不動桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa及其編碼基因與應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開一種不動桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa及其編碼基因與應用。本發明中的不動桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.6所示。不動桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa的編碼基因A4-Oxa的核苷酸序列如SEQ?IDNO.5所示。本發明的不動桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa對真菌毒素玉米赤霉烯酮有較強的降解能力；原核重組表達的Oxa酶可在12h內降解30%以上的ZEN毒素。本發明確定了Acinetobacter?sp.SM04降解玉米赤霉烯酮毒素的非過氧化物酶編碼序列，即A4-Oxa基因，為將來研究酶的活性位點和通過定點突變Oxa酶奠定了基礎。
【專利說明】不動桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】,具體涉及一種不動桿菌Acinetobacter sp.SM04的玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN, ZEA)毒素降解酶非過氧化物酶(命名為Oxa)及其編碼基因
與應用。
【背景技術】[0002]玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN,ZEA)是一種雌激素類真菌毒素，由玉米赤霉菌、禾谷鐮刀菌、三線鐮刀菌等真菌產生，主要污染小麥、大麥、燕麥、玉米等農作物及動物飼料。從全國倉庫和飼料廠中抽樣檢測，發現玉米等農作物和飼料中ZEN的檢出率高達100%,檢出濃度超標嚴重。謝良民等對上海市大型超市中多類食品調查結果表明，ZEN的檢出率極高，其中調味品均超出國家標準(食品中ZEN含量≤60μ g/kg)，且最高達150μ g/kg (謝良民，葛懿云，李俊旋.上海零售食品中玉米赤霉烯酮含量初步研究[J].中國科協第五屆青年學術年會文集，2004，756.)。此外，有研究表明十余種市售谷物相關食品中ZEN檢出率也高達76.90%。因ZEN殘留時間長、難處理，已引起國內外科研工作者的極大關注。FAO和世界衛生組織已將解決ZEA問題作為全世界的當務之急，各國對糧食中ZEA含量有嚴格限量標準。
[0003]ZEN會引起種豬或家禽早熟，生殖周期紊亂，給種豬等養殖業帶來巨大的損失，進一步對攝入被ZEN污染的農、畜產品的人引發多種中毒癥、中樞神經受損，甚至死亡。目前，ZEN脫毒技術根據其作用原理可分為3類:物理脫毒法(加熱、紫外線照射、有機粘土，活性炭，甘露低聚糖等)；化學脫毒法(酸堿處理，氮化處理，有機溶劑等)；生物轉化脫毒法。
[0004]物理方法是通過脫毒劑(主要包括活性炭、硅藻土、蒙脫石等)的吸附作用來達到去除ZEN的目的，但這類脫毒劑的吸附效率很低，達不到真正有效、徹底降解真菌毒素的目的。而且高劑量的吸附劑，會吸附營養物質，也無法被家禽家畜消化，同時帶來環境污染。化學方法包括氨化法、堿法、臭氧處理、雙氧水處理、碳酸鈉浸泡等，此法雖效果顯著，但后續處理繁瑣，生成的產物可能存在潛在毒性，且此方法效果不穩定，營養成分損失較大，難以廣泛規模化應用(熊凱華，程波財，胡威等.玉米赤霉烯酮降解的研究進展[J].中國糧油學報，2010，25 (I): 138-140)。
[0005]由于物理法和化學法的種種局限性，生物降解法顯示出其獨有的優勢，受到國內外研究者的青睞。生物降解脫毒是以微生物產生的次級代謝產物分解破壞霉菌毒素，生成無毒的降解產物。生物降解法高效、特異性強，不破壞原料中的營養成分，無二次污染產生，已成為研究熱點和主要趨勢。
