疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體、編碼基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體、編碼序列及其應用。所述一種疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體，由序列如SEQ?ID?No.1的肽段經點突變獲得，所述的點突變為下列之一或兩者結合：（1）第63位的S突變為L或M；（2）第232位的D突變為A。本發明提供的疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體較親本活力大幅提高，可用于工業化生產(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，從而進一步合成普瑞巴林。
【專利說明】疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體、編碼基因及其應用
(-)【技術領域】
[0001]本發明涉及一組疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體、編碼基因，及其在水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制備普瑞巴林關鍵手性中間體(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的應用。
(二)【背景技術】
[0002]普瑞巴林(Pregabalin,簡稱PGB),化學名為(S) -(+) _3_氨甲基_5_甲基己酸(I )，屬 Y -氨基丁酸的 3 位異丁基取代物(Angew.Chem.1nt.Ed.2008, 47:3500-3504)。普瑞巴林是一種鈣離子通道調節劑，能夠有效抑制與神經病理性疼痛、癲癇相關的神經元過度興奮及神經遞質釋放增加(Curr.0pin.Pharmacol.2006, 6:108-113)，已被FDA批準用于帶狀皰疹后神經痛、糖尿病外周神經痛、癲癇、纖維肌痛等。與傳統藥物相比，普瑞巴林的劑量更低、服用次數少、副作用小、持續時間長、耐受性強(Curr.Med.Res.0pin.2006, 22:375-384)，因此被國際疼痛學會(IASP)、歐洲神經病學學會聯盟(EFNS)和英國NICE等多個國際指南推薦為一線治療藥物。自上市以來，普瑞巴林全球銷售額快速增長，成為全球暢銷藥市場的“重磅炸彈”，2012年全球銷售額已突破40億美元，市場前景十分廣闊。
[0003]國內外報道了大量有關普瑞巴林及其中間體化學合成工藝，可歸為、不對稱催化法、手性拆分法手性配體法和手性化合物直接合成法等四大類。化學法由于工藝步驟冗長、手性拆分試劑昂貴 、反應條件苛刻、有毒有害溶劑用量大，而無法實現規模化生產。生物催化法由于反應條件溫和、立體選擇性高、環境友好等優點成為最受矚目的醫藥及精細化學品合成技術之一。輝瑞公司開發的普瑞巴林生產工藝引入脂肪酶Lipolase催化拆分外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯生成(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸
(II)。該手性中間體經脫羧、堿性水解、氫化等步驟制得普瑞巴林(I) (Org.Process Res.Dev.2008，12:392-398 ；US20050283023 ；US8134023B2)。
[0004]
【權利要求】
1.一種疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體，由序列如下的肽段經點突變獲得:RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVD AADATFLYSF EDSGLGDVTGLLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLNA DLTEISDICS GCEGHDGFVT SffRSVADTIR EQVQNAVNEHPDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPR VGNRAFAEFL TAQTGGTLYR ITHTNDIVPRLPPRDffGYSH SSPEYffVTSG NDVPVTANDI TVVEGIDSTD GNNQGNIPDI PSHLffYFGPI SECD ;所述的點突變為下列之一或兩者結合:(I)第63位的S突變為L或M ; (2)第232位的D突變為A0
2.如權利要求1所述的疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體，其特征在于所述嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體序列如下:RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVDAADATFLYSF EDLGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLNA DLTEISDICS GCEGHDGFVTSffRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPR VGNRAFAEFLTAQTGGTLYR ITHTNDIVPR LPPRDffGYSH SSPEYffVTSG NAVPVTANDI TVVEGIDSTD GNNQGNIPDIPSHLffYFGPI SECD。
3.如權利要求1所述的疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體，其特征在于所述嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體序列如下:RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVDAADATFLYSF EDLGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLNA DLTEISDICS GCEGHDGFVTSffRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPR VGNRAFAEFLTAQTGGTLYR ITHTNDIVPR LPPRDffGYSH SSPEYffVTSG NDVPVTANDI TVVEGIDSTD GNNQGNIPDIPSHLffYFGPI SECD。
4.如權利要求1所述的疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體，其特征在于所述嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體序列如下:RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVDAADATFLYSF EDMGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLNA DLTEISDICS GCEGHDGFVTSffRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPR VGNRAFAEFLTAQTGGTLYR ITHTNDIVPR LPPRDffGYSH SSPEYffVTSG NAVPVTANDI TVVEGIDSTD GNNQGNIPDIPSHLffYFGPI SECD。
5.編碼權利要求1~4之一所述疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體的基因。
6.如權利要求5所述的基因，其特征在于所述基因為下列之一:SEQ ID N0.4，SEQ IDN0.6，SEQ ID N0.8。
7.如權利要求1所述的疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體在水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制備普瑞巴林關鍵手性中間體(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的應用。
【文檔編號】C12P13/00GK103981160SQ201410032400
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年1月23日 優先權日:2014年1月23日
【發明者】鄭裕國, 鄭仁朝, 黎小軍, 馬紅葉, 沈寅初 申請人:浙江工業大學