導致纖維素的解聚和半纖維素的部分水解。木質 素-碳水化合物復合物被裂解。
[0358] 有機溶劑預處理通過使用含水乙醇（40% -60%乙醇）在160°C _200°C下萃 取30-60分鐘而將纖維素材料脫木質素（潘（Pan)等人，2005,生物技術與生物工程 90:473-481 ;潘等人，2006,生物技術與生物工程94:851-861 ;庫拉比（Kurabi)等人，2005， 應用生物化學與生物技術121:219-230)。通常加入硫酸作為催化劑。在有機溶劑預處理 中，大部分半纖維素被去除。
[0359] 適合的預處理方法的其他實例由舍爾等人，2003,應用生物化學與生物技術，第 105-108卷，第69-85頁、和莫熱等人，2005,生物資源技術96:673-686、以及美國公開申請 2002/0164730 描述。
[0360] 在一個方面，化學預處理優選是以酸處理進行，并且更優選持續稀酸和/或弱酸 處理。酸通常是硫酸，但也可以使用其他酸，如乙酸、檸檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯 化氫、或其混合物。弱酸處理優選在1-5,更優選1-4,并且最優選1-3的pH范圍內進行。在 一個方面，該酸濃度在優選從〇. 01至20wt%酸，更優選0. 05至10wt%酸，甚至更優選0. 1 至5wt %酸，并且最優選0. 2至2. Owt %酸的范圍中。使酸與纖維素材料相接觸，并在優選 160°C _220°C，并且更優選165°C _195°C范圍內的溫度下保持從幾秒到幾分鐘，例如1秒至 60分鐘范圍內的時期。
[0361] 在另一個方面，預處理是以氨纖維爆破步驟（AFEX預處理步驟）進行。
[0362] 在另一方面，預處理在水性漿料中進行。在優選的方面，在預處理過程中纖維素材 料以優選10_80wt %之間，更優選20-70wt %之間，并且最優選30-60wt %之間，例如50wt % 左右的量存在。預處理的纖維素材料可以不洗滌或使用本領域已知的任何方法洗滌，例如， 用水洗滌。
[0363] 機械預處理術語"機械預處理"是指各種類型的研磨或碾磨（例如，干磨、濕磨、或 振動球磨）。
[0364] 物理預處理：術語"物理預處理"是指促進纖維素、半纖維素、和/或木質素從纖維 素材料中分離和/或釋放的任何預處理。例如，物理預處理可包括輻射（例如微波輻射）、 汽蒸/蒸汽爆發、水熱解及其組合。
[0365] 物理預處理可以包括高壓和/或高溫（蒸汽爆發）。在一個方面，高壓意指在優選 約300至約600psi，更優選約350至約550psi，并且最優選約400至約500psi，例如450psi 左右的范圍中的壓力。在另一個方面，高溫意指在約100至約300°C，優選約140至約200°C 范圍中的溫度。在一個優選方面，在分批過程中，以蒸汽槍水解器系統（例如從順智公司 (Sunds Defibrator AB)，瑞典（Sweden)可獲得的 Sunds 水解器（Sunds Hydrolyzer))來進 行機械預處理，該系統使用如上所定義的高壓和高溫。
[0366] 組合的物理和化學預處理纖維素材料可以物理地且化學地預處理。例如，該預處 理步驟可包括稀酸或弱酸預處理以及高溫和/或高壓處理。這些物理預處理和化學預處理 可以根據需要順序地進行或同時進行。也可以包括機械預處理。
[0367] 因此，在一個優選方面，使纖維素材料經受機械、化學或物理預處理、或其任何組 合，以促進纖維素、半纖維素、和/或木質素的分離和/或釋放。
[0368] 生物預處理：術語"生物預處理"是指促進纖維素、半纖維素、和/或木質素從纖 維素材料中分離和/或釋放的任何生物預處理。生物預處理技術可以涉及應用溶解木質 素的微生物（參見，例如，舒· T. -A. (Hsu, Τ· -A. )，1996,生物質的預處理（Pretreatment of biomass),生物乙醇手冊：生產和利用，懷曼*C.E.編輯，泰勒-弗朗西斯出版集團， 華盛頓特區，179-212 ;高希（Ghosh)和辛格（Singh)，1993,用于纖維素生物質的酶/微 生物轉化的物理化學與生物處理（Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of cellulosic biomass),應用微生物學進展（Adv. Appl. Microbiol. )39:295-333 ;麥克米蘭· J.D. (McMillan, J.D·)，1994,預處理木質纖 維素生物質：綜述（Pretreating lignocellulosic biomass:a review)，用于燃料生產 的生物質的酶轉化（Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production)，希默 爾· Μ. E.、貝克· J. 0.、以及奧弗倫· R. P. (Overend，R. P.)編輯，美國化學學會討論會系列 566 (ACS Symposium Series 566)，美國化學學會（American Chemical Society)，華盛頓 特區，第 15 章；貢· C. S. (Gong, C. S.)、卡奧· N. J. (Cao, N. J.)、杜· J. (Du, J.)、以及曹-G. T. (Tsao，G.T. )，1999，由可再生資源生產乙醇（Ethanol production from renewable resources)，生物化學工程/生物技術的進展，舍佩爾· T.編輯，施普林格出版社德國海 德堡柏林（Berlin Heidelberg, Germany) ,65:207-241);奧爾森（Olsson)和哈恩-哈格 達爾（Hahn-Hagerdal)，1996,用于乙醇生產的木質纖維素水解物的發酵（Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production),酶與微生物技術（Enz. Microb. Tech.) 18:312-331 ;以及瓦藍德（Vallander)和埃里克松（Eriksson)，1990，由 木質纖維素材料生產乙醇：技術現狀（Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art),生物化學工程/生物技術的進展42:63-95)。
[0369] 趣化。在水解步驟（還稱為糖化）中，將（例如預處理的）纖維素材料水解，以將 纖維素以及可替代地還有半纖維素分解成可發酵糖，如葡萄糖、纖維二糖、木糖、木酮糖、阿 拉伯糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶性寡糖。水解由酶組合物在本發明的具有α -葡糖醛酸 糖苷酶活性的一種多肽的存在下酶促進行。該組合物可進一步包括一種或多種（若干種） 半纖維素分解酶或木聚糖降解酶。還可順序地添加這些組合物的酶。
[0370] 酶水解優選在易于由本領域技術人員確定的條件下、在合適的含水環境中執行。 在一個優選方面，水解在適合于一種或多種酶的活性，即對于該一種或多種酶來說最佳的 條件下進行。水解可以作為分批補料過程或連續過程進行，其中將預處理的纖維素材料 (底物）逐漸補料至例如含酶的水解溶液中。
[0371] 糖化通常在受控的pH、溫度以及混合條件下在攪拌釜反應器或發酵罐中進行。適 合的處理時間、溫度以及pH條件可以由本領域技術人員容易地確定。例如，糖化可以持續 長達200小時，但是典型地進行優選約12至約96小時，更優選約16至約72小時，并且最優 選約24至約48小時。溫度在優選約25°C至約70°C，更優選約30°C至約65°C，并且更優選 約40°C至約60°C，具體地約50°C的范圍中。pH在優選約3至約8,更優選約3. 5至約7,并 且最優選約4至約6、具體地約pH 5的范圍中。干燥固體含量在優選約5wt %至約50wt %， 更優選約l〇wt%至約40wt%，并且最優選約20wt%至約30wt%的范圍中。
[0372] 該酶組合物優選地包括多種具有纖維素分解活性和/或木聚糖降解活性的酶。在 一個方面，該酶組合物包括一種或多種（若干種）纖維素分解酶。在另一個方面，該酶組合 物包括一種或多種（若干種）木聚糖降解酶。在另一個方面，該酶組合物包括一種或多種 (若干種）纖維素分解酶和一種或多種（若干種）木聚糖降解酶。
[0373] 該一種或多種（若干種）纖維素分解酶優選是選自下組，該組由以下各項組成：內 切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、以及葡糖苷酶。該一種或多種（若干種）木聚糖降解酶 優選是選自下組，該組由以下各項組成：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋 喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。
