具有改善生長特征的木本植物以及使用轉錄因子制備它們的方法

具有改善生長特征的木本植物以及使用轉錄因子制備它們的方法
【專利摘要】本發明涉及用于從使用生物信息學工具、來自EST測序和DNA陣列的數據鑒定的大量候選基因中選擇具有可能的商業價值表型的基因的新型大規模分析平臺。本發明的一個方面提供了產生相比于野生型具有提高的生長的轉基因植物的方法。所述方法包括在植物中改變在木質形成的不同階段中特異性表達的至少一種基因的基因產物水平。這可以使用轉基因方法或特定雜交方法進行。本發明的另一些方面提供了具有根據本發明調節的基因表達的植物細胞或植物后代和木材。另一些方面涉及包含本發明核苷酸序列的DNA構建體以及包含所述DNA構建體的植物細胞或植物后代。
【專利說明】具有改善生長特征的木本植物以及使用轉錄因子制備它們的方法
[0001]本申請是申請日為2008年12月18日、申請號為“200880127543.2”、發明名稱為“具有改善生長特征的木本植物以及使用轉錄因子制備它們的方法”的中國專利申請的分案申請，原申請是國際申請PCT / SE2008 / 051495的中國國家階段申請。
發明領域
[0002] 本發明一般地涉及分子生物學領域，還涉及改善植物生長特征的方法。更具體地說，本發明涉及用于表型修飾植物和轉基因植物以及通過特定雜交方法獲得的植物的方法，所述植物具有改變的基因表達，其導致改變的生長表型。本發明還提供了可用于本發明方法的構建體。另外，本發明涉及所述植物的植物細胞或植物后代，以及本發明的植物產生的木材。
【背景技術】
[0003]目前，林木工程和分子育種的主要目標是改進木材的品質和產量。全球對木制品的需要每年增長約1.7%，盡管已經達到或超過全球森林的最大可持續收獲率，但是木材消耗量仍在增加。因此，需要提高全世界的種植木材生產。作為對日益增加的大氣CO2的響應，林業栽植還具有作為碳回收作物(carbon sequestration crop)的優點。類似地,希望來自非木本植物的生物質生產的增加，例如以滿足對能源生產原料的需要。因此，改變高等植物細胞發育過程中的特定過程具有很大的商業價值，這不僅是指改善樹木的特性，還包括其它植物。
[0004]通過頂端分生組織實現的植物生長使得一系列初生組織發育，還使得莖和根伸長。除了初生生長外，木本物種還發生次生生長，從形成層產生次生組織“木質”。次生生長提聞了莖和根的周長。
[0005]多年生植物例如長壽樹種具有顯著不同于一年生植物例如擬南芥(Arabidopsis)的生活方式，因為多年生植物例如樹具有無限的生長，而諸如擬南芥的植物在植物開花時生長終止。擬南芥植株的最終尺寸在許多方面取決于從萌芽到開花和結籽的發育程序。一個實例是這些事件發生時間的任何變化可顯著改變植物的大小。
[0006]多年生植物還在活躍生長期和休眠期之間循環。在活躍生長期間，葉進行光合作用，捕獲能量，然后其用于驅動多種細胞過程。轉化為蔗糖的固定碳輸送到莖組織和頂芽，在休眠狀態期間存儲在這里，最初作為淀粉，后來作為蔗糖。隨著休眠解除之后生長重新開始，該蔗糖轉移至活躍生長的組織，因為復蘇的早期階段在光合作用開始之前進行。類似地，對于氮，氨基酸也轉移到莖和頂端組織，在休眠期間儲存為貯藏蛋白，隨著生長的開始發生分解。因此，長壽樹種的生活周期與一年生作物有顯著差異，一年生作物經常將碳和氮轉移到種子中。由于一年生作物和多年生植物例如樹的這些差異，產量的決定因素和測量它們的能力很可能有很大差異。事實上，在許多情況下，模式系統(如歐美楊(PopulustremulaX tremuloides))更可靠地發現可用于增加生物質生產的基因。例如,對于一年生作物，已經提出將種子大小/產量作為植物大小和生產力的度量，但是情況不太可能是這樣，因為多年生植物例如樹木要花費數年才能開花，因此，種子產量(即便是的話)僅僅是在植物開花的年份中占優勢的生長條件指示。所以，直接轉用一年生作物中的研究和發現不太可能對樹木有用。
