一種用于阿特拉津污染土壤修復的菌株復合載體材料及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于阿特拉津污染土壤修復的菌株復合載體材料及其制備方法和應用，本發明的一種菌株復合載體材料，是由阿特拉津降解菌株以及載體材料通過造粒制得，其中所述的載體材料由膨潤土、珍珠巖粉以及腐植酸組成。研究表明，本發明的菌株復合載體材料能夠有效提升菌種對高溫和紫外線的耐受力，且對土壤中的阿特拉津能夠達到完全降解，同時對土壤微生物多樣性擾動較小。因此，本發明所制備得到的用于土壤有機物污染修復的菌株復合載體材料為阿特拉津污染土壤的修復提供了技術支持，有效解決了阿特拉津污染土壤修復的問題，同時也為其它種類土壤有機污染的生物修復提供了參考。
【專利說明】一種用于阿特拉津污染土壤修復的菌株復合載體材料及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用于土壤有機物污染修復的載體材料及其制備方法和應用，特別涉及一種用于阿特拉津污染土壤修復的菌株復合載體材料及其制備方法和應用。本發明屬于土壤修復【技術領域】。
【背景技術】
[0002]土壤污染及其對整個生態系統的負面效應是當代人類面臨的主要問題之一(Umaret al., 2012; Yergeau et al.，2013)。阿特拉津(atrazine)是目前世界銷售額最大的18個除草劑品種之一 (Siripattanakul et al., 2009; Khan et al.，2013),在土壤中的半衰期長，容易對一些后巷敏感作物產生藥害(Anderson and Georgeson, 1989;Mandelbaum etal.，1995)，導致土壤微生物氧化損傷(Zhang et al.，2012a; 2012b)，引起土壤微生物群落多樣性降低(Moreno et al., 2007; Briceno et al.，2010),已被列為環境荷爾蒙的可疑物質(Cooper et al., 2000;Laws et al.，2000;Walid et al., 2010;Swain et al，2013),且對動物細胞具有遺傳學毒性(瞿建宏和吳偉，2002; Gammon et al.，2005)。我國從20世紀80年代初，開始在華北和東北地區的玉米田廣泛使用阿特拉津(Shen and Liu, 1992; Ye etal.，1999)，吉林吉化、河北宣化和浙江長興有全國三大阿特拉津生產廠家，每年阿特拉津原粉年產量可達數萬噸，阿特拉津在東北地區使用更加廣泛，僅遼寧一省就有5.3 X105hm2土地在使用阿特拉津除草，使用量超過1600t (司友斌和孟雪梅，2007)，我國已經將阿特拉津列為52種優先控制污染物之一 (Huang et al.，2013)。
[0003]阿特拉津的非生物降解研究主要集中在光氧化(Chan et al.，2004)、Fe (II)-H2O2原位化學氧化(Mecozzi et al.，2006)、UV_H202高級氧化(高燕飛等，2010)和微波(MW)/UV/H202共同處理(Chen et al., 2010)等方面，但是該類方法操作復雜且耗能較高，在實際應用中受到了限制。由于生物修復有機污染的溫和性和多樣性，兼具有成本低、操作簡便、無二次污染及處理效果好等優點，能達`到對污染土壤永久清潔修復的目的，是目前最有效、最可靠和最有前景的有機污染物修復手段(Gao et al.，2011)。因此，阿特拉津的生物修復已經成為了農藥污染控制領域的研究熱點。