[0374] 在另一個方面，該酶組合物進一步或甚至進一步包括一種具有纖維素分解增強 活性的多肽（參見，例如 WO 2005/074647、W0 2005/074656、以及 W0 2007/089290)。在 另一個方面，該酶組合物可進一步或甚至進一步包括一種或多種（若干種）另外的酶活 性以改善含纖維素材料的降解。優選的另外的酶是半纖維素酶（例如α-D-葡糖醛酸糖 苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、內切-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、a-半乳糖苷酶、內 切-a -L-阿拉伯聚糖酶、β -半乳糖苷酶）、碳水化合物-酯酶（例如乙酰基-木聚糖酯 酶、乙酰基-甘露聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、葡萄糖醛酸酯酶）、果膠酶、蛋白酶、 木質素分解酶（例如漆酶、錳過氧化物酶、木質素過氧化物酶、Η 202生產酶、氧化還原酶）、擴 張蛋白、膨脹素、或其混合物。在本發明的方法中，可以在發酵之前或過程中，例如在糖化過 程中，或在發酵微生物的繁殖過程中或之后添加這一種或多種另外的酶。
[0375] 該酶組合物的一種或多種（若干種）組分可以是野生型蛋白、重組蛋白、或野生型 蛋白與重組蛋白的組合。例如，一種或多種（若干種）組分可以是用作宿主細胞以重組表達 該酶組合物的一種或多種（若干種）其他組分的細胞的原生蛋白質。該酶組合物的一種或 多種（若干種）組分可以作為單組分產生，然后將這些單組分組合以形成該酶組合物。酶 組合物可以是多組分和單組分蛋白制劑的組合。
[0376] 用于本發明的方法中的酶可以處于適合用于此處所述的過程中的任何形式，例如 像去除或未去除細胞的粗發酵液、具有或不具有細胞碎片的細胞裂解液、半純化的或純化 的酶制劑、或作為酶來源的宿主細胞。酶組合物可以是干粉或顆粒、非塵顆粒、液體、穩定化 的液體、或穩定化的受保護的酶。可以根據已建立的方法例如通過添加如糖、糖醇或其它多 元醇等穩定劑和/或乳酸，對液體酶制劑進行穩定化。
[0377] 這些酶和具有a -葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽的最佳量取決于若干因素，包括但 不限于：多種纖維素分解酶組分的混合物，纖維素底物，纖維素底物的濃度，纖維素底物的 一種或多種預處理、溫度、時間、PH，以及發酵生物（例如，用于同時糖化和發酵的酵母）的 納入。
[0378] 在一個優選方面，一種或多種纖維素分解酶對纖維素材料的有效量是每g纖維素 材料約0. 5至約50mg、優選約0. 5至約40mg、更優選約0. 5至約25mg、更優選約0. 75至約 20mg、更優選約0· 75至約15mg、甚至更優選約0· 5至約10mg、并且最優選約2. 5至約10mg。
[0379] 在另一個優選方面，具有a -葡糖醛酸糖苷酶活性的一種或多種多肽對纖維素材 料的有效量是每g纖維素材料約〇· 01至約50. Omg、優選約0· 01至約40mg、更優選約0· 01 至約30mg、更優選約0. 01至約20mg、更優選約0. 01至約10mg、更優選約0. 01至約5mg、更 優選約〇. 025至約1. 5mg、更優選約0. 05至約1. 25mg、更優選約0. 075至約1. 25mg、更優選 約0. 1至約1. 25mg、甚至更優選約0. 15至約1. 25mg、并且最優選約0. 25至約1. Omg。
[0380] 在另一個優選方面，具有葡萄糖醛酸酯酶活性或α -葡糖醛酸糖苷酶活性的一種 或多種多肽對一種或多種纖維素分解酶的有效量是每g -種或多種纖維素分解酶約〇. 005 至約1. 〇g、優選約0. 01至約1. 〇g、更優選約0. 15至約0. 75g、更優選約0. 15至約0. 5g、更 優選約〇. 1至約〇. 5g、甚至更優選約0. 1至約0. 5g、并且最優選約0. 05至約0. 2g。
[0381] 這些酶可以源自于或得自于任何合適的來源，包括細菌、真菌、酵母、植物、或哺乳 動來源。術語"獲得的"此處意指該酶可以是已從天然產生該酶作為原生酶的生物分離的。 術語"獲得的"在此還意指該酶可能已在宿主生物中采用在此所描的方法重組產生，其中重 組產生的酶對于宿主生物是原生的或外源的，或具有修飾的氨基酸序列，例如，具有一個或 多個（若干個）缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重組產生的酶為原生氨基酸序列的突變 體和/或片段，或通過本領域已知的核酸改組方法產生的酶。原生酶的含義中涵蓋天然變 體，而外源酶的含義中涵蓋重組（如通過定點誘變或改組）獲得的變體。
[0382] 具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽可以是細菌多肽。例如，該多肽 可以是革蘭氏陽性細菌多肽，如具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的芽孢桿菌屬、 鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳酸桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、土芽孢桿菌 屬、或海洋芽孢桿菌屬多肽；或革蘭氏陰性細菌多肽，如具有纖維素分解酶活性或木聚糖降 解活性的大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺旋桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌 屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬、或脲原體屬多肽。
[0383] 在一個優選方面，該多肽是具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的嗜堿芽孢 桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、堅強 芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜 熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、或蘇云金芽孢桿菌多肽。
[0384] 在另一個優選方面，該多肽是具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的似馬鏈 球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種多肽。
[0385] 在另一個優選方面，該多肽是具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的不產色 鏈霉菌、阿維鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、灰色鏈霉菌、或變鉛青鏈霉菌多肽。
[0386] 具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽還可以是真菌多肽，并且更優選 地是一種具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的酵母多肽，如假絲酵母屬（Candida)、 克魯維酵母屬（Kluyveromyces)、畢赤酵母屬（Pichia)、酵母菌屬（Saccharomyces)、 裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母屬（Yarrowia)多肽；或更優選地 是一種具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的絲狀真菌多肽，如枝頂孢霉屬 (Acremonium)、傘菌屬（Agaricus)、鏈格抱屬（Alternaria)、曲霉屬（Aspergillus)、短 梗霉屬（Aureobasidium)、葡萄座腔菌屬（Botryospaeria)、擬錯菌屬（Ceriporiopsis)、 毛_殼屬（Chaetomidium)、金孢子菌屬（Chrysosporium)、麥角菌屬（Claviceps)、旋 孢腔菌屬（Cochliobolus)、鬼傘屬（Coprinopsis)、乳白蟻屬（Coptotermes)、棒囊殼 屬（Corynascus)、隱叢赤殼菌屬（Cryphonectria)、隱球菌屬（Cryptococcus)、色二抱 屬（Diplodia)、黑耳屬（Exidia)、線黑粉酵母屬（Filibasidium)、鐮刀菌屬（Fusarium)、 赤霉屬（Gibberella)、全鞭毛蟲屬（Holomastigotoides)、腐質霉屬（Humicola)、 耙齒菌屬（Irpex)、蘑燕屬（Lentinula)、小腔球菌屬（Leptospaeria)、梨孢菌屬 (Magnaporthe)、黑果菌屬（Melanocarpus)、多孔菌屬（Meripilus)、毛霉屬（Mucor)、毀 絲霉屬（Myceliophthora)、新美鞭菌屬（Neocallimastix)、脈抱菌屬（Neurospora)、擬 青霉屬（Paecilomyces)、青霉菌屬（Penicillium)、平革菌屬（Phanerochaete)、瘤胃 壺菌屬（Piromyces)、某真菌屬（Poitrasia)、假黑盤菌屬（Pseudoplectania)、假披發 蟲屬（Pseudotrichonympha)、根毛霉菌屬（Rhizomucor)、裂裙菌屬（Schizophyllum)、 柱頂孢屬（Scytalidium)、踝節菌屬（Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus)、梭 孢殼霉屬（Thielavia)、彎頸霉屬（Tolypocladium)、木霉屬（Trichoderma)、長毛盤菌 屬（1'1'；[011(^1^63)、輪枝孢屬（￥61'1：；[0；[11；[11111)、小包腳燕屬（￥01￥31^6113)或炭角菌屬 (Xylaria)多肽。
