一種附子多糖誘導nkt細胞增殖的制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了中藥附子多糖誘導自然殺傷T細胞(Nature?Killer?T?cell，NKT)增殖的培養方法，其中包括如下特征：人外周血、骨髓或臍帶血來源的單個核細胞，在中藥附子多糖和人重組白介素2條件下連續培養，獲得大量自然殺傷T細胞，表達NK1.1+和CD8+，并分泌干擾素γ，在第14天時占淋巴細胞的比例16.15％以上，數量級可達5×109以上；具有有效的抗腫瘤和抗病毒功能。本發明還提供了一種含通過上述方法而得到的NKT細胞的臨床應用。
【專利說明】一種附子多糖誘導NKT細胞增殖的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種附子多糖誘導自然殺傷T細胞增殖的制備方法及其應用。本發明涉及的采用人外周血、骨髓或臍帶血經體外分離純化獲得的單個核細胞，在中藥附子多糖和人重組白介素2條件下連續培養，簡便地獲得大量的NKT細胞，表達NKl.1+和CD8+，并分泌IFN-Y，具有抗腫瘤和抗病毒的功能，可用于各類癌癥包括實體瘤和血液腫瘤在內，以及多種病毒感染的多個療程的免疫治療。
【背景技術】
[0002]免疫細胞抗腫瘤抗病毒已在臨床上得到廣泛的應用，特別是細胞因子誘導殺傷細胞，沒有目前常規治療帶來的毒副作用，其相對安全，保證了患者的生活品質和尊嚴。構成機體免疫系統的淋巴細胞中，除T、B、NK細胞外，還存在一種新的細胞系-NKT細胞。這種細胞不僅其本身具有抗腫瘤、抗病毒和抑制自身免疫性疾病的功效，而且還能刺激T、NK等免疫細胞的活性，增強其細胞毒效應，抑制GVHD的發生。NKT細胞疫苗多療程治療對患者療效和生存期有著明顯的幫助，并得到臨床上認可。
[0003]目前，獲得NKT細胞的來源主要為從患者外周血或骨髓中分離出單個核細胞，在多種細胞因子單獨或組合誘導作用下，如重組人白介素2、重組人白介素15、重組人白介素
4、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、重組人白介素12、重組人白介素18,或與α-半乳糖神經鞘胺醇(a -Galcer)聯合誘導作用，得到NKl.1+和TCR β +的NKT細胞，細胞數量級為5Χ IO8個左右，僅滿足1-2次的臨床治療，很大程度上影響了給患者的治療，而且多療程治療時需要再次采血，給予患者很大的精神壓力。
[0004]附子多糖對免疫系統有重要的調節作用，不僅能激活T細胞、B細胞、NK細胞、細胞毒細胞和LAK，能有效促使樹突狀細胞成熟，還能促進白介素、腫瘤壞死因子α、集落刺激因子和干擾素等細胞因子的生成。本發明通過人外周血、骨髓或臍帶血中白細胞，經體外純化獲得的單個核細胞，應用附子多糖和重組白介素2聯合連續培養，簡便地獲得大量的NKl.1+和⑶8+ΝΚΤ細胞，并分泌IFN- Y。這樣不僅可以滿足多療程NKT細胞免疫治療，持續發揮NKT細胞的免疫功能，有助于提高臨床療效和延長患者生存期，而且應用附子多糖可以大大降低成本。
【發明內容】
[0005]現有技術主要通過從人外周血、骨髓或臍帶血中分離純化出單個核細胞，一般為20毫升到300毫升， 在多種細胞因子單獨或組合誘導作用下，如重組人白介素2、重組人白介素15、重組人白介素4、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、重組人白介素12、重組人白介素18，或與α-半乳糖神經鞘胺醇(a-Galcer)聯合誘導作用，連續培養獲得NKT細胞，其數量是有限的，僅為5X IO8個細胞左右。若一次NKT細胞疫苗治療至少使用5X IO8個細胞，最多能滿足1-2次的治療。另外，NKT細胞激活后可通過分泌IL-4和IFN- Y調節Th細胞的分化，從而實現對免疫應答和自身免疫的調節。因而，為了實現NKT細胞的抗腫瘤、抗病毒的免疫應答，還需要促使NKT細胞分泌IFN- Y，發揮Thl的細胞免疫應答作用。
