一種可降解玉米赤霉烯酮毒素的非過氧化物酶酶組分的分離方法
【專利摘要】本發明公開一種可降解玉米赤霉烯酮毒素的非過氧化物酶酶組分的分離方法。本發明中不動桿菌粗酶液先經陰離子葡聚糖凝膠柱純化，以15～25mM磷酸鈉鹽緩沖液進行梯度洗脫；再經過陽離子葡聚糖凝膠柱純化，以10～30mMTris-HCl緩沖液洗脫；再次經陰離子葡聚糖凝膠柱純化，以15～25mM磷酸鈉鹽緩沖液進行梯度洗脫，最后得到可降解ZEN毒素的非過氧化物酶酶組分。獲得的降解ZEN非過氧化物酶酶組分對真菌毒素玉米赤霉烯酮有較強的降解能力，不需要雙氧水的協同作用下，在12h內可降解60%以上的ZEN，為將來研究非過氧化物酶降解ZEN毒素及其應用奠定了基礎。
【專利說明】—種可降解玉米赤霉烯酮毒素的非過氧化物酶酶組分的分離方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物應用領域,具體涉及一種可降解玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA, ZEN)毒素的非過氧化物酶酶組分的分離方法。
【背景技術】
[0002]玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA, ZEN)是一種具有二羥基苯甲酸內酯結構的雌激素類真菌毒素，由玉米赤霉菌、禾谷鐮刀菌、三線鐮刀菌等菌產生，主要污染小麥、大麥、燕麥、玉米等農作物。全世界每年約有25%的農作物被霉菌毒素污染，我國食品和飼料工業平均每年因霉變所致損失總產量10%以上。從全國倉庫和飼料廠中抽樣檢測，發現玉米等農作物和飼料中ZEN的檢出率高達100%，檢出濃度超標嚴重。ZEN會引起種豬或家禽早熟，生殖周期紊亂，給種豬等養殖業帶來巨大的損失。而且，人攝入被ZEN污染的農、畜產品可引發多種中毒癥、中樞神經受損，甚至死亡。因此，防止農作物和飼料的霉變與霉變后脫毒處理是食品儲藏和食品加工過程中不可或缺的環節。
[0003]目前對于霉變的處理，國內沒有理想的脫毒劑。糧食廠、飼料廠等每年至少需購買2億元進口霉菌吸附類解毒劑，但這類解毒劑并不能真正將毒素降解成無毒物，而且ZEN殘留時間長、難處理，已引起國內外科研工作者的極大關注。FAO和世界衛生組織已將解決ZEN問題作為全世界的當務之急，各國對糧食中ZEN含量有嚴格限量標準，因此，研究具有自主知識產權、經濟有效、不破壞農作物和飼料原有營養成分的ZEN脫毒技術具有重要深遠的意義，符合國民經濟和社會發展的趨勢。
[0004]生物降解是利用自然界存在的微生物分解物質，對環境不會造成負面影響，能避免物理和化學方法的去毒效果有限、營養物質損失大、成本高和有害物質殘留等缺點，已成為研究熱點和主要趨勢目前報道的具有ZEN降解能力的菌株，包括有Fusarium oxysporum, Agrobactgerium tumefaciens, Clonostachys sp.,Gliocladiumroseum, Eubacterium BBSH797, Trichosporon mycotoxinivorans 等，人們從中發現了各種對ZEN有降解能力的酶。因ZEN是二羥基苯甲酸內酯，人們篩選到一些內酯水解酶，認為內酯鍵的打開可將ZEN的球形結構打開變成直鏈形結構，使之不能與雌激素受體結合，從而消除其高雌激素癥。
[0005]例如Michihiko等用外消旋的泛酰內酯作底物從農桿菌中篩選到新的內酯水解酶Agrobacterium tumefaciens AKU316,能高效、特異地水解泛酰內酯和鐮刀菌屬的內酯(Michihiko K, JunichiN, et al.Purification and characterization of a novellactono hydrolase from agrobacterium tumefaciens.Biosc1.Biotechnol.Biochem., 2000,64(6):1255-1262.)。
[0006]Jan等從Gliocladium roseum中發現針對ZEN的特異性內酯酶zes2，該酶可除去碳酸基，催化 ZEA 水解成無毒物(Jan U，Petr K.Role of zearalenone lactonaseinprotection of gliocladium roseum from fungitoxic effects of the mycotoxinzearalenone.Applied and Environmental Microbiology, 2007，73(2):637-642.X
[0007]Naoko等克隆了 ZEN內酯水解酶zhdlOl,并在大腸桿菌成功表達(Naoko TA, Shuichi O, Takehiko S，et al.Metabolism of zearalenone by genetically modifiedorganisms expressing the detoxification gene from clonostachys rosea.Appliedand Environmental Microbiology, 2004, 70(6):3239-3249.)?[0008]但酯鍵的水解并不能完全降解ZEN,該反應仍然可逆。Jdinos從根霉屬菌和毛霉菌等絲狀真菌中鑒定了與ZEN降解有關的酶和基因，并轉入其它微生物用于飼料的脫毒(JanosVarga, ZsanettPeteri, KatalinTabori, et al.Degradation of ochratoxin A andother mycotoxins by Rhizopusisolates.Food Microbiology, 2005, 99(3):321-328.)。