[0387] 在一個優選方面，該多肽是具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的卡爾斯伯 酵母、釀酒酵母、糖化酵母、格拉斯酵母、克魯維酵母、諾地酵母、或卵形酵母多肽。
[0388] 在另一個優選方面，該多肽是具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的解纖維 枝頂孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜 角質金抱子菌、Chrysosporium lucknowense、熱帶金抱子菌、Chrysosporium merdarium、 狹邊金抱子菌（Chrysosporium inops)、租金抱子菌、Chrysosporium queenslandicum、 帶紋金孢子菌（Chrysosporium zonatum)、桿孢狀鐮孢、谷類鐮抱、庫威鐮孢、大刀鐮孢、 禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚 色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、灰腐質霉、特異腐質霉、 疏棉狀腐質霉、白耙齒菌、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙鏈孢菌、繩狀青霉菌、產紫青霉菌、 黃抱平革菌、無色梭抱殼霉（Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、白毛梭抱 殼霉（Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢殼霉、Thielavia fimeti、小孢梭孢殼霉、卵孢梭 孢殼霉、秘魯梭孢殼霉（Thielavia peruviana)、瘤孢梭孢殼霉、毛梭孢殼霉、耐熱梭孢殼 (Thielavia subthermophila)、土生梭孢殼霉、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉、 綠色木霉、或褐孢長毛盤菌（Trichophaea saccata)多肽。
[0389] 還可以使用具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽的化學修飾或蛋白 質工程化的突變體。
[0390] 酶組合物的一種或多種（若干種）組分可以是重組組分，S卩，通過克隆編碼該單一 組分的DNA序列并且隨后用該DNA序列轉化細胞并且在宿主中表達產生（參見，例如，TO 91/17243和W0 91/17244)。優選宿主是異源宿主（酶對于宿主而言是異源的），但是在某 些條件下，宿主還可以是同源宿主（酶對于宿主而言是原生的）。還可以通過純化來自發酵 液的這樣一種蛋白來制備單組分纖維素分解蛋白。
[0391] 適用于在本發明中使用的商業化纖維素分解蛋白制劑的實例包括例如 CELLIC?CTec (諾維信 A/S)、CELLUCLAST?(諾維信 A/S)、N0V0ZYM?188 (諾維信 A/S)、 CELLUZYME?(諾維信 A/S)、CEREFL0?(諾維信 A/S)、以及 ULTRAFL0?(諾維信 A/S)、 ACCELERASE? (杰能科公司（Genencor Int.))、LAMINEX? (杰能科公司）、SPEZYME?CP (杰 能科公司）、R〇HAMENT?7069W (羅姆公司（R5hm GmbH))、FIBREZYMF/D LDI (并矢 國際公司（Dyadic International, Inc. ))、FIBREZYME? LBR(并矢國際公司）、或 VISCOSTAR? 150L(并矢國際公司）。按從固體的約0. 001至約5. Owt%，更優選固體 的從約0. 025至約4. Owt %體，最優選固體的從約0. 005至約2. Owt %的有效量添加這些纖 維素酶。按固體的從約〇. 001至約5. Owt %，更優選固體的從約0. 025至約4. Owt %，最優 選固體的從約0. 005至約2. Owt%的有效量添加這些纖維素酶。
[0392] 可以在本發明的方法中使用的細菌內切葡聚糖酶的實例包括但不限于：解纖維熱 酸菌（Acidothermus cellulolyticus)內切葡聚糖酶（TO 91/05039 ;W0 93/15186 ;美國專 利號 5, 275, 944 ;W0 96/02551 ;美國專利號 5, 536, 655 ;W0 00/70031 ;W0 05/093050);褐 色高溫雙歧菌（Thermobifida fusca)內切葡聚糖酶III (W0 05/093050);以及褐色高溫雙 歧菌內切葡聚糖酶V(W0 05/093050)。
[0393] 可以用于本發明的方法的真菌內切葡聚糖酶的實例包括但不限于：里氏木霉內切 葡聚糖酶 1(彭蒂萊（Penttila)等人，1986,基因 45:253-263 ;GENBANK? 登錄號 M15665); 里氏木霉內切葡聚糖酶Π (薩洛黑莫（Saloheimo)等人，1988,基因63:11-22;GENBANK? 登錄號M19373);里氏木霉內切葡聚糖酶III(奧卡達（Okada)等人，1988,應用與環境微 生物學（Appl. Environ. Microbiol.)64:555-563, GENBANK? 登錄號 AB003694);以及里 氏木霉內切葡聚糖酶V (薩洛黑莫等人，1994,分子微生物學（Molecular Microbiology) 13:219-228, GENBANK?登錄號Z33381);棘孢曲霉內切葡聚糖酶（黃（0oi)等人， 1990,核酸研究18:5884);川地曲霉（spergillus kawachii)內切葡聚糖酶（坂元 (Sakamoto)等人，1995，當代遺傳學（Current Genetics) 27:435-439);胡蘿卜軟腐歐 文氏菌（Erwiniacarotovara)內切葡聚糖酶（薩里拉赫蒂（Saarilahti)等人，1990， 基因90:9-14);尖鐮孢內切葡聚糖酶（GENBANK?登錄號L29381);灰腐質霉高溫變種內 切葡聚糖酶（GENBANK?登錄號AB003107);熱白絲菌（Melanocarpus albomyces)內切 葡聚糖酶（GENBANK?登錄號MAL515703);粗糙鏈孢菌內切葡聚糖酶（GENBANK?登錄號 XM_324477);特異腐質霉內切葡聚糖酶V ;嗜熱毀絲霉CBS 117. 65內切葡聚糖酶；擔子菌 綱（basidiomycete)CBS 495. 95內切葡聚糖酶；擔子菌綱CBS 494. 95內切葡聚糖酶；土生 梭孢殼霉NRRL 8126CEL6B內切葡聚糖酶；土生梭孢殼霉NRRL 8126CEL6C內切葡聚糖酶； 土生梭孢殼霉NRRL 8126CEL7C內切葡聚糖酶；土生梭孢殼霉NRRL 8126CEL7E內切葡聚糖 酶；土生梭抱殼霉 NRRL 8126CEL7F 內切葡聚糖酶；Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373CEL7A內切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株號VTT-D-80133內切葡聚糖酶（GENBANK?登 錄號 M15665)。
[0394] 用于本發明的方法中的纖維二糖水解酶的實例包括但不限于：里氏木霉纖維二糖 水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、特異腐質霉纖維二糖水解酶I、嗜熱毀絲霉纖維二 糖水解酶II、土生梭孢殼霉纖維二糖水解酶II (CEL6A)、嗜熱毛殼菌纖維二糖水解酶I、以 及嗜熱毛殼菌纖維二糖水解酶II。
[0395] 有用于本發明的方法中的β_葡糖苷酶的實例包括但不限于米曲霉β_葡糖苷 酶、煙曲霉菌β-葡糖苷酶、巴西青霉ΙΒΤ 20888 β-葡糖苷酶、黑曲霉β-葡糖苷酶、以及 棘孢曲霉β-葡糖苷酶。