[0006]NKT細胞能對外源性快速增殖的腫瘤細胞進行殺傷，NKT細胞需要持續地進行加強，維持對機體“非我”的腫瘤細胞進行殺傷，有效地抑制腫瘤細胞的復發和轉移。因而NKT細胞疫苗在臨床應用中需要進行多次治療，更好地提高患者臨床療效和延長生存期。通過現有技術獲得的NKT細胞數量，沒法完成患者的多次的治療和保證患者的長期療效。
[0007]附子多糖具有促進B、T淋巴細胞增殖的作用，并促使人白細胞分泌干擾素Y、腫瘤壞死因子α等，促使淋巴細胞向Thl細胞分化，而介導免疫應答。本發明技術通過人外周血、骨髓和臍帶血經體外純化獲得單個核細胞，經附子多糖和IL-2共同刺激作用，簡便地增殖獲得大量的NKT細胞，數量級可大于5 X IO9以上，每次治療時使用0.5 X IO9NKT細胞，可用于多達5次以上。同時NKT細胞可表達NKl.1+和⑶8+，分泌IFN-Y，可產生對腫瘤細胞的Thl細胞免疫應答。
[0008]本發明涉及一種中藥附子多糖誘導自然殺傷T細胞增殖的制備方法，其特征在于，包括如下工序:人外周血、骨髓或臍帶血來源的單個核細胞，在中藥附子多糖和人重組白介素2條件下連續培養，獲得大量自然殺傷T細胞，表達NKl.1+和⑶8+，并分泌干擾素Y，在第14天時占淋巴細胞的比例12.61%以上，酶聯免疫斑點檢測干擾素Y為30個以上，數量級可達5 X IO9以上；具有有效的抗腫瘤和抗病毒的Thl細胞免疫應答功能。
[0009]采集的約50mL人外周血進行體外分離純化，去除紅細胞、血小板和粒細胞等，獲得單個核細胞，單個核細胞用RPMI1640培養基重懸，苔盼蘭染色計數，使用RPMI1640完全培養基(含 lug/mL-1000ug/mL 附子多糖，lIU-400IU/mL IL-2,10% (v/v)胎牛血清)調整到細胞濃度為1-5X106/mL，將細胞培養液放置到75cm2培養瓶中，每瓶30ml，于37°C、5%CO2培養箱中培養；
[0010]于第3、6、9、11、13、15、17天補充一倍體積的新鮮RPMI1640完全培養基(含Iug/mL-1000ug/mL 附子多糖，lIU-400IU/mLIL-2,10% (v/v)胎牛血清)，培養到第 14、16 和 18天收獲NKT細胞；
[0011]優選地，本發明所述方法為:誘導培養NKT細胞使用的RPMI1640完全培養基優選為含有 10ug/mL-500ug/mL 附子多糖，5IU-200IU/mL IL-2,10% (v/v)胎牛血清。
[0012]將所述的NKT細胞進行細胞活率、細胞表型和干擾素Y酶聯免疫斑點檢測，細胞活率達到98%以上;其表達NKl.1+和CD8+分子，其中，NKl.1+和CD8+細胞為大于12.61%,干擾素Y酶聯免疫斑點檢測為30個以上。
[0013]培養到第7-12天收獲的NKT細胞均可用于凍存，即將獲得NKT細胞苔盼蘭計數，5 X IO7個NKT細胞凍存1毫升，凍存管放置程序降溫盒中，放入_80°C超低溫冰箱過夜，第二天轉至液氮凍存。NKT可在需要時復蘇進行增殖培養，仍可保持同樣的細胞活率、細胞表型以及分泌干擾素Y，促使Thl細胞免疫應答的功能。
[0014]優選地，本發明所述方法為:培養到第7天收獲的NKT細胞均可用于凍存。
[0015]其中，優選的細胞活率檢測方法為:計算培養到第14天的活細胞數。取ImL培養的培養液，1000rpm、4°C下離心10分鐘，細胞用培養基重懸，取20ul細胞液用IXPBS稀釋20倍，稀釋液加入I倍體積的苔盼蘭溶液，混勻后加入到細胞計數板，于倒置顯微鏡下觀察計數，藍色染色的為死細胞，不染色的為活細胞，細胞活率達到98%以上。
[0016]優選的細胞表型檢測方法為:取苔盼蘭染色計數后的2X IO6細胞，分兩組，第一組分別添加到有20 μ L FITC標記鼠抗人⑶8單抗和20 μ L PE標記鼠抗人NKl.1單抗；第二組為同型對照，分別添加到有20 μ L FITC標記鼠IgGl和20 μ L PE標記鼠IgGl (BD公司)。置于4°C冰箱染色30分鐘，然后用ImL的IX磷酸鹽緩沖液洗滌三次，最后用0.5mL的IXPBS重懸洗滌后的細胞，所得洗滌后的細胞用FACSCalibur基本型流式細胞儀檢測。經檢測，NKl.1+/CD8+細胞為 12.61%, NKl.1+細胞為 15.72%, CD8+細胞為 52.23%.檢測結果表明通過本發明所述方法得到的細胞為NKT細胞具有表達其典型的表型。