[0007]樹木生物質中非常重要的一部分存在于莖組織中。此生物質的積累是葉的光合作用和氮獲得以及營養再分配到多種細胞過程的結果。因此，葉的大小、葉光合作用、根系獲得氮能力的大小都可以是決定植物生產力和生物質生產的重要因素。但是，僅用它們自身并不能解釋整個生物質生產。例如，葉大小并不總是與生物質相關，因為葉大小可存在顯著的變化。此外，作物應對脅迫的能力是生物質生產的重要決定因素。因此，為了提高樹木的生物質生產，需要改變幾種因素。
[0008]此外，木質密度是生物質生產提高的重要性狀，木質密度的提高使得運輸體積減少,并且單位體積中含有更多的能量含量。因此，即使總生物質不增加,增加密度也是有意義的。密度的重要性還在于其顯示出，高度和直徑可測量生長的提高并不與木質密度的減少相偶聯。
[0009]一種增加生長的方式是了解更多的基因功能并且使用這些信息增加生長和生物質生產。這些基因功能的知識和使用這些知識的方法描述于本專利中。
[0010]大多數基因已在許多植物中得到鑒定，例如擬南芥(Arabidopsis thaliana)(Arabidopsis Genome Initiative2000)和歐美楊(Populus tremulaX tremuloides)(Sterky 等 2004)以及毛果楊(Populus trich ocarpa) (Tuskan 等 2006)。
[0011]Hertzberg等2001和Schrader等2005已經使用轉錄譜分析來顯示木質部發育過程中數千個基因的轉錄序位(transcriptional hierarchy)并提供表達數據。這些數據可利于進一步闡明具有未知功能的許多基因White等1999 ；Aharoni等2000。
[0012]仍存在的一個問題是如何鑒定參與調節細胞分裂以及其它生長相關過程的可能最重要的基因。在本發明中，我們檢測了許多轉錄因子的用途，在過表達時其導致出人意料的生長增加。選擇轉錄因子進行分析的原因是已知它們在活生物(包括植物)中是許多(如果不是大多數的話)過程的部分調節子。預計，擬南芥含有1500種不同的轉錄因子，根據序列同源性其可分為約30個亞類(Riechmann等2000)。某些轉錄因子在植物中的功能與所調節的基因緊密相關，例如，盡管轉錄因子亞類(如MYB類)中的轉錄因子是相似的，但是已知它們調節植物中若干不同的過程。轉錄因子是通過抑制或活化特定基因或含有不同基因的基因組區域的轉錄起始來調芐基因轉錄的蛋白質。
[0013]特別地，以前已經有過在植物中靶向轉錄因子，以發現可用于改變植物特征的基因。例如在W002 / 15675中，分析了很多轉錄因子，并提到了它們中許多的可能應用。US2007 / 0039070描述并列出了很多按樹(Eucalyptus)和福射松(Pinus radiata)的轉錄因子基因，并推測了這些基因的用途。本文中，我們給出了在顯著增加生長方面具有工業意義效果的特定轉錄因子，并有實驗數據的支持。
[0014]盡管，從使用DNA陣列技術進行的表達研究、基因組測序和EST程序得到的結果顯然可驗證基因在何處何時表達，但是僅從這些類型的分析工具不太可能闡明基因的生物和/或技術功能。為了分析和驗證基因功能，必須進行功能表征，例如通過基因失活和/或基因過表達來實現。但是 ，為了能夠鑒定目的基因以及最出人意料的商業特征，必須基于功能性分析以及用多種標準測量生長增加來評價候選基因。
[0015]MYB轉錄因子。本文給出的基因之一(SEQ ID NO:12)屬于MYB類轉錄因子。在擬南芥中，MYB轉錄因子家族預計有約180個成員(Riechmann等2000)。在植物中已經發現了MYB基因的幾種不同功能(Jin和Martinl999)。更具體地說，就我們所知，與SEQ ID NO:12密切相關的基因未顯示出參與調節生長速度和生物質生產。密切相關的基因AT2G01060和AB192880顯示參與生物脅迫應答，US2003101481和Katou等2005。