[0396] 具有β -葡糖苷酶活性的米曲霉多肽可根據W0 2002/095014獲得。具有β -葡糖 苷酶活性的煙曲霉菌多肽可根據W0 2005/047499獲得。具有β-葡糖苷酶活性的巴西青 霉多肽可根據W0 2007/019442獲得。具有β-葡糖苷酶活性的黑曲霉多肽可根據丹（Dan) 等人，2000,生物化學雜志（J. Biol. Chem. )275:4973-4980獲得。具有β-葡糖苷酶活性的 棘孢曲霉多肽可根據川口（Kawaguchi)等人，1996,基因（Gene) 173:287-288獲得。
[0397] β-葡糖苷酶可以是一種融合蛋白。在一個方面，β-葡糖苷酶是根據W0 2008/057637獲得的米曲霉β-葡糖苷酶變體BG融合蛋白或米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋 白。
[0398] 其他內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、以及葡糖苷酶披露于使用根據以下 的分類的許多糖基水解酶家族中：亨利薩特· B. (Henrissat Β.)，1991，基于氨基酸序 列相似性的糖基水解酶的分類（A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities),生物化學雜志（Biochem.J.) 280:309-316;以 及亨利薩特· B.和貝洛赫· A. (Bairoch A.)，1996,修正糖基水解酶的基于序列的分類 (Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases),生物化學雜 志 316:695-696。
[0399] 可用在本發明中的其他纖維素分解酶描述于以下中：EP 495,257、EP 531,315、 EP 531，372、TO 89/09259、TO 94/07998、TO 95/24471、TO 96/11262、TO 96/29397、TO 96/034108、TO 97/14804、TO 98/08940、TO 98/012307、TO 98/13465、TO 98/015619、TO 98/015633、TO 98/028411、TO 99/06574、TO 99/10481、TO 99/025846、TO 99/025847、 W0 99/031255, W0 2000/009707, W0 2002/050245, W0 2002/0076792, W0 2002/101078, W0 2003/027306, W0 2003/052054, W0 2003/052055, W0 2003/052056, W0 2003/052057, W0 2003/052118, W0 2004/016760, W0 2004/043980, W0 2004/048592, W0 2005/001065, W0 2005/028636,W0 2005/093050,W0 2005/093073,W0 2006/074005,W0 2006/117432,W0 2007/071818、W0 2007/071820、W0 2008/008070、W0 2008/008793、美國專利號 4, 435, 307、 美國專利號5, 457, 046、美國專利號5, 648, 263、美國專利號5, 686, 593、美國專利號 5, 691，178、美國專利號5, 763, 254、以及美國專利號5, 776, 757。
[0400] 在本發明的方法中，可以使用具有纖維素分解增強活性的任何GH61多肽。
[0401] 在一個第一個方面，具有纖維素分解增強活性的多肽包括以下基序：
[0402] [ILMV]-P-X (4, 5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X (4) - [HNQ]和 [Fff]-[TF] -K-[AIV],
[0403] 其中X是任何氨基酸，X (4, 5)是處于4個或5個連續位置的任何氨基酸，并且X (4) 是處于4個連續位置的任何氨基酸。
[0404] 包括以上提到的基序的多膚可以進一步包括：
[0405] H-X (1，2) -G-P-X (3) - [YW] - [AILMV]、
[0406] [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]、或
[0407] H-X (1，2) -G-P-X (3) - [YW] - [AILMV]以及[EQ] -X-Y-X (2) -C-X- [EHQN] - [FILV] -X-[ILV],
[0408] 其中X是任何氨基酸，X(l，2)是處于1個位置或2個連續位置的任何氨基酸，X (3) 是處于3個連續位置的任何氨基酸，并且X(2)是處于2個連續位置的任何氨基酸。在以上 基序中，采用可接受的IUPAC單一字母氨基酸縮寫。
[0409] 在一個優選方面，具有纖維素分解增強活性的多肽進一步包括 H-X (1，2)-G-P-X (3) -[YW] -[AILMV]。在另一個優選方面，具有纖維素分解增強活性的分離 多肽進一步包括[EQ] -X-Y-X (2) -C-X- [EHQN] - [FILV] -X- [ILV]。在另一個優選方面，具有纖 維素分解增強活性的多肽進一步包括H-X (1，2) -G-P-X (3) -[YW] -[AILMV]和[EQ] -X-Y-X (2 )-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。
[0410] 在一個第二方面，具有纖維素分解增強活性的多肽包括以下基序：
[0411] [ILMV]-P-x(4, 5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-X(3)-A-[HNQ]，
[0412] 其中X是任何氨基酸，X (4, 5)是處于4個或5個連續位置的任何氨基酸，并且X (3) 是處于3個連續位置的任何氨基酸。在以上基序中，采用可接受的IUPAC單一字母氨基酸 縮寫。
[0413] 在本發明的方法中有用的具有纖維素分解增強活性的多肽的實例包括但不限于： 來自土生梭孢殼霉的具有纖維素分解增強活性的多肽（W0 2005/074647)、來自橙色嗜熱子 囊菌的具有纖維素分解增強活性的多肽（W0 2005/074656)、來自里氏木霉的具有纖維素分 解增強活性的多肽（W0 2007/089290)、以及來自嗜熱毀絲霉的具有纖維素分解增強活性的 多肽（TO 2009/085935、TO 2009/085859、TO 2009/085864、TO 2009/085868)。
[0414] 適用于本發明的商業木聚糖降解酶制劑的實例包括：例如SHEARZYME? (諾 維信公司A/S)、CELLICTMHTec (諾維信公司A/S)、VISCOZYME? (諾維信公司A/ s)、ULTRAFLO? (諾維信公司 A/s)、PULPZYME? HC (諾維信公司 Α/s)、 MULTIFECT?i木聚糖酶（杰能科（Genencor))、ECOPULP? TX-200A(AB 酶制劑公 司（AB Enzymes))、HSP 6000木聚糖酶（帝斯曼）、DEP0L?333P(生物催化劑有限公司 (Biocatalysts Limit),英國威爾士（Wales, UK))、DEP0L?740L.(生物催化劑有限公司，英 國威爾士）以及DEP0L?762P(生物催化劑有限公司，英國威爾士）。
[0415] 有用于本發明的方法的木聚糖酶的實例包括但不限于：棘孢曲霉木聚糖酶 (GeneSeqP:AAR63790;W0 94/21785)、煙曲霉木聚糖酶（W0 2006/078256)、以及土生梭孢 殼霉 NRRL 8126 木聚糖酶（W0 2009/079210)。
[0416] 有用于本發明的方法的β_木糖苷酶的實例包括但不限于：里氏木霉β_木糖苷 酶（UniProtKB/TrEMBL登錄號Q92458)、埃默森踝節菌（SwissProt登錄號Q8X212)、以及粗 糙鏈孢菌（SwissProt登錄號Q7S0W4)。
[0417] 有用于本發明的方法的乙酰木聚糖酯酶的實例包括但不限于：紅褐肉座菌 (Hypocrea jecorina)乙酰木聚糖酯酶（W0 2005/001036)、粗糙鏈孢菌乙酰木聚糖酯酶 (UniProt登錄號q7s259)、土生梭孢殼霉NRRL 8126乙酰木聚糖酯酶（W0 2009/042846)、 球毛殼菌乙酰木聚糖酯酶（Uniprot登錄號Q2GWX4)、細毛殼菌（Chaetomium gracile)乙 酰木聚糖酯酶（GeneSeqP登錄號AAB82124)、穎枯殼針孢（Phaeosphaeria nodorum)乙 酰木聚糖酯酶（Uniprot登錄號Q0UHJ1)、以及特異腐質霉DSM 1800乙酰木聚糖酯酶（W0 2009/073709)。
[0418] 有用于本發明的方法的阿魏酸酯酶的實例包括但不限于：特異腐質霉DSM 1800 阿魏酸酯酶（W0 2009/076122)、粗糙鏈孢菌阿魏酸酯酶（UniProt登錄號Q9HGR3)、以及費 希新薩托菌（Neosartorya fischeri)阿魏酸酯酶（UniProt登錄號A1D9T4)。