[0009]唐語謙等從玉米耕種的土壤中分離獲得了一株可高效降解ZEN的不動桿菌 Acinetobacter sp.SM04 (Yuanshan Yu,Liping Qiu,Hui ffu,Yuqian Tang, etal.Degradation of zearalenone by the extracellular extracts of Acinetobactersp.SM041iquid cultures.Biodegradation, 2011, 22:613 - 622.),并從中分離到一個過氧化物酶Prx，可在H202的協同作用下高效降解ZEN毒素，且產物具有低雌激素活性，不生成玉米赤霉烯酮、玉米赤霉醇等高雌激素活性類似物，具有真正的脫毒效果(Yuanshan Yu, Liping Qiu, Hui ffu, Yuqian Tang, et al.0xidation of zearalenoneby extracellular enzymes from Acinetobacter sp.SM04into smaller estrogenicproducts.World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2011，27:2675-2681.X分離過氧化物酶的方法只得到純過氧化物酶，不能應用于非過氧化物酶的純化。
【發明內容】
[0010]為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種可降解玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA，ZEN)毒素的非過氧化物酶酶組分的分離方法。該分離方法是從不動桿菌Acinetobacter sp.SMO4中進行酶組分的純化分離方法。
[0011]本發明的另一目的在于提供上述方法獲得的可降解玉米赤霉烯酮毒素的非過氧化物酶酶組分。
[0012]本發明的再一目的在于提供上述可降解玉米赤霉烯酮毒素的非過氧化物酶酶組分的應用。
[0013]本發明的目的通過下述技術方案實現:一種可降解玉米赤霉烯酮毒素的非過氧化物酶酶組分的分離方法，包含以下具體步驟:
[0014](I)接種I~3%(v/v)不動桿菌Acinetobacter sp.SMO 4菌懸液到M2培養基中，培養24~48h ；
[0015](2)將步驟(1)中的液體培養物冷凍離心收取上清液，過濾，濾過液在45~55°C下濃縮8~10倍成粗酶液；
[0016](3)將步驟(2)所得的粗酶液加入陰離子型葡聚糖凝膠柱中，用pH7.0、6.5、
6.0、5.5、5.0的磷酸鈉鹽緩沖液進行梯度洗脫，分段收集，測定各管組分的A28tol值，選取A280nm ^ 1.0的收集管進行ZEN降解酶活力測定；合并ZEN降解酶活力高于30%的各管；
[0017](4)將步驟(3)獲得的ZEN降解酶組分在45~55°C下濃縮8~10倍，加入到陽離子型葡聚糖凝膠柱中，用Tris-HCl緩沖液以恒定流速洗脫，分段收集，測定各管的A28tol值，選取A28tlnm ^ 1.0的收集管進行ZEN降解酶活力測定；合并ZEN降解酶活力高于30%的各管;
[0018](5)將步驟(4)獲得的ZEN降解酶組分在45~55°C下濃縮8~10倍，重新加入到陰離子型葡聚糖凝膠柱中，用PH7.0,6.5,6.0,5.5,5.0的磷酸鈉鹽緩沖液進行梯度洗脫，分段收集；測定各管組分的A28tol值；取第二個吸收峰的各管組分進行ZEN降解活力檢測；合并ZEN降解活力高于50%的各管；
[0019](6)將步驟(5)所得的ZEN降解酶組分在45~55°C下濃縮8~10倍，即為最終的不動桿菌降解ZEN非過氧化物酶酶組分。
[0020]為了更好的實現本發明，還包括如下步驟:
[0021]A、將步驟(6)所得的降解ZEN非過氧化物酶酶組分用12.5%(w/v)聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡稱SDS-PAGE電泳)分析，考馬斯亮藍染色后，獲得步驟(6)中所得的降解ZEN非過氧化物酶酶組分內所包含的蛋白及其對應的分子量；獲得四條蛋白條帶，分子量分別為41kDa、30kDa、28kDa、19kDa ;與SM04中分離的Prx為單一的蛋白條帶(大約20KDa)區別明顯；
[0022]B、將步驟(6)所得的降解ZEN非過氧化物酶酶組分在pH3~12下測定過氧化物酶活力；再次驗證所得的降解ZEN酶組分基本沒有過氧化物酶活力，非過氧化物酶，明顯區別于SM04中分離出的Prx ；
[0023]步驟(1)中所述的不動桿菌Acinetobacter sp.SM04為2011年12月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.5524 ；
[0024]步驟(1)中所述的Acinetobacter sp.SMO4菌懸液的OD值優選為OD6tltl=0.6~
1.0 ；