[0016]SET結構域轉錄因子(Ng等2007)。本文給出的基因之一 SEQ ID NO:11屬于SET結構域類轉錄因子。SET結構域蛋白質通過調節染色質結構來調節轉錄。已知擬南芥基因組含有至少29種有活性的set結構域蛋白。就我們所知，與SEQ ID N0:11密切相關的基因未顯示出參與調節生長速度和生物質生產。
[0017]bHLH類轉錄調節子在植物中是一個大的轉錄因子類別，例如在擬南芥中，預計有約139個成員(Riechmann等2000)。bHLH蛋白已經顯示參與了許多不同的過程,有關水稻中的綜述參見Xiaoxing等2006。本文給出的基因之一 SEQ ID NO: 10屬于bHLH類轉錄因子。就我們所知，與SEQ ID:10密切相關的基因未顯示出參與調節生長速度和生物質生產。
[0018] 基因SEQ ID:9屬于同源盒(Homeobox)類基因。與使用構建體TF0013過表達的基因最接近的擬南芥同源物預計為AT1G23380。與使用構建體TF0013過表達之基因相關的馬鈴薯(Solarium tuberosum)同源物的過表達降低了生長、節間長度和葉片大小(US7265263)。過表達與構建體TF0013過表達之基因相關的擬南芥同源物改變了葉片形態(US7265263, US20070022495和W001036444)。通過改變構建體TF0013過表達的基因的表達水平來提高產量和生物質生產，這在之前是未知的。
[0019]IAA / AUX類轉錄因子是主要發現于植物中的一小類轉錄因子(預計在擬南芥中有26個成員，Riechmann等2000)。對應于SEQID:13的基因屬于該類，其由Moyle等2002描述。就我們所知，與SEQ ID:13密切相關的基因未顯示參與調節生長速度和生物質生產。
[0020]WRKY基因家族。WRKY轉錄因子家族在植物中是一個大的基因家族。預計水稻中有超過90個成員，預計擬南芥有74個成員(Ulker和SomSSich2004)。與WRKY基因最相關的功能之一是傷口和病原體防御信號轉導，以及與非生物脅迫相關的信號轉導，和針對非生物和生物脅迫的抗性。
[0021]本文給出的基因中有八個屬于WRKY類轉錄因子。
[0022]SEQ ID:4和SEQ ID:7屬于WRKY基因的一個亞類。就我們所知，與SEQ ID:4和SEQ ID:7密切相關的基因未顯示出參與調節生長速度和生物質生產。
[0023]SEQ ID:1屬于WRKY基因的另一個亞類。與基因SEQ ID:1密切相關的擬南芥同源物(AT2G23320)被認為參與C / N感受(US20060272060)、改變葉片大小(US7238860、US20030226173、US20040019927 和 TO02015675)以及改變種子蛋白質含量(US20030226173)。根據專利申請W004087952，還認為AT2G23320參與對過氧化物脅迫的反應和適應。US20040019927、US7238860、US20030226173、W002015675 提到基因 AT2G23320涉及葉片大小提聞和樹聞增加，并推測該基因的過表達可用于增加生長和生物質生廣。在本文中我們顯示，SEQ ID:1可用于樹木中，從而以工業顯著程度增加生長。
[0024]SEQ ID:6屬于WRKY基因的一個亞類，該亞類與SEQ ID:1所屬亞類相關，但是明顯不同于這一基因類別。與該基因密切相關的基因已知在擬南芥中是基礎抗性的負調節物。Journot-Catalino等2006。認為密切相關的基因AT4G31550與種子異戊二烯基脂類和種子葉黃素水平相關(US20060195944和US20070022495以及W001035727)。另一個預測的SEQID:6的擬南芥同源物AT2G24570被認為參與C / N感受(US20070022495和20060272060)。就我們所知，與SEQ ID:6密切相關的基因未顯示出參與調節生長速度和生