[0419] 有用于本發明的方法中的阿拉伯呋喃糖苷酶的實例包括但不限于：特異腐質霉 DSM 1800阿拉伯呋喃糖苷酶（W0 2009/073383)以及黑曲霉阿拉伯呋喃糖苷酶（GeneSeqP 登錄號 AAR94170)。
[0420] 有用于本發明的方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的實例包括但不限于：棒曲霉 (Aspergillus clavatus) α -葡糖醒酸糖苷酶（UniProt登錄號alccl2)、里氏木霉α -葡 糖醒酸糖苷酶（Uniprot登錄號Q99024)、埃默森踝節菌α -葡糖醒酸糖苷酶（UniProt登錄 號Q8X211)、黑曲霉α-葡糖醒酸糖苷酶（Uniprot登錄號Q96WX9)、土曲霉（Aspergillus terreus) α -葡糖醒酸糖苷酶（SwissProt登錄號Q0CJP9)、以及煙曲霉α -葡糖醒酸糖苷 酶（SwissProt 登錄號 Q4WW45)。
[0421] 有用于本發明的方法的酶和蛋白質可以通過在含有適合碳源和氮源以及無機鹽 的營養培養基上，使用本領域中已知的程序發酵上述微生物菌株來產生（參見，例如，班尼 特· J. W. (Bennett，J. W.)和拉熱· L. (LaSure，L.)(編輯），真菌中的更多基因操縱（More Gene Manipulations in Fungi),學術出版社，加利福尼亞州，1991)。適合的培養基可從 商業供應商獲得或可以根據公開的組成（例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中）制 備。適合用于生長和酶產生的溫度范圍和其他條件在本領域中是已知的（參見，例如，貝 利· J. E. (Bailey, J. E.)和奧利斯· D. F. (Ollis，D. F.)，生物化學工程基礎（Biochemical Engineering Fundamentals)，麥格勞-希爾圖書公司（McGraw-Hill Book Company)，紐約， 1986)。
[0422] 發酵可以是導致酶表達或分離的任何細胞培養方法。所以，可以將發酵理解為包 括搖瓶培養，或者在一種適合的培養基中并且在允許表達或分離該酶的條件下在實驗室或 工業發酵罐中進行小規模或大規模發酵（包括連續發酵、分批發酵、分批補料發酵或固態 發酵）。通過上述方法產生的所得酶可以從發酵培養基回收并且通過常規程序純化。
[0423] 發酵。可以通過能夠將糖直接或間接發酵成所希望的發酵產物的一種或多種(若 干種）發酵微生物發酵從水解的纖維素材料獲得的可發酵糖。"發酵"或"發酵過程"是指 任何發酵過程或包括發酵步驟的任何過程。發酵方法還包括用于消費性醇工業（例如啤酒 和葡萄酒）、乳品工業（例如發酵的乳制品）、皮革工業和煙草工業的發酵方法。發酵條件 取決于所希望的發酵產物和發酵生物體，并且可以由本領域的普通技術人員容易地確定。
[0424] 在發酵步驟中，預處理和酶水解步驟所導致的從纖維素材料釋放的糖由發酵生物 (如酵母）發酵成一種產物，例如，乙醇。如上所述，水解（糖化）和發酵可以是分開的或同 時的。
[0425] 在實踐本發明的發酵步驟中可以使用任何適合的水解的纖維素材料。通常基于所 希望的發酵產物（即，要從發酵獲得的物質）和所采用的方法來選擇材料，如本領域中所熟 知的。
[0426] 術語"發酵培養基"在此可理解為指在添加一種或多種發酵微生物之前的培養基， 如，由糖化過程產生的培養基，以及在同時糖化和發酵過程（SSF)中使用的培養基。
[0427] "發酵微生物"是指適用于所希望的發酵方法以產生發酵產物的任何微生物，包括 細菌和真菌生物體。發酵生物可以是(：6和/或(：5發酵生物、或其組合。（：6和(： 5發酵生物 二者均是本領域中所熟知的。適合的發酵微生物能夠將糖（如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉 伯糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、或寡糖）直接或間接地發酵（即，轉化）成所希望的發酵產 物。
[0428] 產生乙醇的細菌和真菌發酵生物的實例由琳（Lin)等人，2006,應用微生物學與 生物技術69:627-642描述。
[0429] 能夠發酵C6糖的發酵微生物的實例包括細菌生物和真菌生物，如酵母。優選的酵 母包括酵母菌屬菌株，優選釀酒酵母。
[0430] 能夠發酵C5糖的發酵生物的實例包括細菌生物和真菌生物，如酵母。優選的 C5發酵酵母包括畢赤酵母屬的菌株，優選樹干畢赤酵母，例如樹干畢赤酵母CBS 5773 ; 假絲酵母屬的菌株，優選博伊丁假絲酵母（Candida boidinii)、蕓薹假絲酵母（Candida brassicae)、休哈塔假絲酵母（Candida sheatae)、迪丹斯假絲酵母（Candida diddensii)、 假熱帶假絲酵母（Candida pseudotropicalis)、或產朊假絲酵母（Candida utilis)。
[0431] 其他發酵生物包括發酵單胞菌屬的菌株，例如運動發酵單胞菌；漢遜酵母屬，例如 異常漢森酵母；克魯維酵母屬，例如脆壁克魯維酵母（K.fragilis);裂殖酵母屬，例如粟酒 裂殖酵母（S.pombe);以及大腸桿菌，尤其已被遺傳修飾以提高乙醇產率的大腸桿菌菌株。
[0432] 在一個優選方面，酵母是酵母菌屬種。在一個更優選方面，酵母是釀酒酵母。在另 一個更優選方面，酵母是糖化酵母（Saccharomyces distaticus)。在另一個更優選方面，酵 母是葡萄汁酵母（Saccharomyces uvarum)。在另一個優選方面，酵母是克魯維酵母屬。在 另一個更優選方面，酵母是馬克斯克魯維酵母。在另一個更優選方面，酵母是脆壁克魯維酵 母。在另一個優選方面，酵母是假絲酵母。在另一個更優選方面，酵母是博伊丁假絲酵母。 在另一個更優選方面，酵母是蕓薹假絲酵母。在另一個更優選方面，酵母是迪丹斯假絲酵 母。在另一個更優選方面，酵母是假熱帶假絲酵母。在另一個更優選方面，酵母是產朊假絲 酵母。在另一個優選方面，酵母是棒孢酵母屬（Clavispora)。在另一個更優選方面，酵母是 葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae)。在另一個更優選方面，酵母是仙人掌棒孢酵母 (Clavispora opuntiae)。在另一個優選方面，酵母是管囊酵母屬。在另一個更優選方面， 酵母是嗜鞣管囊酵母。在另一個優選方面，酵母是畢赤酵母屬。在另一個優選方面，酵母是 樹干畢赤酵母。在另一個優選方面，酵母是酒香酵母屬（Bretannomyces)。在另一個更優選 方面，酵母是克勞森酒香酵母（菲利皮迪斯· G. P. (Philippidis，G. P.)，1996,纖維素生物 轉化技術（Cellulose bioconversion technology)，生物乙醇手冊：生產和利用（Handbook on Bioethanol :Production and Utilization)，懷曼.C.E (Wyman, C.E.)編輯，泰勒-弗朗 西斯出版集團（Taylor&Francis)，華盛頓特區（Washington, DC)，179-212))。
[0433] 能夠有效地將己糖和戊糖發酵成乙醇的細菌包括，例如，運動發酵單胞菌和熱纖 維梭菌（Clostridium thermocellum)(菲利皮迪斯，1996,見上文）。
[0434] 在一個優選方面,細菌是發酵單胞菌屬。在一個更優選方面,細菌是運動發酵單胞 菌。在另一個優選方面，細菌是梭菌屬。在另一個更優選方面，細菌是熱纖維梭菌。
[0435] 適于乙醇生產的可商購的酵母包括，例如乙醇紅酵母（ETHANOL RED?yeast)(可 從富酶泰斯/樂斯富（Fermentis/Lesaffre)，USA獲得）、FALI?(可從弗萊施曼酵母 (Fleischmann，s Yeast)，USA 獲得）、SUPERSTART? 和 THERM0SACC? 新鮮酵母（可從乙醇 技術（Ethanol Technology)，WI，USA)、BI0FERM?AFT 和 XR(可從 NABC-北美生物產品公司 (North American Bioproducts Corporation), GA，USA 獲得）、GERT STRAND?(可從 Gert Strand AB，瑞典獲得）、以及FERMI0L?(可從帝斯曼食品配料部（DSM Specialties)獲得）。
[0436] 在一個優選方面，發酵微生物已經經過遺傳修飾，以提供發酵戊糖的能力，如利用 木糖的微生物、利用阿拉伯糖的微生物、以及共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