[0025]步驟(1)中所述的M2培養基的制備步驟如下:取12.5~17.5g乙酸鈉，2.5~3gNH4NO3,1.2 ~1.5g K2HPO4.3H20,1 ~1.5g KCl，0.4 ~0.6g MgSO4.7H20，加入 IOmL 微量元素儲備液，加蒸懼水定容至1000mL,混合后調節pH至7.0~7.5 ;
[0026]所述的微量元素儲備液的配方如下:2g/L FeSO4.7Η20，0.5g/L MnSO4.4Η20，0.4g/L CuSO4.5Η20，0.5g/L CoCl6.6Η20 和 0.4g/L ZnCl2 ；
[0027]步驟(1)中所述的培養優選為在氣浴搖床上培養；
[0028]步驟(1)所述的培養的條件優選為28~32°C、150~200r/min ；
[0029]步驟(2)中所述的冷凍離心收取上清液指4~6°C、8000~1000OXg下離心10~15min收集上清液；
[0030]步驟(2)中所述的過濾優選為用0.22 μ m濾膜過濾；
[0031]步驟(2)、(4)、(5)和(6)中所述的濃縮優選為使用真空旋轉蒸發儀進行濃縮；
[0032]步驟(3)和(5)中所述的陽離子型葡聚糖凝膠柱優選為DEAE Sephadex A-50柱(2.0cmX 15cm)；
[0033]步驟(3)和(5)中所述的磷酸鈉鹽緩沖液的配制方法是稱取并加入磷酸氫二鈉至溶液終濃度為15~25mM，并用IM NaOH溶液調節pH至各個pH值；
[0034]步驟(3)、(4)和(5)所述的洗脫的恒定流速為0.4~0.6mL/min ；
[0035]步驟(3)、(4)和(5)所述的分段收集指以每管4~6mL的體積收集；
[0036]步驟(3)中所述的測定A28tlnm的目的以280nm處的紫外吸收值表征酶組分中的蛋白含量;
[0037]步驟(4)中所述的陰離子葡聚糖凝膠柱優選為Sephadex G-50柱(2.0cmX30cm)；
[0038]步驟(4)中所述的Tris-HCl緩沖液的濃度是10~30mM ；
[0039]步驟(4)中所述的Tris-HCl緩沖液的pH值是6.5~7.5 ;
[0040]步驟(3 )、( 4)和(5 )中的ZEN降解酶活力的測定方法如下:
[0041]將0.40mL各管收集液和0.10mL0.25mol/L的Tris-HCl (pH9.0)緩沖液混合均勻，添加10 μ L ZEN甲醇儲備液，置于40°C恒溫水浴溫育12h，添加0.5mL甲醇終止反應，在12000 Xg下離心5min，取30 μ L上清液用高效液相色譜(HPLC)檢測ZEN殘量；以去離子水作為空白對照；結果以相對降解活力表示；
[0042]所述的相對降解活力的計算方法為:相對降解活力(％) = (ZEN的添加量-處理后ZEN的殘留量)/ZEN的添加量X 100 ；
[0043]所述的用高效液相色譜(HPLC)檢測ZEN的條件:色譜柱采用Waters XTerraEMSC18柱(4.6Χ150_，5μπι);流動相為乙腈:水:甲醇=46:46:8 ;柱溫30°C，流量為ImL/min ;結果采用熒光檢測器，激發波長274nm，發射波長450nm ;采用外標法定量ZEN的濃度，計算各組分的降解效率；
[0044]所述的ZEN甲醇儲備液優選為ZEN濃度為lmg/mL ；
[0045]步驟(6)所述的降解ZEN非過氧化物酶酶組分，與ZEN毒素進行降解反應的pH值優選為9.0 ;具體包括如下步驟:取步驟(6)所得的降解ZEN非過氧化物酶酶組分400 μ L，添加10 μ L ZEN (lmg/mL)甲醇儲備液，分別添加0.10mL20mmol/L的檸檬酸鈉(pH2.5~4.5)或 0.10mL20mmol/mL 的磷酸鈉緩沖液(ρΗ5.0 ~7.5)或 0.10mL20mmol/mL 的 Tris-HCl緩沖液(PH8.0~13.0)混合均勻，置于40°C恒溫水浴溫育12h，添加0.5mL甲醇終止反應，在12000 Xg下離心5min，取30μ L上清液用高效液相色譜(HPLC)檢測ZEN殘量；以去離子水作為空白對照；結果以相對降解活力表示；相對降解活力的計算方法和高效液相色譜(HPLC)檢測ZEN的條件與步驟(3)中的一致；
[0046]步驟(6 )所述的降解ZEN非過氧化物酶酶組分，與ZEN毒素進行降解反應的溫度優選為60°C;具體包括如下步驟:取步驟(6)所得的降解ZEN非過氧化物酶酶組分400 μ L，添加 10 μ L ZEN (lmg/mL)甲醇儲備液,添加 0.10mL20mmol/mL 的 Tris-HCl 緩沖液(ρΗ9.0)混合均勻，分別置于20°C、30°C、4(TC、5(rC、6(rC、7(rC恒溫水浴溫育12h，添加0.5mL甲醇終止反應，在12000 X g下離心5min，取30 μ L上清液用高效液相色譜(HPLC)檢測ZEN殘量；以去離子水作為空白對照；結果以相對降解活力表示；相對降解活力的計算方法和高效液相色譜(HPLC)檢測ZEN的條件與步驟(3)中的一致；
[0047]步驟B所述的測定過氧化物酶活力的方法如下:將1mL的步驟(6)所述的降解ZEN非過氧化物酶酶組分溶液，920 μ L的0.lmol/L Tris-HCl (pH3~12)緩沖液，20 μ L的0.2mol/L4-氨基安替吡啉水溶液，20 μ L的0.3mol/L苯酚溶液(用無水乙醇溶解)混合均勻；放置在50°C的恒溫水浴鍋中保持2min后，添加20 μ L的lmol/L H2O2啟動反應；反應5~20min后，用紫外-可見分光度計測定500nm波長處的吸光值。用ImL的去離子水代替待測樣品作為參比對照。