物質生產。
[0025]SEQ ID:2屬于WRKY基因的另一個亞類。就我們所知，與SEQ ID:2密切相關的基因未顯示出參與調節生長速度和生物質生產。
[0026]SEQ ID:3和SEQ ID:5屬于一個大的含有2個WRKY結構域的WRKY基因類別。根據專利申請W02007003409，SEQ ID:3和SEQ ID:5的許多含有兩個WRKY結構域的相關同源物被認為在水稻(Oryza sativa)中參與改變種子產量和花數。通過改變表達水平來提高生長和生物質生產的用途之前是未知的。
[0027]SEQ ID:8屬于WRKY基因的另一個亞類。密切相關的擬南芥基因AT4G23810已知減少植物大小，并參與改變種子蛋白質含量(US20030226173)。另一個相關的擬南芥同源物(ATSG24110)已知參與改變種子蛋白質含量和誘導早開花(US20030226173)。就我們所知，與SEQID:8密切相關的基因未顯示出參與調節生長速度和生物質生產。

【發明內容】

[0028]本發明涉及可用于增加生長的新基因。通過使用著眼于基于多種標準的組合來分析生長行為的分析平臺發現了所述基因。本發明提供了產生轉基因植物的方法，其通過改變選自滿足所述標準的一組基因的一種或多種基因的表達來實現。因此，本發明涉及用于表型修飾植物和轉基因植物以及通過特異性雜交方法獲得的植物的方法，所述植物具有改變的基因表達，從而導致修飾的生長表型。本發明還提供了用于本發明方法的構建體。另外，本發明涉及所述植物的植物細胞或植物后代，以及本發明植物產生的具有出人意料的優良性能的木材。
[0029]使用該分析平臺分析的許多基因顯示令人感興趣的并且經常是出人意料的商業特性。因此，本發明的一個方面提供了產生與其野生型相比具有出人意料高生長的植物的方法，其包括改變(增加)植物中屬于轉錄因子序列SEQ ID:1-13、97-115之一的至少一種基因的基因產物的水平。
[0030]可通過將在溫室中在18小時光周期、22°C / 15°C (白天/夜晚)的溫度下培養八周且每周用1:100稀釋的Weibulls Rika S NPK7-1-5施肥的一組轉基因植物與相同條件下培養的一組野生型植物進行比較，來觀察所述生長的增加。
[0031]本發明的另一個方面提供了本發明的轉基因植物或者有意改變(增加)了 SEQID:1-13,97-115之一種基因的水平并包含重組多核苷酸的植物的植物細胞或植物后代。
[0032]本發明的另一個方面提供了由具有如上所述特征的目的植物產生的生物質和其產物。
[0033]本發明的另一個方面提供了包含至少一種本文所述序列的DNA構建體。
[0034]最后，本發明的一方面提供了包含根據本發明的DNA構建體的植物細胞或植物后代。【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1顯示了具有所示四種不同數據點線性回歸線的高度生長曲線實例，黑色回歸線顯示最大高度生長速度。
[0036]發明詳述
[0037]定義
[0038]在詳細討論本發明之前，首先定義下列術語和習慣用語:
[0039]術語“轉基因植物”指含有在相同物種、變種或栽培種的野生型植物中不存在的遺傳物質的植物。所述遺傳物質可包括轉基因、插入誘變事件(例如通過轉座子或T-DNA插入誘變)、活化標簽序列、突變序列、同源重組事件或通過嵌合修復術(chimeraplasty)修飾的序列。通常，外源遺傳材料是通過人為操縱引入植物中的。該術語還指已經插入遺傳物質作為選擇標記的植物。這些選擇標記的實例包括卡那霉素、潮霉素、膦絲菌素、氯磺隆、甲氨蝶呤、慶大霉素、大觀霉素、咪唑啉酮、d-氨基酸和草甘膦。