[0437] 將異源基因克隆到多種發酵微生物中已經構建出能夠將己糖和戊糖轉化成乙 醇（共發酵）的生物（陳（Chen)和霍（Ho)，1993,釀酒酵母中畢赤酵母木糖還原酶基 因的克隆和改善表達（Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae)，應用生物化學與生物技術 (Appl. Biochem. Biotechnol. )39-40:135-147 ;霍等人，1998,能夠有效共發酵葡萄糖和 木糖的遺傳工程化的酵母菌屬酵母（Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose)，應用與環境微生物學 64:1852-1859;科特（Kotter)和西拉塞（Ciriacy)，1993,釀酒酵母發酵木糖（Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae),應用微生物學與生物技術（八卩卩1· Microbiol. Biotechnol.) 38:776-783 ;維爾福森（Walfridsson)等人，1995，過表達編 碼戊糖磷酸途徑酶轉酮醇酶和轉醛醇酶的TKL1和TALI基因的木糖代謝釀酒酵母菌 株(Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKLland TALlgenes encoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase)，應用與環境微生物學 61:4184-4190;凱拍（Kuyper)等人，2004,用 于有效厭氧木糖發酵的釀酒酵母的最小代謝工程化：原理的證實（Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation:a proof of principle)，歐洲微生物學會聯合會酵母研究（FEMS Yeast Research)4:655_664;比爾（Beall)等人，1991，通過重組大腸桿菌從木糖和其他糖產 生乙酉享的參數石開究（Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli)，生物技術與生物工程（Biotech. Bioeng. )38:296-303;英格拉姆（Ingram)等人，1998,用于乙醇產生的細菌的代謝工 程化（Metabolic engineering of bacteria for ethanol production)，生物技術與 生物工程58:204-214 ;張（Zhang)等人，1995,產生乙醇的運動發酵單胞菌中戊糖代謝 途徑的代謝工程化（Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis)，科學（Science)267:240_243;狄安妲（Deanda)等 人，1996,通過代謝途徑工程化開發發酵阿拉伯糖的運動發酵單胞菌菌株（Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering)，應用與環境微生物學62:4465-4470 ;W0 2003/062430,木糖異構酶）。
[0438] 在一個優選方面，遺傳修飾的發酵微生物是釀酒酵母。在另一個優選方面，遺傳修 飾的發酵微生物是運動發酵單胞菌。在另一個優選方面，遺傳修飾的發酵微生物是大腸桿 菌。在另一個優選方面，遺傳修飾的發酵微生物是產酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca)。 在另一個優選方面，遺傳修飾的發酵微生物是克魯維酵母屬。
[0439] 本領域中熟知的是，以上所描述的生物體還可以用于產生其他物質，如在此所描 述。
[0440] 典型地向降解的木質纖維素或水解物中添加發酵微生物，并且進行發酵持續約8 至約96小時，例如約24至約60小時。溫度典型地在約26°C至約60°C之間，具體地約32°C 或50°C，并且在約pH 3至約pH 8,例如pH 4至5、6、或7左右。
[0441] 在一個優選方面，對降解的纖維素材料施用酵母和/或另一種微生物，并且進行 發酵持續約12至約96小時，如典型地24至60小時。在一個優選方面，溫度優選在約20°C 至約60°C之間，更優選約25°C至約50°C，并且最優選約32°C至約50°C，具體地約32°C或 50°C，并且pH通常是從約pH 3至約pH 7,優選地在pH 4-7左右。然而，一些發酵生物 (例如細菌）具有更高的最適發酵溫度。酵母或另一種微生物優選以每ml發酵液大約105 至1〇12,優選從大約1〇7至1〇1(1，特別是大約2X10 8個活細胞計數的量施用。關于使用酵 母進行發酵的進一步指南可以見于例如"醇教材"（"The Alcohol Textbook"）（K ·雅克 (K. Jacques)、Τ· Ρ·里昂（Τ· P. Lyons)以及 D. R.凱爾索爾（D. R. Kelsall)編輯，諾丁漢大 學出版社（Nottingham University Press)，聯合王國（United Kingdom) 1999)，其通過引 用結合在此。
[0442] 對于乙醇生產，在發酵之后，蒸餾發酵的漿料以萃取乙醇。根據本發明的方法獲得 的乙醇可用作例如燃料乙醇、飲用乙醇，即可飲用的酒精，或工業乙醇。
[0443] 發酵刺激劑可以與在此所描述的任何方法組合使用，以進一步改進發酵方法，特 別是改進發酵微生物的性能，如，提高速度和乙醇產率。"發酵刺激劑"是指用于發酵微生 物（特別是酵母）生長的刺激劑。用于生長的優選發酵刺激劑包括維生素和礦物質。維 生素的實例包括多種維生素、生物素、泛酸鹽（酯）、煙酸、內消旋肌醇、硫胺、吡哆醇、對 氨基苯酸、葉酸、核黃素、以及維生素 A、B、C、D和E，例如參見阿爾弗雷多（Alfenore)等 人，通過在分批補料方法過程中的一種維生素補料策略改進乙醇產生和釀酒酵母的存活 力(Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisia by a vitamin feeding strategy during fed-batch process)，施普林格（2002)，其通過引用結 合在此。礦物質的實例包括可以供應包含P、K、Mg、S、Ca、Fe、Ζη、Μη和Cu營養素的礦物質 和礦物鹽。
[0444] 發酵產物：發酵產物可以是由發酵得到的任何物質。該發酵產物可以是（不限 制）一種醇（例如，阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、丙三醇（glycerol)、甲醇、1，3_丙二醇、山梨 糖醇、以及木糖醇）；一種有機酸（例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2, 5-二 酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康 酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸、以及木糖酸）；一種酮（例如，丙 酮）；一種氨基酸（例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸、以及蘇氨酸）；以及一 種氣體（例如，甲烷、氫氣（?)、二氧化碳（C0 2)、以及一氧化碳（C0))。發酵產物還可以是 作為高價值產物的蛋白。
[0445] 在一個優選的方面，發酵產物是一種醇。將理解，術語"醇"涵蓋含有一個或多個 羥基部分的物質。在一個更優選方面，該醇是阿拉伯糖醇。在另一個更優選方面，該醇是丁 醇。在另一個更優選方面，該醇是乙醇。在另一個更優選方面，該醇是甘油。在另一個更優 選方面，該醇是甲醇。在另一個更優選方面，該醇是1，3_丙二醇。在另一個更優選方面， 該醇是山梨糖醇。在另一個更優選方面，該醇是木糖醇。參見，例如，貢*C.S.、卡奧·Ν. J.、杜· J.、以及曹· G. Τ.，1999,由可再生資源生產乙醇，生物化學工程/生物技術的進展， 舍佩爾· Τ.編輯，施普林格，德國海德堡柏林，65:207-241 ;西爾韋拉·Μ.Μ. (Silveira，M. Μ·)和喬納斯· R. (Jonas, R. )，2002,山梨糖醇的生物技術生產（The biotechnological production of sorbitol)，應用微生物學與生物技術 59:400-408;尼加姆·Ρ· (Nigam，P.) 和辛格· D.，1995,用于木糖醇-一種糖替代品的發酵產生工藝（Processes for fermentative production of xylitol - a sugar substitute),力口工生物化學（Process Biochemistry) 30 (2) : 117-124 ;伊澤吉· T. C. (Ezeji, T. C.)、庫雷希· N. (Qureshi, Ν·)和 布拉舍克·Η.Ρ. (Blaschek，H.P. )，2003,通過拜季林斯基羧菌BA101生產丙酮、丁醇和乙醇 并且通過氣提原位回收（Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BAlOland in situ recovery by gas stripping)，微生物與生物技術世界 雜志（World Journal of Microbiology and Biotechnology) 19(6): 595-603。