[0048]一種可降解玉米赤霉烯酮毒素的非過氧化物酶酶組分，通過上述方法獲得。[0049]所述的可降解玉米赤霉烯酮毒素的非過氧化物酶酶組分應用于降解農作物和飼料霉變后產生的ZEN毒素。
[0050]本發明的不動桿菌SM04的降解ZEN毒素非過氧化物酶酶組分能在不添加雙氧水的情況下，12h內降解60%以上的ZEN。
[0051]本發明相對于現有技術，具有如下的優點及有益效果:
[0052]( I)本發明的不動桿菌降解ZEN毒素非過氧化物酶酶組分對真菌毒素玉米赤霉烯酮有較強的降解能力，可在12h內可降解60%以上的ZEN。
[0053](2)本發明中不動桿菌SM04將ZEN降解成為無雌激素毒性產物的過程為一系列酶共同作用的結果，本發明采取一種新方法，可得到較純的非過氧化物酶酶組分，該酶作用不需要添加H2O2也可將ZEN降解。
[0054](3)本發明的不動桿菌ZEN毒素降解酶在降解玉米赤霉烯酮的過程中，不需要雙氧水的協同作用，完全區別于已公開的來源于不動桿菌Acinetobacter sp.SMO4的過氧化物酶Prx。
[0055](4) ZEN毒素降解酶組分純化采用陰離子葡聚糖凝膠DEAE A_50、陽離子葡聚糖凝膠G-50、陰離子葡聚糖凝膠DEAE A-50依次柱層析的方法，并通過優化實驗，選定合適的洗脫劑，即兩次陰離子葡聚糖凝膠DEAE A-50過柱均用磷酸鹽pH梯度洗脫，陽離子葡聚糖凝膠G-50用pH6.5~7.5的Tris-HCl洗脫。第一步陰離子葡聚糖柱的作用是根據等電點不同去除雜蛋白，同時除去色 素，保護陽離子葡聚糖柱。第二步陽離子葡聚糖柱的作用是根據分子量不同去除雜蛋白，第三步陰離子葡聚糖柱的作用是再次根據等電點不同，在無色素影響的情況下，去除雜蛋白。三次葡聚糖柱依次進行，方能得到目標酶組分。
[0056](5)過柱之后A28tlnm小于1.0的部分，酶蛋白的濃度低，且為兩吸收峰交界處，雜蛋白含量高，而且ZEN毒素降解活力低部分影響最終酶組分的降解活力的同時，更有可能夾雜其他雜蛋白，因此舍棄低酶蛋白濃度部分能更快速純化出蛋白，更有益于后續純化及最終驗證。
[0057](6)不動桿菌Acinetobacter sp.SM04培養采用優化后的M2培養基及微量元素培養基，提高了非過氧化物酶酶組分的蛋白含量，從而得出最終的ZEN毒素降解活力高、蛋白種類少的非過氧化物酶酶組分。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0058]圖1是實施例1中Acinetobacter sp.SMO4的M2培養物上清液的經過DEAESephadex A-50柱(洗脫液:15mM磷酸鈉鹽緩沖液，pH梯度)、Sephadex G-50柱(洗脫液:IOmM Tris-HCl 緩沖液，pH6.5)、DEAE Sephadex A-50 柱(洗脫液:15mM磷酸鈉鹽緩沖液，pH梯度)洗脫后各組分的蛋白質吸收峰圖譜。
[0059]圖2是實施例1中降解ZEN非過氧化物酶酶組分(圖1中P2)降解ZEN的色譜圖；A =ZEN標準品；B:降解ZEN非過氧化物酶酶組分，反應時間12h。
[0060]圖3是實施例2中Acinetobacter sp.SMO4的M2培養物上清液的經過DEAESephadex A-50柱(洗脫液:20mM磷酸鈉鹽緩沖液，pH梯度)、Sephadex G-50柱(洗脫液:IOmM Tris-HCl 緩沖液，pH7.0)、DEAE Sephadex A-50 柱(洗脫液:20mM磷酸鈉鹽緩沖液，pH梯度)洗脫后各組分的蛋白質吸收峰圖譜。[0061]圖4是實施例2中降解ZEN非過氧化物酶酶組分(圖3中P2)降解ZEN的色譜圖；A =ZEN標準品；B:降解ZEN非過氧化物酶酶組分，反應時間12h。
[0062]圖5是實施例3中Acinetobacter sp.SM04的M2培養物上清液的經過DEAESephadex A-50柱(洗脫液:25mM磷酸鈉鹽緩沖液，pH梯度)、Sephadex G-50柱(洗脫液:IOmM Tris-HCl 緩沖液，pH7.5)、DEAE Sephadex A-50 柱(洗脫液:25mM磷酸鈉鹽緩沖液，pH梯度)洗脫后各組分的蛋白質吸收峰圖譜。
[0063]圖6是實施例3中降解ZEN非過氧化物酶酶組分(圖5中P2)降解ZEN的色譜圖；A =ZEN標準品；B:降解ZEN非過氧化物酶酶組分，反應時間12h。
[0064]圖7是降解ZEN非過氧化物酶酶組分(圖3中P2) SDS-PAGE電泳(見實施例4)分析結果圖；泳道M:蛋白標準分子量marker (14.4kDa~98kDa);泳道Al和A2:降解ZEN非過氧化物酶酶組分。[0065]圖8是不同pH (3.0~12.0)下降解ZEN非過氧化物酶酶組分的過氧化物酶活力的結果圖，其中丨丨表示去離子水對照組，□表示酶組分實驗組。
[0066]圖9是實施例5溫度對非過氧化物酶酶組分的ZEN毒素降解活力的影響結果圖。
[0067]圖10是實施例5pH對非過氧化物酶酶組分的ZEN毒素降解活力的影響結果圖。
【具體實施方式】
[0068]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0069]下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件。