[0040]在本發明上下文中，術語“生長”包括初生生長，其包括莖和根的延長，還包括植物的次生生長， 其包括從形成層產生次生組織——“木質”，以及莖和根周長的增加。因此，“提高的生長”這一表述在上下文中涉及在相同生長條件下生長時，轉基因植物與轉基因植物所來源的野生型植物相比生長的提高。如下所述，如果植物滿足下文實施例中所定義的“生長差異選擇標準”至少之一的話，則轉基因植物表征為具有提高的生長。
[0041]術語“表型”在本文上下文中指單個植物的總體物理表現，例如生長。上下文中所用的不同生長表型的實例列于下表1.2中。
[0042]術語“基因”廣義地表示與生物學功能相關的任何DNA區段。基因包括編碼序列和/或其表達所需的調節序列。基因還包括非表達DNA核酸區段，其例如形成其它蛋白質的識別序列(例如啟動子、增強子或其它調節區)。可從多種來源獲得基因，包括從目的來源克隆或者從已知或預測的序列信息合成，并且可包括設計具有所需參數的序列。
[0043]“過表達”表示由引入宿主細胞的SEQ ID NO: 1_13、97_115的DNA或類似序列編碼的多肽或蛋白質的表達，其中所述多肽或蛋白質通常不存在于宿主細胞中，或者其中所述多肽或蛋白質以高于通常編碼所述多肽或蛋白質的內源基因所表達的水平存在于所述宿主細胞中。
[0044]本發明蛋白質的過表達可通過下述方式實現，首先構建嵌合基因，其中編碼區與能夠指導基因在所需發育階段在所需組織中表達的啟動子有效連接。嵌合基因可包含來源于相同基因的啟動子序列和翻譯前導序列。還可提供編碼轉錄終止信號的3'非編碼序列。本嵌合基因還可包含一個或多個內含子以利于基因表達。合適的啟動子可以是CaMV35S啟動子，其可與作為載體的農桿菌(Agrobacterium) —起使用。
[0045]術語“RNA干擾”或“RNAi ” 一般表示雙鏈RNA分子或短發夾RNA改變與其具有顯著同源性或完全同源性的核酸序列之表達的方法。
[0046]術語“RNAi下調”表示一種或多種RNAi物質介導的核酸序列表達減少。術語“RNAi物質”表示引發RNAi的獨特RNA序列。
[0047]術語“光周期”指每天的光照和黑暗周期。
[0048]術語“核酸構建體”、“DNA構建體”和“載體”表示用于轉化植物或其它生物的基因序列。核酸構建體或DNA構建體可以能在轉化植物中指導蛋白質或核酸序列的表達，例如反義RNA。通常，這些核酸構建體或DNA構建體至少包含與Y和:V翻譯調節元件有效連接的預期基因產物編碼區或者預期核酸產物。在一些實施方案中，這些核酸構建體或DNA構建體是嵌合的，即由來自不同來源的序列混合物組成。但是，非嵌合核酸構建體或DNA構建體也可用于本發明。
[0049]在與例如細胞、核苷酸、載體、蛋白質或多肽一起使用時，術語“重組的”通常表示所述細胞、核苷酸或載體已通過引入異源(或外源)核酸或者改變天然核酸而被修飾，或者表示所述蛋白質或多肽已通過引入異源氨基酸而被修飾，或者所述細胞來源于經這些修飾的細胞。重組細胞表達在天然(非重組)形式細胞中不存在的核酸序列(例如基因)，或者表達異常低表達或者根本不表達的天然核酸序列(例如基因)。術語“重組的”在修飾細胞時表示該細胞復制異源核酸，或者表達異源核酸所編碼的肽或蛋白質。重組細胞可含有天然(非重組)形式細胞中不存在的基因。重組細胞還可含有天然形式細胞中存在的基因，其中所述基因通過人工手段進行了修飾并重新引入細胞中。該術語還涵蓋下列細胞，其含有經修飾的細胞內源核酸,而不從該細胞除去所述核酸；這些修飾包括通過基因替換、定點突變和相關技術獲得的修飾。
[0050]術語“核酸序列”表示單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的多聚體。除非具體限定，否則該術語涵蓋含有已知天然核苷酸類似物的核酸序列，所述類似物具有與參考核酸 相似的結合特性，并且以類似于天然核苷酸的方式代謝。除非另有陳述，否則特定的核酸序列還暗示涵蓋其保守修飾的變體(例如簡并密碼子替換)和互補序列以及明確顯示的序列。