[0446] 在另一個優選方面，發酵產物是有機酸。在另一個更優選方面，該有機酸是乙酸。 在另一個更優選方面，該有機酸是醋酮酸。在另一個更優選方面，該有機酸是己二酸。在另 一個更優選方面，該有機酸是抗壞血酸。在另一個更優選方面，該有機酸是檸檬酸。在另 一個更優選方面，該有機酸是2, 5-二酮-D-葡糖酸。在另一個更優選方面，該有機酸是甲 酸。在另一個更優選方面，該有機酸是反丁烯二酸。在另一個更優選方面，該有機酸是葡糖 二酸。在另一個更優選方面，該有機酸是葡糖酸。在另一個更優選方面，該有機酸是葡糖 醛酸。在另一個更優選方面，該有機酸是戊二酸。在另一個更優選方面，該有機酸是3-二 羥基丙酸。在另一個更優選方面，該有機酸是衣康酸。在另一個更優選方面，該有機酸是 乳酸。在另一個更優選方面，該有機酸是蘋果酸。在另一個更優選方面，該有機酸是丙二 酸。在另一個更優選方面，該有機酸是草酸。在另一個更優選方面，該有機酸是丙酸。在另 一個更優選方面，該有機酸是琥珀酸。在另一個更優選方面，該有機酸是木糖酸。參見，例 如，陳，· R. (Chen，R.)和李· Y. Y.，1997,用于由纖維素生物質產生乳酸的膜介導的萃取發 酵（Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass)，應用生物化學與生物技術63-65:435-448。
[0447] 在另一個優選方面，發酵產物是一種酮。應理解的是，術語"酮"涵蓋包含一個或 多個酮部分的物質。在另一個更優選方面，該酮是丙酮。參見，例如，庫雷希和布拉舍克， 2003,見上文。
[0448] 在另一個優選方面，發酵產物是一種氨基酸。在另一個更優選方面，該有機酸是天 冬氨酸。在另一個更優選方面，該氨基酸是谷氨酸。在另一個更優選方面，該氨基酸是甘 氨酸。在另一個更優選方面，該氨基酸是賴氨酸。在另一個更優選方面，該氨基酸是絲氨 酸。在另一個更優選方面，該氨基酸是蘇氨酸。參見，例如，理查德·Α. (Richard, A.)和馬 加里蒂斯·Α. (Margaritis，A. )，2004,用于聚（谷氨酸）產生和其他微生物生物聚合物的 分批發酵動力學的經驗模型（Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly (glutamic acid) production and other microbial biopolymers),生物技術與生物 工程 87 (4) : 501-515。
[0449] 在另一個優選方面，發酵產物是一種氣體。在另一個更優選方面，該氣體是甲烷。 在另一個更優選方面，該氣體是H 2。在另一個更優選方面，該氣體是C02。在另一個更優 選方面，該氣體是C0。參見，例如，片岡· N. (Kataoka, N. )、A ·米亞（A. Miya)、以及K ·桐 山（K.Kiriyama)，1997,關于通過產氫厭氧細菌連續培養系統產生氫氣的研究（Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria)，水科學與技術（Water Science and Technology) 36 (6-7) :41-47 ; 以及古那森蘭· V. N. (Gunaseelan V. N.)，生物質與生物能源（Biomass and Bioenergy)， 第13 (1-2)卷，第83-114頁，1997,用于甲燒生產的生物質的厭氧消化：綜述（Anaerobic digestion of biomass for methane production:A review)〇
[0450] Μ收。可以使用本領域中已知的任何方法可任選地從發酵培養基回收一種或多種 發酵產物，這些方法包括但不限于，色譜法、電泳程序、差別溶解度、蒸餾、或萃取。例如，通 過常規蒸餾方法從發酵的纖維素材料中分離和純化醇。可以獲得具有高達約96vol. %的純 度的乙醇，這可以用作例如燃料乙醇、引用乙醇，即飲用中性乙醇、或工業乙醇。
[0451] 信號肽
[0452] 本發明還涉及編碼一種信號肽的一種分離的多核苷酸，該信號肽包括SEQ ID N0:2的氨基酸1至22、SEQIDN0:4的氨基酸1至20、SEQIDN0:4的氨基酸1至15或SEQ ID N0:8的氨基酸1至22或由其組成。所述多核苷酸可以進一步包括編碼蛋白質的基因， 所述蛋白質與信號肽和/或前肽可操作地連接。該蛋白質優選地對于該信號肽來說是外源 的。在一個方面，編碼該信號肽的多核苷酸是SEQ ID N0:1的核苷酸1至66、SEQ ID N0:3 的氨基酸1至60、SEQ ID NO :5的氨基酸1至45、SEQ ID NO :7的氨基酸1-81。
[0453] 本發明還涉及包括這些多核苷酸的核酸構建體、表達載體及重組宿主細胞。
[0454] 本發明還涉及產生蛋白的方法，該方法包括：（a)對包括這種多核苷酸的重組宿 主細胞進行培養；并且（b)回收該蛋白質。
[0455] 該蛋白質對于宿主細胞來說可以是原生的或異源的。術語"蛋白質"在此不意圖 是指一種特定長度的編碼產物，并且因此涵蓋肽、寡肽及多肽。術語"蛋白質"還涵蓋組合 形成編碼的產物的兩個或更多個多肽。這些蛋白質還包括雜合多肽和融合多肽。
[0456] 優選的是，蛋白質是激素或其變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分、或報道子。 舉例來說，該蛋白質可以是一種水解酶、異構酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶或轉移酶，例 如氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多 糖酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、內切葡聚糖酶、酯酶、α -半乳糖苷酶、 β_半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷 酶、變聚糖酶（mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解 酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β_木糖苷酶。
[0457] 該基因可以從任何原核、真核或其他來源獲得。
[0458] 通過以下實例進一步描述本發明，這些實例不應當解釋為限制本發明的范圍。
[0459] 實例
[0460] 菌株
[0461] 此處包括的酶是從包括以下各項的不同范圍的微生物分離的：構巢裸孢殼菌（SEQ ID N0:l+2)、黑曲霉（SEQ ID Ν0:3+4)、橘灰青霉（SEQ ID Ν0:5+6)、約氏黃桿菌（SEQ ID N0:7+8)、一色齒毛菌（SEQ ID N0:9+10)、紅褐肉座菌（SEQ ID N0:ll+12)、球毛殼菌（SEQ ID NO:13+14)〇
[0462] 培養基和溶液
[0463] 此處提供的反應條件、介質和溶液納入用于啟發，并且在技術人員發現適用時，可 被替代方法、反應條件、介質替換。
[0464] 水解條件
[0465]
【權利要求】
1. 一種具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的分離的多肽，該多肽選自下組，該組由以下各 項組成： (a) -種多肽，該多肽與SEQ ID Ν0:2的成熟多肽具有至少80%、至少85%、至少90%、 至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至 少99%、或100%序列一致性；或 與SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、 或100 %序列一致性；或 與SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、 或100 %序列一致性；或 與SEQ ID N0:8的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至 少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性； (b) 由一種多核苷酸編碼的一種多肽，該多核苷酸在高嚴謹度條件或非常高嚴謹度條 件下與⑴SEQ ID N0:1的成熟多肽編碼序列、（ii)其cDNA序列、或（iii)⑴或（ii)的 全長互補體雜交；或 或在非常高嚴謹度條件下與（iv)SEQ ID勵:3的成熟多肽編碼序列、（0其(^嫩序列、 或（vi) (iv)或（v)的全長互補體雜交； 或在非常高嚴謹度條件下與（vii)SEQ ID N0:5的成熟多肽編碼序列、（viii)其cDNA 序列、或（ix) (vii)或（viii)的全長互補體雜交； 或在中嚴謹度條件、中-高嚴謹度條件、高嚴謹度條件、或非常高嚴謹度條件下，與（X) SEQ ID NO:7的成熟多肽編碼序列、（xi)其cDNA序列、或（xii) (X)或（xi)的全長互補體 