[0004]目前，約有20多個種屬的微生物能降解阿特拉津，主要包括細菌、真菌、放線菌等(董春香和蔣桂蘭，2001; Seybold et al.，2001;郭火生等，2012; Zhanget al.，2012;王志剛等，2013)，并且在降解菌廉價發酵培養基的研究開發方面也取得了重要成果(Zhang etal.，2012c;王洋等，2013)，但是對于修復菌劑研發與應用研究在國內外報道還比較少，本研究旨在研發阿特拉津修復菌株復合載體材料及其制備方法，并對修復效果和土壤微生物多樣性的響應開展了研究工作，為阿特拉津污染土壤的修復提供技術支持，為其它種類土壤有機污染的生物修復提供參考。
【發明內容】
[0005]本發明的目的之一是提供一種用于阿特拉津污染土壤修復的菌株復合載體材料；
[0006]本發明的目的之二是提供一種制備上述菌株復合載體材料的方法；
[0007]本發明的目的之三是提供所制備得到的菌株復合載體材料在土壤有機物污染修復中的應用。
[0008]為了實現上述目的，本發明采用的技術手段為:
[0009]本發明的一種用于阿特拉津污染土壤修復的菌株復合載體材料，其特征在于由阿特拉津降解菌株以及載體材料通過造粒制得，其中所述的載體材料由膨潤土、珍珠巖粉以及腐植酸組成。
[0010]在本發明中，優選的，按重量計，所述的載體材料中膨潤土、珍珠巖粉以及腐植酸的比例為 0.5-1:0.5-1:0.5-1.5，更優選為 1:0.5:0.5。
[0011]在本發明中，優選的，所述的膨潤土的粒徑為325目，所述的珍珠巖粉的粒徑為90目，所述的腐植酸的粒徑為60目。
[0012]在本發明中，優選的，所述的阿特拉津降解菌株為阿特拉津降解菌DNS32，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC N0.5365，保藏日期為2011年10月21日。該菌株已記載在申請號為201110371730.9，發明名稱為“一株阿特拉津降解菌”的專利申請中，并于2012年06月13日公開。
[0013]在本發明中，優選的，所述的阿特拉津降解菌株按照1.0X IO7-L OX IO9CFU -g^1載體材料的比例，更優選的，是按照2.0X IO8CFU.g—1載體材料的比例滴加到載體材料中進行造粒，造粒完成后，自然風干至含水量為30%，即得。
[0014]在本發明中，優選的，所述`的造粒采用圓盤機造粒，圓盤造粒機的直徑為2.5m,造粒盤轉速為22r.mirT1,造粒盤傾角為45°~55°。
[0015]進一步的，本發明還提供了一種制備以上任一項所述的用于阿特拉津污染土壤修復的菌株復合載體材料的方法，其特征在于包括以下步驟:
[0016](I)活化阿特拉津降解菌株DNS32的斜面菌種，在基礎培養基中發酵培養24h，OD為0.8時，以發酵培養基體積的1%為接種量接種于發酵培養基中，25°C，120r.mirT1搖瓶發酵48h，至生物量為6 X IO8CFU.md X IO8CFU.mL—1，得到阿特拉津降解菌菌劑；
[0017](2)將膨潤土、珍珠巖粉以及腐植酸均勻混合制備得到載體材料；
[0018](3)按照 1.0X IO7-L OX IO9CFU.g-1 載體材料的比例，優選按照 2.0XlO8CFU.g-1載體材料的比例，將步驟(1)制備得到的菌劑滴加到載體材料中在圓盤上進行造粒；所述的造粒采用圓盤機造粒，圓盤造粒機的直徑為2.5m,造粒盤轉速為22r.mirT1,造粒盤傾角為45°~55°，造粒完成后，自然風干至含水量為30%，即得用于土壤有機物污染修復的菌株復合載體材料。
[0019]在本發明所述的方法中，優選的，所述的基礎培養基中含有K2HPO4L 6g.?ΛKH2PO40.4g.L-1, MgSO40.2g.L-1, NaCl0.1g.I71，葡萄糖 3.0g.I71,阿特拉津 0.1g.L-1,調PH為7.0,蒸餾水定容至1000ml ;所述的發酵培養基中含有:玉米粉39.494g.L_\大豆粉25.638g.ΙΛ CaC033g.?Λ Κ2ΗΡ043.265g.?Λ MgSO4.7Η200.2g.?Λ NaCl0.2g.L'i周 pH為7.0，蒸餾水溶解定容至1000ml。