[0051]“多核苷酸”是包含多個聚合的核苷酸殘基的核酸序列，例如至少約15個連續的聚合核苷酸殘基，任選地至少約30個連續核苷酸，至少約50個連續核苷酸。在許多情況中，多核苷酸包括編碼多肽(或蛋白質)或其結構域或片段的核苷酸序列。另外，所述多核苷酸可包含啟動子、內含子、增強子區、多腺苷酸化位點、翻譯起始位點、5'或3'非翻譯區、報告基因、選擇標記等。多核苷酸可以是單鏈或雙鏈DNA或RNA。多核苷酸任選地包含修飾堿基或經修飾主鏈。多核苷酸可以是例如基因組DNA或RNA、轉錄本(例如mRNA)、cDNA、PCR產物、克隆的DNA、合成的DNA或RNA等。多核苷酸可包括有義或反義方向的序列。
[0052]術語“多肽”廣義地用于定義直鏈氨基酸殘基，包括天然的及其合成類似物。
[0053]在本發明上下文中，“互補”表示兩個核苷酸序列彼此精確配對的能力。例如，如果寡核苷酸某些位置的核苷酸能夠與DNA或RNA分子對應位置的核苷酸形成氫鍵，則該寡核苷酸和DNA或RNA被認為在該位置彼此互補。在寡核苷酸中足夠個數的核苷酸可與靶DNA或RNA中對應核苷酸形成氫鍵使得形成穩定復合物時，認為DNA或RNA鏈彼此互補。
[0054]因此，在上下文中，表述“互補序列”或“互補”還表示將在嚴格條件下與本發明的核酸分子退火的核苷酸序列。
[0055]術語“嚴格條件”指高嚴格、弱嚴格或低嚴格的一般條件。
[0056]術語“嚴格度”是本領域中公知的，用于表示進行核酸雜交的條件(溫度、離子強度以及其他化合物例如有機溶劑的存在情況)。與“弱”或“低”嚴格度條件相比，使用“高嚴格度”條件時，僅在具有高頻率互補堿基序列的核酸片段之間會發生核酸堿基配對。測試雜交的合適條件包括在5 X SSC中預浸泡，以及在20%甲酰胺、5 XDenhardt溶液、50mM磷酸鈉、pH6.8和50mg變性超聲處理的小牛胸腺DNA的溶液中在約40°C下預雜交I小時，然后在添加了 IOOmM ATP的相同溶液中在約40°C下雜交18小時，之后用2XSSC、0.2% SDS在40°C下清洗濾膜30分鐘(低嚴格度)，優選50°C (中嚴格度)，更優選65°C (高嚴格度)，甚至更優選約75°C (非常高的嚴格度)。有關雜交方法的更多細節可見于SambiOOk等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor, 1989。
[0057]術語“雜交”廣義地用于表示互補或部分互補的核酸序列之間的結合，例如使其分離的變性過程的反轉。雜交通過互補核苷或核苷酸堿基之間的氫鍵鍵合發生，其可以是Watson-Crick、Hoogsteen、反Hoogsteen氫鍵鍵合等。DNA中常見的四種核苷堿基是G、A、T和C，其中G與C配對，A與T配對。在RNA中，T被尿嘧啶(U)代替，其與A配對。核苷堿基中參與形成標準雙鏈體的化學基團組成Watson-Crick面。數年之后,Hoogsteen顯示嘌呤核苷堿基(G和A)除了沃森-克里克面之外還具有Hoogsteen面，其可從雙鏈體外被識另O，并且用于通過氫鍵鍵合結合嘧啶寡核苷酸，由此形成三螺旋結構。
[0058]“子序列”或“片段”是完整序列的任何一部分。因此，片段或子序列指分別包含較長氨基酸序列(例如多肽)或核酸(例如多核苷酸)的一部分的氨基酸或核酸序列。
[0059]在本文上下文中，術語“同源性”表示兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相似性，其由參數“序列同一性”描述。
[0060]術語“序列同一性”表示相同長度的兩個氨基酸序列之間或兩個核酸序列之間同源性程度的定量測量。如果比較不同長度的兩個序列，則它們必須將其進行比對以給出最佳可能匹配，允許插入缺口或者在多肽序列或核苷酸序列末端截短。序列同一性可以通過
【權利要求】