[0070]不動桿菌Acinetobacter sp.SM04菌為2011年12月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCCJia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所)，保藏編號為CGMCC N0.5524。
[0071]實施例1
[0072](I)培養:將接種有 l%(v/v) Acinetobacter sp.SM04 菌懸液(OD6tltl=0.6)的培養物(M2培養基)在28°C的氣浴搖床中培養(150r/min)24h，將液體培養物離心10min(8000X g，4°C )，離心后的上清液用0.22 μ m濾膜過濾，濾過液在45°C使用真空旋轉蒸發儀濃縮8倍成粗酶液；
[0073]所用培養基的配方如下:
[0074]M2 培養基:12.5g 乙酸鈉，2.5g NH4NO3,1.2g K2HPO4.3H20，Ig KCl，0.4gMgSO4.7H20,加入IOmL微量元素儲備液，加蒸餾水定容至1000mL,混合后調節pH至7.0 ;
[0075]所述的微量元素儲備液的配方如下:2g/L FeSO4.7Η20，0.5g/L MnSO4.4Η20，0.4g/L CuSO4.5Η20，0.5g/L CoCl6.6Η20 和 0.4g/L ZnCl2。
[0076](2)將步驟(1)中的粗酶液加入陰離子型葡聚糖凝膠柱DEAE Sephadex A-50柱(2.0cmX 15cm)中，用ρΗ7.0、6.5、6.0、5.5、5.0的磷酸鈉鹽緩沖液(15mM)進行梯度洗脫(流速為0.4mL/min),分段收集(每管4mL),測定各管組分的A28tlnm值,選取A28tlnm > 1.0的收集管進行ZEN降解酶活力測定；合并ZEN降解酶活力高于30%的各管；
[0077](3)將步驟(2)獲得的ZEN降解酶液在45°C下濃縮8倍，加入到陽離子型葡聚糖凝膠柱 Sephadex G-50 柱(2.0cmX30cm)中，用 IOmM Tris-HCl 緩沖液(ρΗ6.5)洗脫(流速為0.4mL/min),分段收集(每管4mL),測定各管的A28tlnm值,選取A28tlnm > 1.0的收集管進行ZEN降解酶活力測定；合并ZEN降解酶活力高于30%的各管；
[0078](4)將步驟(3)獲得的ZEN降解酶組分在45°C下濃縮8倍，重新加入到陰離子型葡聚糖凝膠柱 DEAE Sephadex A-50 柱(2.0cmX 15cm)中，用 ρΗ7.0、6.5、6.0、5.5、5.0 的磷酸鈉鹽緩沖液(15mM)進行梯度洗脫(流速為0.4mL/min)，分段收集(每管4mL);測定各管組分的A28tlnm值，得到蛋白質吸收峰圖譜，如圖1 ;取蛋白質吸收峰圖譜中P2所在吸收峰的各管進行ZEN降解活力檢測；合并ZEN降解活力高于50%的各管；
[0079](5)將步驟(4)所得的ZEN降解酶組分在45°C下濃縮8倍，即為最終的不動桿菌降解ZEN的非過氧化物酶酶組分。取此非過氧化物酶酶組分進行ZEN毒素降解活力檢測。結果表明此組分可在12h內降解63.1%的ZEN毒素，其液相實驗圖見圖2。
[0080]各管組分的ZEN降解酶活力測定方法如下:
[0081]將0.4mL各管收集液和0.1OmL0.25mol/L的Tris-HCl (pH9.0)緩沖液混合均勻，添加10 μ L ZEN甲醇儲備液(ZEN濃度為lmg/mL)，置于40°C恒溫水浴溫育12h，添加0.5mL甲醇終止反應，在12000 X g下離心5min，取30 μ L上清液用HPLC檢測其ZEN殘量。以去離子水作為空白對照。結果以相對降解活力表示，相對降解活力(％)= (ZEN的添加量-處理后ZEN的殘留量)/ZEN的添加量X 100。
[0082]高效液相色譜(HPLC)檢測ZEN的條件:色譜柱采用Waters XTerraE MS C18柱(4.6 X 150mm，5 μ m)。流動相為乙腈:水:甲醇=46:46:8。柱溫30°C，流量為lmL/min。結果采用熒光檢測器，激發波長274nm，發射波長450nm。采用外標法定量ZEN的濃度，計算各組分的降解效率。
[0083]實施例2
[0084](I)培養:將接種有 2%(v/v) Acinetobacter sp.SM04 菌懸液(OD6tltl=0.8)的培養物(M2培養基)在30°C的氣浴搖床中培養(180r/min) 36h至對數生長末期，將液體培養物離心12min (9000 X g，5°C )，離心后的上清液用0.22 μ m濾膜過濾，濾過液在50°C使用真空旋轉蒸發儀濃縮9倍成為粗酶液；
[0085]所用培養基的配方如下:
[0086]M2 培養基:15g 乙酸鈉，2.75g NH4NO3,1.35g K2HPO4.3H20,1.25g KCl，0.5gMgSO4.7H20,加入IOmL微量元素儲備液，加蒸餾水定容至1000mL,混合后調節pH至7.3 ;
[0087]微量元素儲備液配方與實施例1- (I)中一致。
[0088](2)將步驟(1)中的粗酶液加入陰離子型葡聚糖凝膠柱DEAE Sephadex A-50柱(2.0cmX 15cm)中，用pH7.0,6.5,6.0,5.5,5.0的磷酸鈉鹽緩沖液(20mM)進行梯度洗脫(流速為0.5mL/min),分段收集(每管5mL),測定各管組分的A28tlnm值,選取A28tlnm ^1.0的收集管進行ZEN降解酶活力測定；合并ZEN降解酶活力高于30%的各管；