[0020]在本發明所述的方法中，優選的，按重量計，所述的載體材料中膨潤土、珍珠巖粉以及腐植酸的比例為0.5-1:0.5-1:0.5-1.5，更優選為1:0.5:0.5。
[0021]再進一步的，本發明還提出了所述的菌株復合載體材料在土壤有機物污染修復中的應用，所述的有機污染物主要包括阿特拉津。
[0022]本發明采用正交試驗方法，以阿特拉津降解菌株的存活率為目標形狀，參考材料成球率，同時結合原料成本、價格和收益等統籌考慮選取合適的用量，從而對選用的膨潤土、珍珠巖粉、腐植酸混合用量進行優化，此外，結合本發明的制備工藝制備得到了適用于阿特拉津污染土壤修復的菌株復合載體材料。接著本發明發明人進行了不同溫度和紫外線照射時間對載體內菌株存活率影響的研究，結果表明本發明的菌株復合載體材料能夠有效提升菌種對高溫和紫外線的耐受力，且當膨潤土、珍珠巖粉和腐植酸質量比為1:0.5:0.5時效果最佳。
[0023]將采用最佳配比得到的載體材料添加到發酵菌體中制備得到菌株復合載體材料，進行土壤修復試驗。結果表明，按照菌株復合載體材料與修復土體的質量百分比計算，在菌株復合載體材料(載體菌劑)的添加量為0.1%和0.5%的處理中，35d時，阿特拉津基本完全降解，而采用自由菌處理的對照組阿特拉津殘留量均>16%，說明吸附載體增強了菌株的修復活力；通過檢測修復過程中土壤微生物Shannon多樣性指數和均勻度發現添加0.1%載體菌劑處理對土壤微生物多樣性擾動較小。因此，綜合比較阿特拉津降解效果、微生物群落多樣性變化及成本等因素，確定0.1%的載體菌劑添加量為最佳修復處理添加量。
[0024]綜上，本發明所制備得到的用于土壤有機物污染修復的菌株復合載體材料為阿特拉津污染土壤的修復提供了技術支持，有效解決了阿特拉津污染土壤修復的問題，同時也為其它種類土壤有機污染的生物修復提供了參考。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1為在15°C (a)、25°C (b)、40°C (c)和60°C (d)條件下不同載體中菌體存活率；
[0026]圖2為不同載體抗紫外線能力檢測；
[0027]圖3為阿特拉津在不同處理中的殘留曲線；
[0028]圖4為生物修復對土壤微生物Shannon多樣性指數和均勻度的影響。
【具體實施方式】
[0029]下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0030]實施例1用于阿特拉津污染土壤修復的菌株復合載體材料的制備
[0031]1、菌種與培養基
[0032]Acinetobacter sp.DNS32為本實驗室分離獲得的一株阿特拉津降解菌株(郭火生等，2012;王志剛等，2013) ，該菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC N0.5365，保藏日期為2011年10月21日。該菌株已記載在申請號為201110371730.9，發明名稱為“一株阿特拉津降解菌”的專利申請中，并于2012年06月13日公開。
[0033]基礎培養基(g? L—1) ：K2HP041. 6，KH2P040. 4，MgS040. 2，NaClO. 1，葡萄糖 3. 0，阿特 拉津0. 1，pH7. 0，蒸餾水定容至1000ml ；
[0034]發酵培養基（Zhanget al. , 2012) (g ? I71):玉米粉 39. 494，大豆粉 25. 638， CaC0s3, K2HP043. 265，MgS04 ? 7H200. 2，NaClO. 2，pH7. 0，蒸餾水溶解定容至 1000ml。
[0035]2、方法