[0006]日本Takahash1-Ando等人對粉紅粘帚霉(Clonostachys rosea)的研究較為全面，分離出的內酯水解酶zhdlOl可破壞ZEN結構，使其轉化為雌激素毒性較弱的化合物，且 ZEN 的降解率在 80 ~90% 之間(Kimara M, Naoko T, Nishiu-chi T.MolecularBiology and Biotechnology for Reduction of Fusarium Mycotoxin Contamination.Pesticide Biochemistry and Physiology, 2006，86 (3): 117-123.)。大腸桿菌和釀酒酵母表達的重組zhdlOl表現出了內酯水解酶的能力，對ZEN的降解率可達75%，具有zhdlOl的轉基因玉米也具備降解ZEN的能力(Tomoko I, Naoko T, Noriyuki O, et al.Reducedcontamination by the fusarium mycotoxin zearalenone in maize kernels throughgenetic modification with a detoxification gene.Applied and Environmental Microbiology, 2007，73 (5): 1622-1629.)。ZHDlOl主要作用于ZEA的內酯鍵，將ZEA的球形結構打開變成直鏈形結構，使之不能與雌激素受體結合，從而消除其高雌激素癥。但酯鍵的水解并不能完全降解ZEA，該反應仍然可逆，而且經過降解產物分析發現ZHDlOl將部分ZEA降解成為β-ZEA,仍具有較高的雌激素毒性。
[0007]此外，奧地利Molnar從白蟻后腸中分離出了一種新酵母菌一毛孢子菌屬Trichosporon mycotoxinivorans,它的培養物能將ZEN降解為二氧化碳和其它弱紫外吸收的代謝物，從而降低其毒性(Molnar O, Schatzmayr G, Fuchs E, etal.Trichosporon mycotoxinivorans sp.nov., a new yeast species useful inbiological detoxification of various mycotoxins.Systematic and AppliedMicrobiology, 2004, 27:661-671.)。該過程降解ZEA效率較低，而且較難進一步水解成為小分子物質，也未能避免雌激素毒性物的生成。
[0008]Abdullah從玉米地里分離出的假單胞菌ZEA-1可利用ZEN為唯一碳源，并且在12h內可將ZEN減少一半，編碼此ZEN降解酶的基因在大腸桿菌中也獲得了活性表達(Abdulla D.Altalhi, Bahig El-Deeb.Localization of zearalenone detoxificationgene(s)in pZEA-1plasmid of Pseudomonas putida ZEA-1and expressed in Escherichiacol1.J Hazard Mater, 2009, 161:1166-1172.)。
[0009]與此同時，其他研究主要集中于篩選獲得各種能降解ZEA的微生物，包括棉花枯萎病菌、假單胞菌、根霉 菌、乳酸細菌、枯草芽孢桿菌等，對相關作用酶的發現及降解途徑分析較少。
[0010]唐語謙等從玉米耕種的土壤中分離獲得了一株可高效降解ZEN的不動桿菌Acinetobacter.sp.SM04,可將ZEA徹底分解成無雌激素毒性的降解產物，降解效率高出國內外文獻所報道的其他菌株(Yuanshan Yu, Liping Qiu, Hui ffu, Yuqian Tang, etal.Degradation of zearalenone by the extracellular extracts of Acinetobactersp.SM041iquid cultures.Biodegradation, 2011, 22:613 - 622.),并從中分離出一個在該過程中起關鍵作用的過氧化物酶Prx (Yuanshan Yu, Liping Qiu, Hui ffu, Yuqian Tang,et al.0xidation of zearalenone by extracellular enzymes from Acinetobactersp.SM04into smaller estrogenic products.World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2011, 27:2675-2681.)。至今還沒有關于非過氧化物酶(Oxa)相關信息的報道。
【發明內容】
[0011]為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種不動桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa。本發明所用的不動桿菌為Acinetobacter sp.SM04。
[0012]本發明的另一目的在于提供上述不動桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa的編碼基因。