1.產生與其野生型相比生長和/或生物質受到調節的植物的方法，其包括改變該植物中至少一種基因的基因產物水平，所述基因包含選自下列的核苷酸序列: a)SEQ ID NO:1_10、12、13、97_115 的核苷酸序列； b)與SEQID N0:l-10、12、13、97-115的核苷酸序列具有至少60%同一性的核苷酸序列； c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。
2.根據權利要求1的方法，所述方法步驟包括: (i)提供包含選自下列的核苷酸序列的表達載體 a)SEQ ID NO:1-10、12、13、97_115 的核苷酸序列；或 b)與SEQID N0:l-10、12、13、97-115的核苷酸序列具有至少60%同一性的核苷酸序列；或 c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段，以及 d)與所述多核苷酸序列有效連接的至少一個調節元件，其中所述至少一個調節元件控制所述多核苷酸序列在靶植物中的表達； (?)將所述表達載體引入至少一種植物中；和 (iii)選擇與其野生型相比生長和/或生物質受到調節的至少一種轉基因植物。
3.根據權利要求1的方法，其包括 i)選擇表達選自下列的至少一種核苷酸序列的植物物種 a)SEQ ID NO:1_10、12、13、97_115 的核苷酸序列； b)與SEQID N0:l-10、12、13、97-115的核苷酸序列具有至少60%同一性的核苷酸序列； c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段， ?)將i)中選擇的植物物種與i)中選擇的相同或另一植物物種進行雜交， iii)選擇與i)中所選植物物種相比至少一種選自下列的核苷酸序列的表達受到調節的植物 a)SEQ ID NO:1-10、12、13、97_115 的核苷酸序列； b)與SEQID N0:l-10、12、13、97-115的核苷酸序列具有至少60%同一性的核苷酸序列； c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段， iv)任選地，將iii)中所得植物回交一次或多次，并選擇與任何i)中所用植物物種和/或iii)中所得植物相比至少一種選自下列的核苷酸序列的表達受到調節的植物 a)SEQ ID NO:1_10、12、13、97_115 的核苷酸序列； b)與SEQID N0:l-10、12、13、97-115的核苷酸序列具有至少60%同一性的核苷酸序列； c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。
4.根據權利要求1-3中任一項的方法，其中所述受到調節的表達通過引入遺傳修飾來實現，優選在編碼包含SEQ ID NO:1-10、12、13、97-115多肽或這些多肽之同源物的基因座中引入。
5.根據權利要求4的方法，其中所述修飾通過下列之一來實現:使用SEQID NO:1-10,.12、13、97-115中一種或多種作為該方法任何步驟中的標記物的T-DNA活化、TILLING、同源重組、定點誘變或定向育種。
6.根據權利要求1-4中任一項的方法，其中所述調節是生長和/或生物質的產量提高。
7.根據權利要求1、2、4-6中任一項的方法，其包括提供重組DNA構建體的步驟，所述構建體包含選自下列的核苷酸序列: a)包含選自SEQID NO:1-10、12、13、97-115之序列的核苷酸序列； b)與核苷酸序列a)互補的核苷酸序列； c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段； d)與a)、b)和c)中任一序列具有至少60%同一'丨生的核酸序列；和 e)在嚴格條件下與核苷酸序列a)、b)或c)雜交的核苷酸序列。