[0036](1)活化阿特拉津降解菌株DNS32的斜面菌種，在基礎培養基中發酵培養24h，0D 為0. 8時，以發酵培養基體積的1%為接種量接種于發酵培養基，25°C，120r ? min—1搖瓶發 酵48h，至生物量為7. 2X108CFU ? mL—1左右，得到阿特拉津降解菌菌劑；
[0037](2)將膨潤土（325目)、珍珠巖粉（90目)、腐植酸(生物腐植酸> 40%,生化黃腐 酸≤20%，60目）按照重量比為1:0. 5:0. 5混合均勻制備得到載體材料；
[0038](3)按照2. OX 108CFU .g—1載體材料的比例，將步驟（1)制備得到菌劑滴加到載體 材料中在圓盤上進行造粒；所述的造粒采用圓盤機造粒，圓盤造粒機的直徑為2. 5m，造粒 盤轉速為22r ^化―1，造粒盤傾角為45°?55°，造粒完成后，自然風干至含水量為30%，即 得用于土壤有機物污染修復的菌株復合載體材料。
[0039]實施例2用于阿特拉津污染土壤修復的菌株復合載體材料的制備
[0040]1、菌種與培養基
[0041]同實施例1。
[0042]2、方法
[0043](1)活化阿特拉津降解菌株DNS32的斜面菌種，在基礎培養基中發酵培養24h，0D 為0. 8時，以發酵培養基體積的1%為接種量接種于發酵培養基，25°C，120r ? min—1搖瓶發 酵48h，至生物量為8X 108CFU ? mL—1左右，得到阿特拉津降解菌菌劑；
[0044](2)將膨潤土（325目)、珍珠巖粉（90目）、腐植酸(生物腐植酸> 40%,生化黃腐 酸≤20%，60目）按照重量比為0. 5:1:0. 5混合均勻制備得到載體材料；
[0045](3)按照IX 108CFU 載體材料的比例，將步驟（1)制備得到菌劑滴加到載體材 料中在圓盤上進行造粒；所述的造粒采用圓盤機造粒，圓盤造粒機的直徑為2. 5m，造粒盤 轉速為22r ^化―1，造粒盤傾角為45°?55°，造粒完成后，自然風干至含水量為30%，即得 用于土壤有機物污染修復的菌株復合載體材料。
[0046]實施例3用于阿特拉津污染土壤修復的菌株復合載體材料體系的建立及其在降 解阿特拉津中的應用
[0047]1 材料與方法（Materials and methods)
[0048]1. 1菌種與培養基
[0049]同實施例1，
[0050]1. 2菌劑制備與生物量測定
[0051]活化斜面菌種Acinetobacter sp. DNS32，在基礎培養基中發酵培養24h，0D為0. 8 時，按照體積百分比為1%接種于發酵培養基，25°C，120r ? mirT1搖瓶發酵48h，生物量約為 7. 2X108CFU ? mL'按照2. OX 108CFU ? g—1載體材料的比例在圓盤上滴加進行造粒。圓盤 造粒機的直徑為2. 5m,造粒盤轉速為22r ? mirT1,造粒盤傾角為45°?55° ,造粒結束后， 自然風干至含水量為30%，根據進料量和成球質量計算材料成球率。[0052]采用正交試驗方法，對選用的3種載體材料一膨潤土(325目)、珍珠巖粉(90目)、腐植酸(生物腐植酸> 40%，生化黃腐酸> 20%, 60目)的混合用量進行試驗，因素水平見表1。采用基礎培養基，進行10倍梯度稀釋，每個梯度設定5個平行，進行平板計數計算Acinetobacter sp.DNS32的存活率。在廣口瓶內避光室溫放置45d后，測定存活率，選取存活率較好的3個載體配比處理，設定3個平行，在廣口瓶中分別在15°C、25°C、40°C、60°C條件下儲存，放置0d、5d、10d、15d、20d后測定菌株存活率。同時，把3個載體配比處理均勻平鋪在培養皿上，每個處理3個平行，置于波長312nm紫外燈下IOcm處，分別照射Omin、20min、40min、60min和80min,測定菌株存活率。
[0053]表1因素質量比例水平
【權利要求】