[0089](3)將步驟(2)獲得的ZEN降解酶液在50°C下濃縮9倍，加入到陽離子型葡聚糖凝膠柱 S印hadex G-50 柱(2.0cmX30cm)中，用 20mM Tris-HCl 緩沖液(ρΗ7.0)洗脫(流速為0.5mL/min),分段收集(每管5mL),測定各管的A28tlnm值,選取A28tlnm ^1.0的收集管進行ZEN降解酶活力測定；合并ZEN降解酶活力高于30%的各管；
[0090](4)將步驟(3)獲得的ZEN降解酶組分在50°C下濃縮9倍，重新加入到陰離子型葡聚糖凝膠柱 DEAE Sephadex A-50 柱(2.0cmX 15cm)中，用 ρΗ7.0、6.5、6.0、5.5、5.0 的磷酸鈉鹽緩沖液(20mM)進行梯度洗脫(流速為0.5mL/min)，分段收集(每管5mL);測定各管組分的A28tlnm值，得到蛋白質吸收峰圖譜，如圖3 ;取蛋白質吸收峰圖譜中P2所在吸收峰的各管進行ZEN降解活力檢測；合并ZEN降解活力高于50%的各管；
[0091](5)將步驟(4)所得的ZEN降解酶組分在50°C下濃縮9倍，即為最終的不動桿菌降解ZEN非過氧化物酶酶組分。取此非過氧化物酶酶組分進行ZEN毒素降解活力檢測。結果表明此組分可在12h內降解71.2%的ZEN毒素，其液相實驗圖見圖4。
[0092]各管組分的ZEN降解酶活力測定方法與實施例1 一致。
[0093]實施例3
[0094](I)培養:將接種有 3%(v/v) Acinetobacter sp.SM04 菌懸液(0D_=1.0)的培養物(M2培養基)在28°C的氣浴搖床中培養(200r/min)48h，將液體培養物離心15min(10000Xg，6°C )，離心后的上清液用0.22μπι濾膜過濾，濾過液在55°C使用真空旋轉蒸發儀濃縮10倍成粗酶液；
[0095]所用培養基的配方如下:
[0096]M2 培養基:17.5g 乙酸鈉，3g NH4NO3,1.5g K2HPO4.3H20，1.5g KCl,
0.6gMgS04.7H20,加入IOmL微量元素儲備液，加蒸餾水定容至1000mL,混合后調節pH至
7.5 ；
[0097]微量元素儲備液配方與實施例1- (I)中一致。
[0098](2)將步驟(1)中的粗酶液加入陰離子型葡聚糖凝膠柱DEAE Sephadex A-50柱(2.0cmX 15cm)中，用pH7.0,6.5,6.0,5.5,5.0的磷酸鈉鹽緩沖液(25mM)進行梯度洗脫(流速為0.6mL/min),分段收集(每管6mL),測定各管組分的A28tlnm值,選取A28tlnm ^1.0的收集管進行ZEN降解酶活力測定；合并ZEN降解酶活力高于30%的各管；
[0099](3)將步驟(2)獲得的ZEN降解酶液在55°C下濃縮10倍，加入到陽離子型葡聚糖凝膠柱 S印hadex G-50 柱(2.0cmX30cm)中，用 30mM Tris-HCl 緩沖液(ρΗ7.5)洗脫(流速為0.6mL/min),分段收集(每管6mL),測定各管的A28tlnm值,選取A28tlnm ^1.0的收集管進行ZEN降解酶活力測定；合并ZEN降解酶活力高于30%的各管；
[0100](4)將步驟(3)獲得的ZEN降解酶組分在55°C下濃縮10倍，重新加入到陰離子型葡聚糖凝膠柱 DEAE Sephadex A-50 柱(2.0cmX 15cm)中，用 ρΗ7.0、6.5、6.0、5.5、5.0 的磷酸鈉鹽緩沖液(25mM)進行梯度洗脫(流速為0.6mL/min)，分段收集(每管6mL);測定各管組分的A28tlnm值，得到蛋白質吸收峰圖譜，如圖5 ;取蛋白質吸收峰圖譜中P2所在吸收峰的各管進行ZEN降解活力檢測；合并ZEN降解活力高于50%的各管；
[0101](5)將步驟(4)所得的ZEN降解酶組分在55°C下濃縮10倍，即為最終的不動桿菌降解ZEN非過氧化酶酶組分。取此非過氧化物酶酶組分進行ZEN毒素降解活力檢測。結果表明此組分可在12h內降解65.7%的ZEN毒素，其液相實驗圖見圖6。
[0102]各管組分的ZEN降解酶活力測定方法與實施例1 一致。
[0103]實施例4
[0104](I)將實施例2- (5)中最終得到的降解ZEN非過氧化物酶酶組分用12.5%(w/v)SDS-PAGE凝膠電泳分析，考馬斯亮藍染色后，結果如圖7，蛋白電泳結果圖中顯示4條蛋白條帶，分別為:條帶I的分子量約為41kDa,條帶2的分子量約為30kDa,條帶3的分子量約為28kDa，條帶4的分子量約為19kDa。[0105]SDS-PAGE蛋白電泳液:10% (w/v)十二烷基苯磺酸鈉(SDS)溶液；1%(v/v)四甲基乙二胺(TEMED) ； 10%(w/v)過硫酸銨(AP)；
[0106]樣品溶解液:2%(w/v)SDS, 5%(v/v) β -巰基乙醇，10%(v/v)甘油，0.02%(w/v)溴酹藍，IOmM pH8.0Tris-HCl 緩沖液；
[0107]凝膠貯液:30%分離膠貯液，10%濃縮膠貯液；
[0108]分離膠配方:4.9mL 單體,5.0mL buffer, 3.5mL 蒸懼水，2.0mL 甘油，50 μ L10%(w/v)AP,10 μ L TEMED0
