專利名稱：表達嗜熱子囊菌光孢變種lgh基因的畢赤酵母工程菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程，具體地說是一種表達嗜熱子囊菌光孢變種Thermoascu aurantiacus var. Ievisporus熱穩定脂肪酶基因Igh的畢赤酵母工程菌株 Pichiapastoris GS-TA-LGH。背景技術：
脂肪酶(lipase)全稱三酰甘油酰基水解酶，屬于α/β折疊酶家族。它能夠分解生物產生的各種天然油和脂肪，在生物體內參與胞內脂的代謝等重要生命活動。脂肪酶的應用涉及洗滌劑、食品、油脂、皮革、醫藥等工業，近些年來又被研究用于制備化學方法難以得到的手性化合物，以及用于生產作為綠色可再生能源的生物柴油，使得它再度成為生物及化工工業的研究熱點。因為微生物脂肪酶種類多、周期短，耐受性好且易于工業生產，所以在酶理論研究和工業應用中有著更重要的作用。
嗜熱子囊菌光抱變種(Thermoascusaurantiacus var. blevisporus)在以撤攬油為誘導源的培養基中50°C條件下可以產生熱穩定的脂肪酶，但要使之用于規模化工業生產，還存在一些尚未解決的問題。如嗜熱子囊菌光孢變種培養條件比較苛刻，高溫發酵需要特殊設備，產酶效率低，造成成本增加，因此限制了它的應用。解決這一問題的有效途徑是應用分子生物學手段，將嗜熱子囊菌光孢變種熱穩定脂肪酶基因導入常溫酵母中高效表達，利用酵母生長快、易于培養等特點，使熱穩定脂肪酶基因在常溫和短時間內快速、大量表達，期望達到降低能耗和提高經濟效益的目的。
發明內容
本發明以嗜熱子囊菌光抱變種(Thermoascusaurantiacus var. levisporus)為材料獲得一種脂肪酶基因，命名為lgh，全長cDNA為1009bp，包含一個由894個核苷酸構成的開放閱讀框，編碼297個氨基酸。將此氨基酸序列在國際基因庫中進行檢索，發現該脂肪酶屬于脂肪酶第3家族。
構建重組表達質粒載體pPIC9K/lgh,利用電轉儀進行電擊轉化Pichia pastoris GSl 15，在MD和麗培養基上篩選，經PCR鑒定篩選陽性轉化子，G418篩選多拷貝轉化子，然后進行甲醇誘導表達，獲得畢赤酵母工程菌株GS-TA-LGH。該工程菌株接種于含BMGY培養基中，在28°C 200rpm/min搖床培養6d后，脂肪酶活達到19. 92U/mg, SDS-PAGE檢測該蛋白的分子量為58kDa，酶在50°C保溫60min，不損失活性，在60°C保溫60min，仍有66%的活性。具有較高的熱穩定性，有重要的經濟價值和社會價值。
圖I脂肪酶基因IghPCR產物電泳圖譜
泳道M Marker-DL2000
泳道2 :cDNA(0RF)
圖2脂肪酶LGH的SDS-PAGE分析
泳道M:低分子量蛋白Marker
泳道1-7 :酵母工程菌Pichiapastoris GS-TA-LGH的誘導1-7天的表達情況
圖3重組脂肪酶LGH的純化
泳道M :低分子量蛋白標準
泳道I :純化的重組脂肪酶LGH具體實施方式
實施例I :嗜熱子囊菌光孢變種(T. aurantiacus var. levisporus)的分離鑒定
(I)標本采集從堆肥中采集。
(2)分離培養將采集標本取O. 5克放置在PDA平板上50°C培養3天后，進行分離純化。操作步驟參考Cooney and Emerson (1964)文獻。
(3)鑒定參考 Cooney and Emerson (1964)和 LaTouche (1950)文獻。
實施例2 :脂肪酶基因Igh的克隆
(I)嗜熱子囊菌光孢變種總RNA的提取參照Trizol試劑盒說明。
(2)cDNA 第一條鏈的合成按照 Takara 公司的 TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3. O 試劑盒說明書進行取廣2 μ g總RNA，加RNase Free ddH20至9. 5 μ L，將RNA樣品在75°C 變性5min，立即在冰浴中冷卻5min，然后稍微離心一下，在冰浴中依次加入以下各種成分10mmol/L dNTP Mixture2 μ L，10 X RTBuffer (Mg2+) 2 μ L，25mmol/L MgCl24y L, Oligo d(T)-Adaptor Primerl μ L, RNaseInhibiterO.5 μ L, AMV Reverse Transcriptasel μ L (Final Volume20 μ L),將反應液混合后，室溫下放IOmin,然后42°C溫育60min,再煮沸 5min以滅活反轉錄酶。加入180 μ L DEPC處理的ddH20，稀釋至200 μ L，混勻，稍微離心，保存于-20°C，備用。