1.一種用于阿特拉津污染土壤修復的菌株復合載體材料，其特征在于由阿特拉津降解菌株以及載體材料通過造粒制得，其中所述的載體材料由膨潤土、珍珠巖粉以及腐植酸組成。
2.如權利要求1所述的用于阿特拉津污染土壤修復的菌株復合載體材料，其特征在于按重量計，所述的載體材料中膨潤土、珍珠巖粉以及腐植酸的比例為0.5-1:0.5-1:0.5-1.5，優選 1:0.5:0.5。
3.如權利要求2所述的用于阿特拉津污染土壤修復的菌株復合載體材料，其特征在于所述的膨潤土的粒徑為325目，所述的珍珠巖粉的粒徑為90目，所述的腐植酸的粒徑為60目。
4.如權利要求1所述的用于阿特拉津污染土壤修復的菌株復合載體材料，其特征在于所述的阿特拉津降解菌株為阿特拉津降解菌DNS32，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC N0.5365，保藏日期為2011年10月21日。
5.如權利要求1或4所述的用于阿特拉津污染土壤修復的菌株復合載體材料，其特征在于所述的阿特拉津降解菌株按照1.0X IO7-L OX IO9CFU.g—1載體材料的比例，優選按照2.0X IO8CFU.g—1載體材料的比例滴加到載體材料中進行造粒，造粒完成后，自然風干至含水量為30%，即得。
6.如權利要求1或5所述的用于阿特拉津污染土壤修復的菌株復合載體材料，其特征在于所述的造粒采用圓盤機造粒，圓盤造粒機的直徑為2.5m,造粒盤轉速為22r.mirT1,造粒盤傾角為45°~55°。
7.制備權利要求1-6任一項所述的用于阿特拉津污染土壤修復的菌株復合載體材料的方法，其特征在于包括以下步驟: Cl)活化阿特拉津降解菌株DNS32`的斜面菌種，在基礎培養基中發酵培養24h，OD為0.8時，以發酵培養基體積的1%為接種量接種于發酵培養基中，25°C，120r -min^1搖瓶發酵48h，至生物量為6 X IO8CFU.md X IO8CFU.πι?Λ得到阿特拉津降解菌菌劑； (2)將膨潤土、珍珠巖粉以及腐植酸均勻混合制備得到載體材料； (3)按照1.0X IO7-L OX IO9CFU.g—1載體材料的比例，優選按照2.0X IO8CFU.g—1載體材料的比例，將步驟(1)制備得到的菌劑滴加到載體材料中在圓盤上進行造粒；所述的造粒采用圓盤機造粒，圓盤造粒機的直徑為2.5m,造粒盤轉速為22r.mirT1,造粒盤傾角為45°~55°，造粒完成后，自然風干至含水量為30%，即得用于土壤有機物污染修復的菌株復合載體材料。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于所述的基礎培養基中含有K2HPO4L6g.L—1，KH2PO40.4g.L-1, MgSO40.2g.L-1, NaCl0.1g.I71，葡萄糖 3.0g.I71,阿特拉津 0.1g.L-1,調PH為7.0,蒸餾水定容至1000ml ;所述的發酵培養基中含有:玉米粉39.494g.L_\大豆粉25.638g.ΙΛ CaC033g.?Λ Κ2ΗΡ043.265g.?Λ MgSO4.7Η200.2g.?Λ NaCl0.2g.L'i周 pH為7.0，蒸餾水溶解定容至1000ml。
9.如權利要求7所述的方法，其特征在于按重量計，所述的載體材料中膨潤土、珍珠巖粉以及腐植酸的比例為0.5-1:0.5-1:0.5-1.5，優選為1:0.5:0.5。
10.權利要求1-6任一項所述的菌株復合載體材料在阿特拉津污染土壤修復中的應用。
【文檔編號】C12R1/01GK103882003SQ201410087829
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月11日 優先權日:2014年3月11日
【發明者】張穎, 王志剛, 姜昭, 孟慶娟, 王蕾, 馮程程 申請人:東北農業大學