8.根據權利要求1、2、4-7中任一項的方法，其中所述核苷酸序列編碼包含多肽(a)的保守性替換變體的多肽。
9.根據權利要求1、2、4-8中任一項的方法，其中所述核苷酸序列包含核苷酸序列中的沉默替換。
10.根據權利要求1、2、4-9中任一項的方法，其中所述子序列或片段與權利要求7的(a)中所述核苷酸序列的保守結構域具有至少65%的序列同一性。
11.根據權利要求7至10中任一項的方法，其中所述重組DNA構建體還包含與所述核苷酸序列有效連接的組成型、誘導型或組織特異性啟動子。
12.根據權利要求7至10中任一項的方法，其中所述重組DNA構建體在包含權利要求7所定義核苷酸序列的轉錄盒之前還包含強組成型啟動子，所述轉錄盒之后是植物功能性內含子，之后是反向的權利要求4中所定義核苷酸序列。
13.根據權利要求7至12中任一項的方法，其中所述方法還包括用所述重組DNA構建體轉化植物的可再生細胞以及從所述轉化細胞再生轉基因植物的步驟。
14.與其野生型相比生長和/或生物質受到調節的植物，其包含能夠改變該植物中至少一種基因的基因產物水平的核苷酸，其中所述至少一種基因包含選自下列的核苷酸序列: a)SEQ ID NO:1_10、12、13、97_115 的核苷酸序列； b)與SEQID NO:1-10、12、13、97-115的核苷酸序列有至少60%同一性的核苷酸序列； c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。
15.轉基因植物，其包含重組多核苷酸(DNA構建體)，所述重組多核苷酸(DNA構建體)包含選自下列的核苷酸序列: a)包含選自SEQID NO:1-10、12、13、97-115之序列的核苷酸序列； b)與核苷酸序列a)互補的核苷酸序列； c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段； d)與a)、b)和c)中任一序列具有至少60%同一'丨生的核酸序列；和 e)在嚴格條件下與核苷酸序列a)、b)或c)雜交的核苷酸序列。
16.根據權利要求15的轉基因植物，其中所述核苷酸序列編碼包含a)或d)多肽之保守性替換變體的多肽。
17.根據權利要求15至16中任一項的轉基因植物,其中核苷酸序列包含核苷酸序列中的沉默替換。
18.根據權利要求15至17中任一項的轉基因植物，其中所述子序列或片段與權利要求16所述核苷酸序列的保守結構域具有至少65%的序列同一性。
19.根據權利要求15至18中任一項的轉基因植物，其中所述重組DNA構建體還包含與所述核苷酸序列有效連接的組成型、誘導型或組織特異性啟動子。
20.根據權利要求14至19中任一項的轉基因植物，其中所述重組DNA構建體在包含權利要求4中所定義核苷酸序列的轉錄盒之前還包含強組成型啟動子，所述轉錄盒之后是植物功能性內含子，之后是反向的權利要求16中所定義核苷酸序列。
21.植物的植物細胞或植物后代，所述植物可以是根據權利要求14至20中任一項的轉基因植物。
22.植物生產的木材，所述植物可以是根據權利要求14至20中任一項的轉基因植物。
23.DNA構建體，其包含權利要求7至10所述的至少一種序列。
24.植物細胞或植物后代，其包含權利要求23的DNA構建體。
25.權利要求1-24中任一項的核苷酸序列，其中所述a)的序列選自SEQIDNO:1、4、6、7、9、10、101、102、104、106 和 107。
【文檔編號】C12N15/11GK103911392SQ201410108913
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2008年12月18日 優先權日:2007年12月28日
【發明者】芒努斯·赫茨貝里, 里希凱希·巴勒勞, 大衛·約恩森, 利努斯·默勒, 帕埃爾·瓊森 申請人:瑞典樹木科技公司