[0017]NKT細胞通過斑點酶聯反應試劑盒(美國R&D公司)檢測干擾素Y分泌水平，NKT細胞形成很多IFN-Y的酶聯斑點，表明其能分泌IFN-Y的能力，從而引發Thl細胞的免疫應答。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1表示本發明附子多糖誘導培養獲得的NKT細胞的流式細胞圖(FLl通路為FITC-CD8，FL2 通路為 PE-NK1.1)；
[0019]圖2表示本發明附子多糖誘導培養的NKT細胞酶聯免疫斑點試驗檢測干擾素Y分泌結果圖。
【具體實施方式】
[0020]本發明發現通過中藥附子多糖聯合白介素2對人外周血、骨髓或臍帶血經體外純化的單個核細胞進行誘導，可簡便地增殖獲得大量的NKT細胞，數量級可大于5X 109，若每次治療時使用0.5X IO9NKT細胞，`可用于多達5次以上。同時NKT細胞可表達NKl.1+和CD8+，分泌IFN-Y，可產生對腫瘤細胞的Thl細胞免疫應答獲得特異的NKT細胞疫苗，可用于多達13次以上與3個療程以上的臨床應用。
[0021]對本發明涉及的一種大規模培養NKT細胞疫苗的制備方法進行具體說明。本發明涉及采用血細胞分離機通過采集人外周血中白細胞，經體外分離純化獲得大量的單個核細胞，在人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子和白介素4誘導培養獲得大量未成熟NKT細胞；未成熟NKT細胞負載腫瘤特異抗原后，并在腫瘤壞死因子α與脂多糖誘導培養條件下獲得具有抗腫瘤作用的成熟NKT細胞疫苗。
[0022]本發明涉及中藥附子多糖誘導自然殺傷T細胞增殖的制備方法，其特征在于，包括如下工序:人外周血、骨髓或臍帶血來源的單個核細胞，在中藥附子多糖和人重組白介素2條件下連續培養，獲得大量自然殺傷T細胞，表達NKl.1+和⑶8+，并分泌干擾素Y，在第14天時占淋巴細胞的比例12.61%以上，數量級可達5Χ109以上，干擾素、酶聯免疫斑點檢測為30個以上；具有有效的抗腫瘤和抗病毒的Thl細胞免疫應答功能。
[0023]采集的約50mL人外周血進行體外分離純化，去除紅細胞、血小板和粒細胞等，獲得單個核細胞，單個核細胞用RPMI1640培養基重懸，苔盼蘭染色計數，使用RPMI1640完全培養基(含 lug/mL-1000ug/mL 附子多糖，lIU-200IU/mL IL-2,10% (v/v)胎牛血清)調整到細胞濃度為1-5X106/mL，將細胞培養液放置到75cm2培養瓶中，每瓶30ml，于37°C、5%CO2培養箱中培養；
[0024]于第3、6、9、11、13、15、17天補充一倍體積的新鮮RPMI1640完全培養基(含Iug/mL-1000ug/mL 附子多糖，lIU-200IU/mLIL-2,10% (v/v)胎牛血清)，培養到第 14、16 和 18天收獲NKT細胞；
[0025]優選地，本發明所述方法為:誘導培養NKT細胞使用的RPMI1640完全培養基優選為含有 10ug/mL-500ug/mL 附子多糖，5IU-200IU/mL IL-2,10% (v/v)胎牛血清。
[0026]將所述的NKT細胞進行細胞活率、細胞表型和干擾素Y酶聯免疫斑點檢測，細胞活率達到98%以上;其表達NKl.1+和CD8+分子，其中，NKl.1+和CD8+細胞為大于12.61%,干擾素Y酶聯免疫斑點檢測為30個以上。
[0027]培養到第7-12天收獲的NKT細胞均可用于凍存，即將獲得NKT細胞苔盼蘭計數，5 X IO7個NKT細胞凍存I毫升，凍存管放置程序降溫盒中，放入_80°C超低溫冰箱過夜，第二天轉至液氮凍存。NKT可在需要時復蘇進行增殖培養，仍可保持同樣的細胞活率、細胞表型以及分泌干擾素Y，促使Thl細胞免疫應答的功能。