[0013]本發明的再一目的在于提供上述不動桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa的應用。
[0014]本發明的目的通過下述技術方案實現:一種不動桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa，其氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0015]所述的不動桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa的編碼基因A4_0xa，其核苷酸序列如SEQID N0.5 所示。
[0016]所述的不動桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa在降解霉變農作物和飼料及其它食物中的玉米赤霉烯酮毒素上的應用。
[0017]本發明通過培養不動桿菌Acinetobacter sp.SM04,從其培養上清液中分離、純化得到降解ZEN毒素的非過氧化物酶，經過SDS-PAGE和MALD1-T0F-T0F/MS分析和鑒定得到該非過氧化物酶的兩段特異性氨基酸序列。
[0018]基于MALD1-T0F-T0F/MS酶蛋白分析鑒定的蛋白序列，設計引物擴增Acinetobacter sp.SM04ZEN 降解酶基因的部分序列，米用 High-efficiency Tail-PCR 技術多次擴增、拼接后，得到該酶的全基因核苷酸序列，并翻譯成氨基酸序列，同時對該基因進行表達和蛋白功能的驗證。
[0019]實驗結果表明:從編碼Oxa的基因序列SEQ ID N0.5和其氨基酸序列SEQ ID N0.6可知，本發明的不動桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa是一種全新的酶，區別于前期研究成果中從不動桿菌SM04中分離的過氧化物酶Prx，不需過氧化氫的輔助也對真菌毒素玉米赤霉烯酮有較強的降解能力。
[0020]本發明相對于現有技術，具有如下的優點及效果:
[0021](I)不動桿菌SM04將ZEN降解成為無雌激素毒性產物的過程為一系列酶共同作用的結果，本發明采取一種新方法從中分離得另一個新酶，在無H2O2的作用下降解ZEN，是一種新的非過氧化物酶，并已獲得該酶的氨基酸序列及編碼基因序列，且在大腸桿菌宿主中表達,表達后的重組Oxa粗酶液具有ZEN降解活力。
[0022](2)本發明的不動桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa對真菌毒素玉米赤霉烯酮有較強的降解能力，原核重組表達的Oxa酶可在12h內降解30%以上的ZEN毒素。
[0023](3)本發明確定了 Acinetobacter sp.SMO4的玉米赤霉烯酮毒素降解酶Oxa的編碼序列，即A4-0xa基因，不同于過氧化物酶Prx的編碼基因序列，且通過Genbank中比對，是一種新的序列，為將來研究酶的活性位點和通過定點突變Oxa酶奠定了基礎。
[0024](4)本發明的不動桿菌ZEN毒素降解酶Oxa在降解玉米赤霉烯酮的過程中，不需要雙氧水的協同作用，完全區別于已公開的來源于不動桿菌Acinetobacter sp.SMO4的過氧化物酶Prx。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1是實施例1中Acinetobacter sp.SMO4的M2培養物上清液的經過DEAESephadex A-50柱(洗脫液:20mM磷酸鈉鹽緩沖液，pH梯度)、Sephadex G-50柱(洗脫液:IOmM Tris-HCl 緩沖液，pH7.0)、DEAE Sephadex A-50 柱(洗脫液:20mM磷酸鈉鹽緩沖液，pH梯度)洗脫后各組分的蛋白質吸收峰圖譜。
[0026]圖2是實施例1中ZEN毒素降解酶Oxa酶組分(圖1中P2)降解ZEN產物的HPLC檢測圖；其中，圖A =ZEN (標準品);圖B =ZEN毒素降解酶Oxa酶組分+ZEN,反應時間12h。
[0027]圖3是實施例1中獲得的ZEN毒素降解酶Oxa酶組分(圖1中P2)SDS_PAGE電泳分析結果；M:蛋白標準分子量marker (14.4kDa~98kDa) ;A1、A2:ZEN毒素降解酶Oxa酶組分。
[0028]圖4是實施例4中重組質粒pET_32a (+) -A4_0xa的雙酶切瓊脂糖電泳檢測結果圖；M1:DNA標準分子量Marker (250~1000Obp) ；M2:DNA標準分子量Marker (200~2000bp) ；A:質粒 pET-32a(+) ;B1、B2:重組質粒 pET_32a (+) _A4_0xa (BamHI 和 XhoI 雙酶切)。