(3)中間片段的分離根據脂肪酶的同源保守序列設計兼并引物。上游引物為 5’ -CTCTGCYGCMKCBTATTG-3’，下游引物為5’ -CRCTGGTRAYCCAGTACTC-3’
(4)3’和5’序列的分離脂肪酶基因5’端序列克隆，使用Tail-PCR的方法，根據中間前面得到片段設計3個向外的特異巢式引物，以及通過巢式引物以及上游公共兼并引物ADh擴增得到。
Iip-TAIL-I :5，-GGGGACAGCCGTAGGGGTAGAGAT-3，
lip-TAIL-2 :5，-GAGGTCATCCGACACCGAGTTCCAC-3
Iip--TAIL-3 :5，-TCGTCTTGGTATCCGCCGCCTC-3’
AD15， -NTCGASTWTSGWGTT-3，
AD25， -NGTCGASWGANAWGAA-3，
AD35’ -WGTGNAGffANCANAGA-3
AD45’ -TGWGNAGSANCASAGA-3’
AD55，-AGffGNAGffANCAffAGG-3
脂肪酶基因 3’ 端序列克隆，按照 TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3. O (TaKaRa)和 3’ RACE Kit, 2nd Genneration(Roche Applied Science)使用說明進行。3’ RACE 的上游引物序列為
5’ -AATCGTGGAACTCGGTGT-3’
5， -ACTGTTGGGACACTGGTTCT-3’
下游引物為M13M4:5’ -GTTTTCCCAGTCACGAC-3’。
(5)基因克隆取O. 5 μ IPCR回收產物與pMD18-T載體進行連接，操作步驟按照 TaKaRa公司產品說明書進行。然后連接產物轉化大腸桿菌DH5 α菌株，在表面涂有X — gal 和IPTG的含氨卞青霉素(100 μ g/mL)的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養基中培養過夜。
(6)質粒DNA的提取堿法提取質粒DNA。
(7)序列測定DNA雙脫氧法測定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司進行，序列引物為M13啟動子引物。嗜熱子囊菌光孢變種Igh全長的cDNA為1009bp。開放閱讀框部分為894bp，編碼297個氨基酸的一段序列，將此氨基酸序列在國際基因庫中進行檢索， 發現屬于脂肪酶第3家族。該序列如下
(A) SEQ ID NOl 的信息
(a)序列特征*長度1009堿基對；*類型核酸；*鏈型雙鏈；*拓撲結構線性
(b)分子類型cDNA
(C)假設否
(d)反義否
Ce)最初來源嗜熱子囊菌光孢變種(Thermoascus aurantiacus var. levisporus)
(f)序列描述
I TATCTGCAGA
61 GCTGGGCTTA
121 ACTCCTGCAG
181 CTTCAATTCG
241 GGCGGATACC
301 CCTGGCCGTC
361 CGACACGTGG
421 TTGCGAGATC
481 CCGGCTTCAG
5415GGCGATTGGGCCCTCTAGAT GCATGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATGGAATTGCCCTTATGTTCAATTC TGTAGCCAAATGGGCCGTTACGGCCTTGACTTTGTCTCTGCTGCCCCGTA TAAACCCGAACGCCGAGACGTCTCGGCGGACAGTTTAACCTCTTCGAGCA ATATGCTGCTGCAGCGTATTGCGAGGAAAAACGGGCACGAAATTAACATG CTCTGCGGGGAACTGCCCCCTAGTGGAGGCAAGACGATTGACGAGTTTAC GGATTCCAGCTATGGAAACGTAACGGGATTGACAACACGAACAAGCTTAT CGTGTTGTCTTTCCGCGGAACCAGATCTATATTTCCAATTTGGACTTCAC TCTGAAGGATATTGGCGATATCTGCAGCGGCACAACGGATTCTGGAAATC GTGGAACTCGGTGTCGGATGACCTCACGTCTCTACCGTCTCAGAGTATCC GGATTATGCGATTATCTTCACGGGCCACACGCCGGAGCA