[0109]濃縮膠配方:1.62mL 單體,3.1OmL buffer, 7.78mL 蒸懼水，25 μ L10% (w/v) AP,5μ L TEMED。 [0110]其中，單體:30%(w/v)聚丙烯酰胺，0.8%(w/v)交聯劑；buffer:3M Tris, 0.3% (w/v) SDS, pH8.45。
[0111]凝膠緩沖液:分離膠緩沖液(3.0mol/L pH8.9Tris-HCI緩沖液)，濃縮膠緩沖液(0.5mol/L ρΗ6.7Tris_HCI 緩沖液)；
[0112]電極緩沖液:0.l%(w/v) SDS, 0.05mol/L Tris-HCl ；
[0113]染色液:考馬斯亮藍R2500.125g，加入50mL甲醇，IOmL冰乙酸，定容至100mL。
[0114]脫色液:冰乙酸75mL,甲醇50mL,加入蒸懼水定容至1000mL。
[0115](2)降解ZEN非過氧化物酶酶組分的過氧化物酶活力的驗證
[0116]過氧化物酶活力的測定方法參照文獻:Acinetobacter sp.SM04降解玉米赤霉烯酮的研究[D].余元善.華南理工大學，2011。
[0117]將ImL的實施例2- (5)中最終得到的降解ZEN非過氧化物酶酶組分溶液，920 μ L的0.lmol/L Tris-HCl (pH3~12)緩沖液，20 μ L的0.2mol/L4_氨基安替吡啉水溶液，20μ L的0.3mol/L苯酚溶液(用無水乙醇溶解)混合均勻；放置在50°C的恒溫水浴鍋中保持2min后，添加20μ L的lmol/L H2O2啟動反應；反應5~20min后，用紫外-可見分光度計測定500nm波長處的吸光值。用ImL的去離子水代替待測樣品作為參比對照。
[0118]結果見圖8，所得的降解ZEN酶組分在各個pH下無過氧化物酶活力，再次驗證該酶組分非過氧化物酶酶組分，明顯區別于SM04中分離出的Prx。
[0119]實施例5
[0120]降解ZEN非過氧化物酶酶組分的酶學特性
[0121](I)探究pH對降解ZEN非過氧化物酶酶組分的ZEN降解活力的影響:取實施例2- (5)所得的降解ZEN非過氧化物酶酶組分400 μ L，添加IOyL ZEN (lmg/mL)甲醇儲備液，分別添加0.10mL20mmol/L的檸檬酸鈉(pH2.5~4.5)或0.10mL20mmol/mL的磷酸鈉緩沖液(PH5.0 ~7.5)或 0.10mL20mmol/mL 的 Tris-HCl 緩沖液(pH8.0 ~13.0)混合均勻，置于40°C恒溫水浴溫育12h，添加0.5mL甲醇終止反應，在12000 Xg下離心5min，取30 μ L上清液用高效液相色譜(HPLC)檢測ZEN殘量；以去離子水作為空白對照；結果以相對降解活力表示。
[0122]相對降解活力的計算方法和高效液相色譜(HPLC)檢測ZEN的條件與實施例1 一致。
[0123]實驗結果表明，此非過氧化物酶酶組分與ZEN毒素進行降解反應的最佳pH為9.0，如圖9。[0124](2)探究溫度對降解ZEN非過氧化物酶酶組分的ZEN降解活力的影響:取實施例2-(5)所得的降解ZEN非過氧化物酶酶組分400μ L，添加10 μ L ZEN( lmg/mL)甲醇儲備液，添加 0.10mL20mmol/mL 的 Tris-HCl 緩沖液(pH9.0)混合均勻，分別置于 20°C、30°C、40°C、50°C、60°C、7(rC恒溫水浴溫育12h，添加0.5mL甲醇終止反應，在12000 X g下離心5min，取30 μ L上清液用高效液相色譜(HPLC)檢測ZEN殘量；以去離子水作為空白對照；結果以相對降解活力表示。
[0125]相對降解活力的計算方法和高效液相色譜(HPLC)檢測ZEN的條件與實施例1 一致。
[0126]實驗結果表明，此非過氧化物酶酶組分與ZEN毒素進行降解反應的最佳溫度為60°C，如圖 10。
[0127]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背 離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種可降解玉米赤霉烯酮毒素的非過氧化物酶酶組分的分離方法，其特征在于包含以下具體步驟: (1)接種I~3%(v/v)不動桿菌Acinetobactersp.SMO 4菌懸液到M2培養基中，培養24 ~48h ； (2)將步驟(1)中的液體培養物冷凍離心收取上清液，過濾，濾過液在45~55°C下濃縮8~10倍成粗酶液； (3)將步驟(2)所得的粗酶液加入陰離子型葡聚糖凝膠柱中，用pH7.0,6.5,6.0,5.5、5.0的磷酸鈉鹽緩沖液進行梯度洗脫，分段收集，測定各管組分的A28tlnm值，選取A28tlnm ^ 1.0的收集管進行ZEN降解酶活力測定；合并ZEN降解酶活力高于30%的各管； (4)將步驟(3)獲得的ZEN降解酶組分在45~55°C下濃縮8~10倍，加入到陽離子型葡聚糖凝膠柱中，用Tris-HCl緩沖液以恒定流速洗脫，分段收集，測定各管的‘_值，選取A28tlnm ^ 1.0的收集管進行ZEN降解酶活力測定；合并ZEN降解酶活力高于30%的各管； (5)將步驟(4)獲得的ZEN降解酶組分在45~55°C下濃縮8~10倍，重新加入到陰離子型葡聚糖凝膠柱中，用PH7.0,6.5,6.0,5.5,5.0的磷酸鈉鹽緩沖液進行梯度洗脫，分段收集；測定各管組分的A28tlnm值；取第二個吸收峰的各管成分進行ZEN降解活力檢測；合并ZEN降解活力高于50%的各管； (6)將步驟(5)所得的ZEN降解酶組分在45~55°C下濃縮8~10倍，即為最終的不動桿菌降解ZEN非過氧化物酶酶組分。