[0029]圖5是實施例4中A4_0xa基因在E.coli中誘導表達的SDS-PAGE電泳分析結果圖；M:蛋白標準分子量Marker(14.4kDa~116kDa) ;A:未誘導的重組菌BL21 (DE3)/pET-32a(+) -A4-0xa 粗酶液；B1、B2:IPTG 誘導的重組菌 BL21 (DE3)/pET_32a(+) _A4_0xa 粗酶液；C:重組菌BL21(DE3)/pET-32a(+)粗酶液。
[0030]圖6是測定實施例4中重組Oxa酶ZEN降解活力的HPLC檢測結果圖；其中，圖A:超純水+ZEN;圖B:重組菌BL21(DE3)/pET-32a(+)粗酶液+ZEN;圖C:1PTG誘導的重組菌BL21 (DE3)/pET-32a (+)-A4-0xa 粗酶液 +ZEN，反應時間 12h。
[0031]圖7是ZEN毒素濃度與液相色譜吸收峰面積關系標準曲線圖。
[0032]圖8是重組Oxa粗酶液降解玉米酒精糟中的ZEN毒素的HPLC檢測圖，其中，圖A是對照組，未加酶液+玉米酒精糟；圖B是實驗組，重組Oxa粗酶液+玉米酒精糟。
【具體實施方式】
[0033]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0034]下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。
[0035]不動桿菌Acinetobacter sp.SMO4為2011年12月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCCJia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所)，保藏編號為CGMCC N0.5524。
[0036]玉米酒精糟購自濱州金通飼料原料加工廠。
[0037]實施例1
[0038]一種新的不動桿菌降解ZEN的非過氧化物酶酶組分的制備，包括以下步驟:
[0039]1.培養:將接種有 2%(v/v) Acinetobacter sp.SM04菌懸液(0D600=0.8)的培養物(M2培養基)在30°C的氣浴搖床中培養(180r/min) 36h至對數生長末期，將液體培養物離心12min (9000 X g，5°C )，離心后的上清液用0.22 μ m濾膜過濾，濾過液在50°C使用真空旋轉蒸發儀濃縮9倍成為粗酶液；
[0040]所用培養基的配方如下:
[0041]M2 培養基:15g 乙酸鈉，2.75g NH4NO3,1.35g K2HPO4.3H20,1.25g KCl，0.5gMgSO4.7H20,加入IOmL微量元素儲備液，加蒸餾水定容至1000mL,混合后調節pH至7.3 ;
[0042]微量元素儲備液的配方:2g/LFeSO4.7Η20，0.5g/L MnSO4.4Η20，0.4g/LCuSO4.5Η20，0.5g/L CoCl6.6Η20 和 0.4g/L ZnCl2。
[0043]2.將步驟I中的粗酶液加入陰離子型葡聚糖凝膠柱DEAE Sephadex A-50柱(2.0cmX 15cm)中，用pH7.0,6.5,6.0,5.5,5.0的磷酸鈉鹽緩沖液(20mM)進行梯度洗脫(流速為0.5mL/min),分段收集(每管5mL),測定各管組分的A28tlnm值,選取A28tlnm ^1.0的收集管進行ZEN降解酶活力測定；合并ZEN降解酶活力高于30%的各管；
[0044]3.將步驟2獲得的ZEN降解酶液在50°C下濃縮9倍，加入到陽離子型葡聚糖凝膠柱 Sephadex G-50 柱(2.0cmX 30cm)中，用 20mM Tris-HCl 緩沖液(pH7.0)洗脫(流速為
0.5mL/min),分段收集(每管5mL),測定各管的A28tlnm值,選取A28tlnm≥1.0的收集管進行ZEN降解酶活力測定；合并ZEN降解酶活力高于30%的各管；
[0045]4.將步驟3獲得的ZEN降解酶組分在50°C下濃縮9倍，重新加入到陰離子型葡聚糖凝膠柱 DEAE Sephadex A-50 柱(2.0cmX 15cm)中，用 ρΗ7.0、6.5、6.0、5.5、5.0 的磷酸鈉鹽緩沖液(20mM)進行梯度洗脫(流速為0.5mL/min)，分段收集(每管5mL);測定各管組分的八28-值，得到蛋白質吸收峰圖譜，如圖1 ;取蛋白質吸收峰圖譜中P2所在吸收峰的各管進行ZEN降解活力檢測；合并ZEN降解活力高于50%的各管；