601 CGATCTCTAC
661 GACCCAGACT
721 GCCGCCCGAA
781 CAATGTGACC
841 GAATGCCGGT
901 TGCATGCCAA
961TGAAAGGGCA ATTCCAGCAC ACTGGCGGCC GTTACTAGTG ATCCGAGCT
(B) SEQ ID N02 的信息
(a)序列特征*長度297氨基酸；*類型氨基酸；*鏈型單鏈；*拓撲結構線性
(b)分子類型蛋白質
(C)序列描述GCCGTGGCTACTGTTGGGAC ACTGGTTCTGAGAAAGGTGGGATACGCGGTCCCTACGGCTGTCCCCGCAT CGGCAACGGACAGCTTGCCGAGTACATGACCCCGGTACGAACTACCGCAT CACACACACCGACGATATCGTACCCAGGCTTGGGCCGGCTACAGCCACTA CAGCCCCGAGTACTGGATCACAAGCCCGAAGTGACCACGGCGGACATTCA AGTCATTCAGGGAATCGACTCCGACGCTGGACCGACGGACTGTCCACTGA CGCTCATGGATGGTACTTTGGACCTATTTC
ICEENFNSTGT
61 TRSIDTffISN
121 TGHSAGAAVA
181 VPRLPPEffAG
241 GPIFACQ
實施例3MSNSVAKffAV TALTLGLFVS AAPYKPERRD VSAELLQQFN LFEQYAAAAYKLTCSAGNCP LVEAADTKTI DEFTDSSYGN VTGFLAVDNT NKLIVLSFRGLDFTLKDI⑶ ICSGCEIHNG FffKSffNSVSD DLTSRLQSTV SEYPDYAIIFTVGTLVLRKV GYAVDLYPYG CPRIGNGQLA EYMTTQTPGT NYRITHTDDIYSHYSPEYffI TSPNNVTVTT ADIQVIQGID SDAGNAGTDG LSTDAHGffYF表達載體的構建
(I)根據分離出的Igh基因的核苷酸序列設計表達引物，在引物的5’端分別引入 EcoR I和Not I酶切位點
上游引物5’ -CG GAATTC GCCCCGTATAAACCCGAAC-3 ’
下游引物5，-TT(iCGGCCG CTCATTGGCATGCAGAAATAGGT-3，
(2)嗜熱子囊菌光孢變種總RNA的提取利用Trizol試劑提取。
(3)反轉錄合成 cDNA 第一條鏈按照 TaKaRa 公司的 TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3. O試劑盒說明書進行，以Oligo dT-Adaptor primer為引物合成cDNA第一鏈。反應條件為42°C溫育60min，再煮沸5min以滅活反轉錄酶。加入180 μ L DEPC處理的ddH20，稀釋至200 μ L，混勻，稍微離心，保存于_20°C，備用。
(4)PCR 反應(25μ L):cDNA2y L, 10XBuffer2. 5 μ L, IOmmoI/L dNTP2 μ L, 25mmol/ L MgCl22yL，上、下游引物各 lyL，Taq DNA 聚合酶 O. 5 μ L(5U/μ L)，ddH2014 μ L。反應條件為 94°C 3min 預變性；94°C Imin, 57°C Imin, 72°C Imin,共 30 個循環，72°C延伸 IOmin, 10°C保存。
(5)基因克隆取0.5yL PCR產物與pMD18-T載體進行連接，獲得重組質粒 pMD 18-T/1 gh，操作步驟按TaKaRa公司產品說明書進行。然后連接產物轉化大腸桿菌 DH5 α，在涂有X - gal和IPTG的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養基中培養過夜。
(6 )質粒DNA提取堿法提取質粒DNA。