[0028]優選地，本發明所述方法為:培養到第7天收獲的NKT細胞均可用于凍存。
[0029]作為本發明制造方法中使用的細胞培養板、細胞培養皿、培養瓶、細胞培養袋，可例舉，為75cm2細胞培養瓶、175cm2細胞培養瓶、250mL細胞培養袋等細胞培養用器材(容器)，均可用于本發明，優選細胞培養袋。
[0030]本發明的制造方法中對NKT細胞進行凍存，對凍存液無特殊限制，但優選例如為50%小牛血清、40%細胞培養液和10%二甲基亞砜，其中細胞培養液更優選為NKT細胞培養液。
`[0031]在培養基中可以添加血清或血漿進行培養。它們在培養基中的添加量不受特殊限制，如大于O容量％至20容量％，且可以根據不同的培養階段而改變血清或血漿的用量，優選為5% (體積比)。例如，可以階段性減少血清或血漿濃度來使用。另外，作為血清或血衆的來源，可以是自己(意味著與所培養的細胞來源相同)或非自己(意味著與所培養的細胞的來源不同)中的任一種，從安全性的觀點出發，優選自己來源的血清或血漿。另外，也可以添加如人血清白蛋白之類經分離純化的血清成分。
[0032]本發明的中藥附子多糖誘導NKT細胞增殖的制備使用上述各種成分及培養基來實施。本發明中使用的培養培養條件也沒有特殊限制，可以使用通常的細胞培養中使用的條件。例如，可在37°C、5% C02等條件下培養。還可以實施如下等操作:間隔適當的時間添加新鮮培養基來稀釋細胞培養液，或更換培養基，或更換細胞培養用器材等。
[0033]本發明還提供NKT細胞在臨床應用中多次多療程的抗腫瘤治療，更好地在生物體內發揮抗腫瘤免疫應答，達到很好的治療效果。此外，上述NKT細胞還具有如下優點，多次多療程NKT細胞治療將更好地引發Thl細胞免疫應答，產生高效、長效地抗腫瘤免疫效應，因此非常利于患者療效的提聞和生存期的延長。
[0034]以下，結合實施例對本發明做更具體的描述，但本發明不限于此。
[0035]實施例一
[0036]人外周血來源單個核細胞培養獲得NKT細胞
[0037]乳腺癌患者，女，24歲，血常規檢測結果為3.7 X IO9個白細胞/升，采集患者50ml外周血(與該患者簽署知情同意書)；采集的外周血1500rpm離心10分鐘，收集上層血漿，并在56°C水浴鍋中滅活30分鐘后，3000rpm離心10分鐘獲得自體血漿，備用。血細胞溶液用I倍體積的I XPBS (pH = 7.4)重懸后，加入1/4的0.6%羥乙基淀粉的生理鹽水，混勻后靜置30分鐘，盡量吸取白色細胞層；白色細胞層經Ficoll-Hypaque密度梯度離心，得到單個核細胞用RPMI1640培養基重懸，苔盼蘭染色計數為1.62X 108。
[0038]外周血單個核細胞用RPMI1640培養基調整到細胞濃度為3X106，培養基含有150ug/mL附子多糖，20IU/mL IL-2和10% (v/v)胎牛血清，加入到75cm2細胞培養瓶(康寧公司)中，在37°C、5%C02培養箱中孵育；在培養到第三天時補充I倍體積新鮮RPMI1640培養基，該新鮮培養基含150ug/mL附子多糖，20IU/mL IL-2和體積比10% (v/v)胎牛血清。
[0039]連續培養到第6天，將NKT細胞培養液轉移至250mL細胞培養袋中，補充I倍體積的新鮮RPMI1640完全培養基(含150ug/mL附子多糖，20IU/mLIL-2，10% (v/v)胎牛血清)，繼續于37 °C、5 % CO2培養箱中培養。于第9、11、13、15、17天補充I倍體積的新鮮RPMI1640完全培養基(含150ug/mL附子多糖，20IU/mLIL-2，10% (v/v)胎牛血清)，培養到第14、16和18天收獲NKT細胞。
[0040]培養到第7天取其中I瓶NKT細胞，收獲NKT細胞，苔盼蘭計數，數量為18.7 X IO7,NKT細胞可凍存起來，50 X IO6個NKT細胞凍存I毫升，凍存管放置程序降溫盒中，放入_80°C超低溫冰箱過夜，第二天轉至液氮凍存，以備用。