2.根據權利要求1所述的可降解玉米赤霉烯酮毒素的非過氧化物酶酶組分的分離方法，其特征在于:還包括如下步驟 : A、將步驟(6)所得的降解ZEN非過氧化物酶酶組分用12.5%(w/v)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，考馬斯亮藍染色后，獲得步驟(6)中所得的降解ZEN非過氧化物酶酶組分內所包含的蛋白及其對應的分子量；獲得四條蛋白條帶，分子量分別為41kDa、30kDa、28kDa、19kDa ； B、將步驟(6)所得的降解ZEN非過氧化物酶酶組分在pH3~12下測定過氧化物酶活力。
3.根據權利要求1所述的可降解玉米赤霉烯酮毒素的非過氧化物酶酶組分的分離方法，其特征在于:步驟(1)中所述的不動桿菌Acinetobacter sp.SMO 4,于2011年12月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.5524 ； 步驟(1)中所述的Acinetobacter sp.SMO4菌懸液的OD值為OD600=0.6~1.0 ; 步驟(1)所述的培養的條件為28~32°C、150~200r/min。
4.根據權利要求1所述的可降解玉米赤霉烯酮毒素的非過氧化物酶酶組分的分離方法，其特征在于:步驟(1)中所述的M2培養基的制備步驟如下:取12.5~17.5g乙酸鈉，2.5 ~3g NH4NO3,1.2 ~1.5g K2HPO4.3H20,1 ~1.5g KCl，0.4 ~0.6g MgSO4.7H20，加入IOmL微量元素儲備液，加蒸餾水定容至1000mL,混合后調節pH至7.0~7.5 ; 所述的微量元素儲備液的配方如下:2g/L FeSO4.7Η20，0.5g/L MnSO4.4Η20，0.4g/LCuSO4.5Η20，0.5g/L CoCl6.6Η20 和 0.4g/L ZnCl2。
5.根據權利要求1所述的可降 解玉米赤霉烯酮毒素的非過氧化物酶酶組分的分離方法，其特征在于: 步驟(2)中所述的冷凍離心收取上清液指4~6°C、8000~1000OXg下離心10~15min收集上清液； 步驟(2)中所述的過濾為用0.22 μ m濾膜過濾； 步驟(2)、(4)、(5)和(6)中所述的濃縮為使用真空旋轉蒸發儀進行濃縮； 步驟(3)和(5)中所述的陽離子型葡聚糖凝膠柱為2.0cmX 15cm的DEAESephadex A-50柱； 步驟(3)和(5)中所述的磷酸鈉鹽緩沖液的配制方法是稱取并加入磷酸氫二鈉至溶液終濃度為15~25mM，并用IM NaOH溶液調節pH至各個pH值； 步驟(3)、(4)和(5)所述的洗脫的恒定流速為0.4~0.6mL/min ； 步驟(3)、(4)和(5)所述的分段收集指以每管4~6mL的體積收集； 步驟(3)中所述的測定A28tlnm的目的以280nm處的紫外吸收值表征酶組分中的蛋白含量; 步驟(4)中所述的陰離子葡聚糖凝膠柱為2.0cmX30cm的Sephadex G-50柱； 步驟(4)中所述的Tris-HCl緩沖液的濃度是10~30mM ； 步驟(4)中所述的Tris-HCl緩沖液的pH值是6.5~7.5。
6.根據權利要求1所述的可降解玉米赤霉烯酮毒素的非過氧化物酶酶組分的分離方法，其特征在于:`` 步驟(3)、(4)和(5)中的ZEN`降解酶活力的測定方法如下: 將0.40mL各管收集液和0.1OmL0.25mol/L的ρΗ9.0的Tris-HCl緩沖液混合均勻，添加10 μ L ZEN甲醇儲備液，置于40°C恒溫水浴溫育12h，添加0.5mL甲醇終止反應，在12000 Xg下離心5min，取30 μ L上清液用高效液相色譜檢測ZEN殘量；以去離子水作為空白對照；結果以相對降解活力表示； 所述的相對降解活力的計算方法為:相對降解活力(％) = (ZEN的添加量-處理后ZEN的殘留量)/ZEN的添加量X 100 ； 所述的用高效液相色譜檢測ZEN的條件:色譜柱采用規格為4.6Χ150πιπι，5μπι的Waters XTerraE MS C18柱；流動相為乙腈:水:甲醇=46:46:8 ;柱溫30°C，流量為ImL/min ;結果采用熒光檢測器，激發波長274nm，發射波長450nm ;采用外標法定量ZEN的濃度，計算各組分的降解效率； 所述的ZEN甲醇儲備液為ZEN濃度為lmg/mL。
7.根據權利要求1所述的可降解玉米赤霉烯酮毒素的非過氧化物酶酶組分的分離方法，其特征在于:步驟(6)所述的降解ZEN非過氧化物酶酶組分，與ZEN毒素進行降解反應的pH值為9.0。
8.根據權利要求1所述的可降解玉米赤霉烯酮毒素的非過氧化物酶酶組分的分離方法，其特征在于:步驟(6)所述的降解ZEN非過氧化物酶酶組分，與ZEN毒素進行降解反應的溫度為60°C。
9.一種可降解玉米赤霉烯酮毒素的非過氧化物酶酶組分，通過權利要求1~8任一項所述的分離方法獲得。
10.權利要求9所述的可降解玉米赤霉烯酮毒素的非過氧化物酶酶組分應用于降解農作物和飼料霉變后產生的ZEN毒素。
【文檔編號】C12N9/18GK103881991SQ201410047866
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年2月11日 優先權日:2014年2月11日
【發明者】唐語謙, 鐘鳳, 陳藝, 吳暉 申請人:華南理工大學