雜交； (c) 由一種多核苷酸所編碼的一種多肽，該多核苷酸與SEQ ID NO: 1的成熟多肽編碼序 列或其cDNA序列具有至少80 %、至少85 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至 少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一 致性；或 與SEQ ID N0:3的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少90%、至少91%、至少 92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% 序列一致性；或 與SEQ ID N0:5的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少85%、至少90%、至少 91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99 %或100 %序列一致性；或 與SEQ ID N0:7的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少80%、至少85%、至少 85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性； (d) SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6或SEQIDN0:8的成熟多肽的一種變體， 該變體在一個或多個位置處包括取代、缺失、和/或插入；以及 (e) (a)、（b)、（c)或（d)的多肽的一個片段，該片段具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性。
2. 如權利要求1所述的多肽，該多肽包括序列SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID Ν0:6 或SEQ ID N0:8中的一個或由其組成。
3. 如權利要求1或2所述的多肽，該多肽包括序列SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6或SEQ ID N0:8中的一個的成熟多肽或由其組成。
4. 如權利要求3所述的多肽，其中該成熟多肽是SEQ ID NO: 2的氨基酸23至702、SEQ ID NO:4的氨基酸21至696、SEQ ID NO:6的氨基酸16至690、SEQ ID NO:8的氨基酸33 至 708。
5. 如權利要求1-4中任一項所述的多肽，該多肽是SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6或SEQ ID N0:8的一個片段，其中該片段具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性。
6. -種組合物，該組合物包括如權利要求1-5中任一項所述的多肽。
7. 如權利要求6所述的組合物，該組合物進一步包括具有葡萄糖醛酸酯酶活性的一種 多肽。
8. 如權利要求7所述的組合物，其中該具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽選自下組，該 組由以下各項組成： (a) -種多肽，該多肽與SEQ ID N0:10的成熟多肽具有至少80%、至少85%、至少 90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少 98%、至少99%、或100%序列一致性；或 與SEQ ID NO: 12的成熟多肽具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98 %、至少 99%、或100%序列一致性；或 與SEQ ID NO: 14的成熟多肽具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%、或100%序列一致性；或 (b) 由一種多核苷酸編碼的一種多肽，該多核苷酸在高嚴謹度條件或非常高嚴謹度條 件下與⑴SEQ ID N0:9的成熟多肽編碼序列、（ii)其cDNA序列、或（iii)⑴或（ii)的 全長互補體雜交；或 或在非常高嚴謹度條件下與（iv)SEQ ID NO: 11的成熟多肽編碼序列、（v)其cDNA序 列、或（vi) (iv)或（v)的全長互補體雜交； 或在非常高嚴謹度條件下與（vii)SEQ ID NO: 13的成熟多肽編碼序列、（viii)其cDNA 序列、或（ix) (vii)或（viii)的全長互補體雜交； (c) 由一種多核苷酸所編碼的一種多肽，該多核苷酸與SEQ ID NO:9的成熟多肽編碼序 列或其cDNA序列具有至少80 %、至少85 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至 少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一 致性；或 與SEQ ID NO: 11的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少90%、至少91 %、至少 92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% 序列一致性；或 與SEQ ID NO: 13的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少85%、至少90%、至少 91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%或100%序列一致性；或 (d) SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 14的成熟多肽的一種變體，該變體在 一個或多個位置處包括取代、缺失、和/或插入；以及 (e) (a)、（b)、（c)或（d)的多肽的一個片段，該片段具有葡萄糖醛酸酯酶活性。
9. 如權利要求7或8所述的組合物，其中該具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽包括序列 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12 或 SEQ ID NO: 14 中的一個或由其組成。
10. 如權利要求7至9中任一項所述的組合物，其中該具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽 包括序列SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 14中的一個的成熟多肽或由其組成。
11. 如權利要求10所述的組合物，其中該具有葡萄糖醛酸酯酶活性的成熟多肽是SEQ ID NO: 10的氨基酸101至474、SEQ ID NO: 12的氨基酸94至460或SEQ ID NO: 14的氨基 酸21至392。
12. 如權利要求7至11中任一項所述的組合物，其中該具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多 肽是SEQIDN0:10、SEQIDN0 :12或SEQIDN0:14的一個片段，其中該片段具有葡萄糖醛 酸酯酶活性。
13. -種分離的多核苷酸，該多核苷酸編碼如權利要求1-5中任一項所述的多肽。
14. 一種核酸構建體或表達載體，該核酸構建體或表達載體包括如權利要求13所述的 多核苷酸，該多核苷酸可操作地連接至指導該多肽在一個表達宿主內的產生的一個或多個 控制序列。
15. -種重組宿主細胞，該重組宿主細胞包括如權利要求13所述的多核苷酸，該多核 苷酸可操作地連接至指導該多肽的產生的一個或多個控制序列。
16. -種產生具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽的方法，該方法包括： (a) 在有益于產生該多肽的條件下培養如權利要求15所述的宿主細胞；并且 (b) 回收該多肽。
17. -種用于降解或轉化纖維素材料的方法，包括：在如權利要求1-5中任一項所述的 具有α -葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽的存在下，用一種酶組合物處理該纖維素材料。
18. -種用于降解或轉化纖維素材料的方法，該方法包括：用如權利要求6至12中任 一項所述的酶組合物處理該纖維素材料。
【文檔編號】C12N9/24GK104245929SQ201380021031
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年4月22日 優先權日:2012年4月23日
【發明者】J.波杰森, A.維克索-尼爾森, N.斯波德斯伯格, K.B.R.M.克羅格 申請人:諾維信公司