[0041]計算培養到第14天的活細胞數。取ImL最后一天培養的培養液，1000rpm、4°C下離心10分鐘，細胞用RPMI1640培養基重懸，取20 μ L細胞液用lXPBS(pH7.4)稀釋20倍，稀釋液加入I倍體積的苔盼蘭溶液，混勻后加入到細胞計數板，于倒置顯微鏡下觀察計數，藍色染色的為死細胞，不染色的為活細胞，細胞活率達到98%以上。
[0042]取苔盼蘭染色計數后的2 X IO6細胞，分兩組，第一組分別添加到有20 μ LFITC標記鼠抗人⑶8單抗和20 μ L PE標記鼠抗人NKl.1單抗；第二組為同型對照，分別添加到有20 μ L FITC標記鼠IgGl和20 μ L PE標記鼠IgGl (BD公司)。置于4°C冰箱染色30分鐘，然后用ImL的IX磷酸鹽緩沖液洗滌三次，最后用0.5mL的I XPBS重懸洗滌后的細胞，所得洗滌后的細胞用FACSCalibur基本型流式細胞儀檢測。經檢測流式細胞結果見圖一(FLl通路為 FITC-CD8，FL2 通路為 PE-NK1.1) ,NKl.1+/CD8+細胞為 12.61%, NKl.1+細胞為 15.72%,CD8+細胞為52.23%。檢測結果表明通過本發明所述方法得到的細胞為NKT細胞具有表達其典型的NKl.1+表型。
[0043]實施例二
[0044]酶聯免疫斑點實驗(Elispot)檢測NKT細胞分泌IFN- Y水平
[0045]用IFN-gamma 抗體包被 Elispot96_ 孔板:
[0046]在5ml PBS 中力卩入 lmg/mL 的抗人 IFN-Y 抗體 R4_6A2 (Pharmingen 公司-18181D) 25ul，使濃度達5ug/ml，每孔加入50ul，加蓋4°C過夜。棄去包被抗體，用含10 %胎牛血清的完全培養基(RPM1-10)洗滌一次，每孔加入200ul完全培養基，加蓋于室溫封閉2小時，棄去培養基。
[0047]NKT細胞激活:
[0048](I)取培養到第14天NKT細胞，胎盤藍計數，用R-5無酚紅培養基稀釋3個稀釋度(1X106、3.3X105和1X105)。分別加入到IFNi抗體包被Elispot96孔板中，使每孔體積為IOOul。
[0049](2)實驗組每孔加入IOOul含MHC-1限制性9肽(終濃度為lug/ml儲存濃度Iug/ul，應為 1: 500 稀釋)的 R1640-10。
[0050](3)對照組每孔加入IOOul培養基。[0051](4)陰性對照加入培養基。
[0052]混勻于37 °C，5 % CO2培養箱中培養24小時。
[0053]ELISP0T試劑盒操作:
[0054](I)用無菌水洗板2次，用I X洗滌緩沖液或PBST洗滌6次，每次洗滌時浸洗I~2min。
[0055](2)將抗體(生物素偶聯鼠抗人IFN- Y抗體)加至12ml (10組量)的稀釋緩沖液I中，終濃度為2ug/ml。
[0056](3)每孔加入50ul上步混合液，4°C過夜或室溫2小時。
[0057](4)用I X洗滌緩沖液或PBST洗滌3次。
[0058](5)將鏈霉親和素-辣根過氧化酶濃縮液A(BD公司)加至稀釋緩沖液比值為1: 100，每孔加入50ul混合液。
[0059](6) 4 °C過夜，用PBST洗滌4次，用PBS洗滌2次。[0060](7)每孔加50ul Elispot染色液(AEC底物，貨號:551951, 20ul的色原體(chronogen)加入到ImL的AEC底物溶液中)。
[0061](8)避光室溫放置5-60分鐘，棄去染色液，用蒸餾水洗滌
[0062](9)室溫空氣干燥2小時或過夜干燥，保存數據。
[0063]96孔Elispot板通過酶聯斑點圖像自動分析儀檢測斑點數，圖2中為酶聯斑點圖像自動分析儀檢測圖和斑點計數結果，左側為相應稀釋度的對照組，無IFN-Y Elispot斑點產生；右側為3個稀釋度的試驗組，IFN- Y Elispot斑點分別為37個、12個和8個；表明本發明制備的NKT細胞能分泌出IFN-Y細胞因子，在IO6的數量級是IFN-YElispot斑點可達到30個以上。