(7)用EcoR I和Not I對重組質粒pMD18_T/lgh產物進行雙酶切，同時用EcoR I 和Not I雙酶切酵母表達質粒pPIC9K，DNA膠回收試劑盒回收純化Igh基因及載體pPIC9K 片斷。然后進行體外連接，獲得重組質粒pPIC9K/lgh，重組質粒轉化大腸桿菌JM109，在含 Amp的LB轉化平板上挑選單菌落，提取質粒DNA，進行PCR和酶切鑒定，測序確認重組質粒的讀碼框正確。
實施例4 :表達脂肪酶基因Igh的酵母工程菌株的構建及篩選
(I)重組表達質粒的線性化將重組表達質粒pPIC9K/lgh用限制性內切酶Sac I 線性化。
(2)轉化電擊轉化酵母菌株PichiapastorisGS115酵母感受態細胞,轉化方法參見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊。
(3)篩選用滅菌牙簽挑取轉化子對應點種在麗和MD平板上，30°C培養2 — 4d， 挑取在MD/MM平板上均生長良好的轉化子為陽性轉化子。挑取陽性轉化子分別點種于 I. 00mg/mL, 2. 00mg/mL, 3. 00mg/mL, 4. 00mg/mL G418 的 YPD 平板上篩選多拷貝轉化子。
實施例5 :畢赤酵母PichiapastorisGS115的誘導表達和活性檢測
(I)將陽性轉化子接種于含25mL BMGY培養基中，28 °C 200rpm/min搖床培養24h (OD600達2 — 6)，離心收集菌體，將細胞重懸于適當體積的BMMY培養基中，至0D_值為I. 0， 280C 200rpm/min繼續培養，每12h補充甲醇至終濃度為1%，每24h取樣，室溫10，OOOg離心 5min，取上清進行SDS-PAGE分析。
(2)酶活性檢測酶活性測定采用pNPP法，蛋白含量測定采用Bradford法。
(3)重組脂肪酶LGH的最適反應溫度、pH及熱穩定性誘導表達的重組脂肪酶經過DEAE-Sepharose陰離子交換柱層析，獲得電泳均一的純化蛋白，用純化的重組脂肪酶測定其性質。在不同溫度和PH條件下分別測定重組脂肪酶的酶活力，將最高的酶活力定義為 100%，分別計算不同溫度條件下脂肪酶的相對酶活性；將脂肪酶在不同的溫度下保溫不同的時間(IOmin, 20min, 30min, 40min, 50min, 60min)后，檢測剩余酶活力。
實施例6 :表達Igh基因的畢赤酵母工程菌株GS-TA-LGH的保藏
表達Igh基因的畢赤酵母工程菌株GS-TA-LGH的保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC);地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所；保藏日期2012年11月22日；酵母工程菌株編號為=CGMCC No. 6862 ;畢赤酵母工程菌株的分類命名為巴氏畢赤酵母Pichia pastoris。
權利要求
1.一種表達嗜熱子囊菌光抱變種(Thermoascus aurantiacus var. levisporus)脂肪酶基因Igh的酵母工程菌株，其特征在于該菌為一種畢赤酵母，通過RT-PCR及RACE等方法從嗜熱子囊菌光孢變種(Thermoascusaurantiacus var. levisporus)獲得熱穩定脂肪酶基因lgh，將該基因克隆到畢赤酵母分泌型表達載體pPIC9K，獲得表達重組質粒PPIC9K/Igh,轉化畢赤酵母GS115,從中篩選出表達熱穩定脂肪酶基因Igh的畢赤酵母工程菌株GS-TA-LGH。
全文摘要
本發明是一種表達嗜熱子囊菌光孢變種(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)熱穩定脂肪酶基因1gh的畢赤酵母工程菌GS-TA-LGH。通過RT-PCR及RACE等方法從嗜熱子囊菌光孢變種中獲得脂肪酶基因1gh，構建表達載體pPIC9K/1gh，并導入畢赤酵母GS115，從中篩選出一種表達脂肪酶的酵母工程菌GS-TA-LGH。該工程菌脂肪酶的酶活性可達19.92U/mg，酶在50℃保溫60min，不損失活性，在60℃保溫60min，仍有66％的活性。具有較高的熱穩定性，作為熱穩定脂肪酶的生產菌株，具有經濟價值和社會價值。
文檔編號C12N15/55GK102978125SQ20121055692
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月20日 優先權日2012年12月20日
發明者李多川, 李萌, 郭曉紅, 黃剛 申請人:山東農業大學