[0046]5.將步驟4所得的ZEN降解酶組分在50°C下濃縮9倍，即為最終的不動桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa酶組分。取此非過氧化物酶Oxa酶組分進行ZEN毒素降解活力檢測。結果表明此組分可在12h內降解71.2%的ZEN毒素，其液相實驗圖見圖2。
[0047]各管組分的ZEN降解酶活力測定方法如下:
[0048]將0.40mL 各管收集液、0.1OmL0.25mol/L 的 Tris-HCl (ρΗ9.0)緩沖液和20 μ L0.5mol/L H2O2溶液混合均勻，添加10 μ L ZEN甲醇儲備液(ZEN濃度為lmg/mL)，置于40°C恒溫水浴溫育12h，添加0.5mL甲醇終止反應，在12000 X g下離心5min，取30 μ L上清液用HPLC檢測其ZEN殘量。以去離子水作為空白對照。結果以相對降解活力表示，相對降解活力(％) = (ZEN的添加量-處理后ZEN的殘留量)/ZEN的添加量X 100。
[0049]高效液相色譜(HPLC)檢測ZEN的條件:色譜柱采用Waters XTerraE MS C18柱(4.6 X 150mm，5 μ m)。流動相為乙腈:水:甲醇=46:46:8。柱溫30°C，流量為lmL/min。結果采用熒光檢測器，激發波長274nm，發射波長450nm。采用外標法定量ZEN的濃度，計算各組分的降解效率。
[0050]實施例2
[0051]ZEN毒素降解酶Oxa酶組分的分析及鑒定，包括以下步驟:
[0052]1、將實施例1中最終得到的ZEN毒素降解酶Oxa酶組分用12.5%(w/v) SDS-PAGE凝膠電泳分析，考馬斯亮藍染色后，結果如圖3。
[0053]SDS-PAGE蛋白電泳液:10% (w/v)十二烷基苯磺酸鈉(SDS)溶液；1%(v/v)四甲基乙二胺(TEMED) ； 10%(w/v)過硫酸銨(AP)；
[0054]樣品溶解液:2%(w/V) SDS, 5% (v/v) β -巰基乙醇，10% (v/v)甘油，0.02% (w/ν)溴酹藍，IOmM pH8.0Tris-HCl 緩沖液；
[0055]凝膠貯液:30%分離膠貯液，10%濃縮膠貯液；
[0056]分離膠配方:4.9mL 單體,5.0mL buffer, 3.5mL 蒸懼水，2.0mL 甘油，50 μ L10%(w/v)AP,10 μ L TEMED0
[0057]濃縮膠配方:1.62mL單體，3.1OmL buffer, 7.78mL蒸懼水，25 μ L10%(w/v) AP, 5 μ LTEMED。
[0058]其中，單體:30%(w/v)聚丙烯酰胺，0.8%(w/v)交聯劑；buffer:3M Tris, 0.3% (w/v) SDS, ρΗ8.45。[0059]凝膠緩沖液:分離膠緩沖液(3.0mol/L pH8.9Tris_HCI緩沖液)，濃縮膠緩沖液(0.5mol/L ρΗ6.7Tris_HCI 緩沖液)；
[0060]電極緩沖液:0.l%(w/v) SDS, 0.05mol/L Tris-HCl ；
[0061]染色液:考馬斯亮藍R2500.125g，加入50mL甲醇，IOmL冰乙酸，定容至100mL。
[0062]脫色液:冰乙酸75mL,甲醇50mL,加入蒸懼水定容至1000mL。
[0063]2、取出圖3凝膠中蛋白條帶2進行酶解。酶解條件如下:50%(v/v)乙腈，25mmol/L順4!10)3，0.02^/^胰蛋白酶的水溶液，371:，1611。將酶解上清液萃取凍干。
[0064]3、完全凍干的樣品重新用0.1%(v/v)三氟乙酸水溶液溶解，然后使用MALD1-T0F-T0F質譜儀進行分析，結果見表1。
[0065]表1Acinetobacter sp.SMO4中降解ZEN非過氧化物酶酶組分的蛋白條帶2的鑒
定結果
[0066]
【權利要求】
1.一種不動桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa，其特征在于:其氨基酸序列如SEQID N0.6所示。
2.權利要求1所述的不動桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa的編碼基因A4-0xa，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示。
3.權利要求1所述的不動桿菌的ZEN毒素降解酶Oxa在降解霉變農作物和飼料及其它食物中的玉米赤霉烯酮毒素上的應 用。
【文檔編號】C12N9/00GK103881986SQ201410047870
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年2月11日 優先權日:2014年2月11日
【發明者】唐語謙, 鐘鳳, 陳藝, 吳暉 申請人:華南理工大學