[0064]實施例三
[0065]患者外周血來源NKT細胞的培養
[0066]患者一:乳腺癌患者，女，34歲，血常規檢測結果為6.1 X IO9個白細胞/升。
[0067]患者一:肝癌患者，男，36歲，血常規檢測結果為3.6X109個白細胞/升。
[0068]患者三:黑色瘤患者，男，56歲，血常規檢測結果為7.0XlO9個白細胞/升。
[0069]患者四:卵巢癌患者，女，45歲，血常規檢測結果為6.6X IO9個白細胞/升。
[0070]患者五:肺癌患者，男，49歲，血常規檢測結果為4.7X IO9個白細胞/升。
[0071]與患者均簽署知情同意書。
[0072]采集患者50mL外周血經Ficoll-Hypaque密度梯度離心,得到單個核細胞。患者一、患者二和患者三按照實施例一的方法中藥附子多糖誘導培養NKT細胞。
[0073]患者四和患者五外周血來源的單個核細胞應用現有技術進行誘導培養，即使用含100ng/mL α -半乳糖神經鞘胺醇(a-Galcer)、50IU/mL白介素2和10% (v/v)胎牛血清的RPMI1640培養基(美國Gibco公司)進行連續培養，使用75cm2培養瓶進行擴瓶，并連續培養到第18天。
[0074]采用苔盼蘭染色計算培養到14天的NKT細胞數和細胞活率，以及NKT細胞通過流式抗體染色和流式細胞儀檢測，分析細胞表型；取IO6個NKT細胞通過Elispot檢測NKT細胞分泌IFN-Y水平。
[0075]表一
【權利要求】
1.中藥附子多糖誘導自然殺傷T細胞(NatureKiller T cell，NKT)增殖的制備方法，其特征在于人外周血、骨髓或臍帶血來源的單個核細胞，在中藥附子多糖和人重組白介素2條件下連續培養，獲得大量自然殺傷T細胞，表達NKl.1+和⑶8+，并分泌干擾素Y，在第14天時占淋巴細胞的比例12.15%以上，數量級可達5X IO9以上。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于人外周血、骨髓或臍帶血經體外分離純化，去除紅細胞、血小板和粒細胞等，獲得單個核細胞，單個核細胞用RPMI1640培養基重懸，苔盼蘭染色計數，使用RPMI1640完全培養基(含lug/mL-1000ug/mL附子多糖，lIU-400IU/mL IL-2,10% (v/v)胎牛血清)調整到細胞濃度為1_5X 106/mL，將細胞培養液放置到75cm2培養瓶中，每瓶30ml，于37°C、5% CO2培養箱中培養； 于第3、6、9、11、13、15、17天補充一倍體積的新鮮RPMI1640完全培養基(含Iug/mL-1000ug/mL 附子多糖，IIU-400IU/mLIL-2,10% (v/v)胎牛血清)，培養到第 14、16 和 18天收獲NKT細胞。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，誘導培養NKT細胞使用的RPMI1640完全培養基優選為含有10ug/mL-500ug/mL附子多糖，5IU-200IU/mL IL-2,10% (v/v)胎牛血清。
4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，將所述的NKT細胞進行細胞增殖和細胞表型檢測，苔盼蘭計數細胞增殖達到5X IO9以上；其高表達NKT細胞表型NKl.1+和CD8+，并分泌干擾素Y (IFNi)，其中，在第14天NKT細胞中含NKl.1+和CD8+雙陽性細胞為12.61%以上，酶聯免疫斑點檢測干擾素Y為30個以上。
5.權利要求1-4所述 制備NKT滿足在臨床抗腫瘤、抗病毒治療中的應用。
【文檔編號】C12N5/0783GK103834614SQ201410087827
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月12日 優先權日:2014年3月12日
【發明者】金光瑞, 王琳 申請人:甘肅中科生物科技有限公司