枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA及應用，枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA序列如SEQ?ID?No.1所示。本發明所構建的包含有枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA（C725T）的工程菌生物安全，遺傳背景清晰、包含的突變基因purA（C725T）可以大幅提高枯草芽孢桿菌合成核黃素的能力，在搖瓶發酵條件下，提高核黃素積累水平40%以上。
【專利說明】枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術與分子生物學領域，具體地涉及到枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因PUrA (C725T)及該基因編碼的氨基酸序列及應用。
【背景技術】
[0002]以細菌為宿主菌的基因工程菌具有發酵周期短、原料要求簡單、成熟的基因工程技術等優點。在芽孢桿菌屬中，包括枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)在內的許多菌株具有可靠的安全性。傳統菌株選育發現，枯草芽孢桿菌的突變株能夠過量合成葉酸、腺苷、肌苷、鳥苷、核黃素等一系列嘌呤途徑代謝中間產物或該途徑的衍生代謝產物，目前成為選育高產嘌呤類代謝產物重要出發菌株。作為模式菌株，目前對其生理生化特性及遺傳背景已經有了比較深入的了解，相關的分子生物學方法和基因操作技術都比較成熟，也有利于通過理性代謝工程及系統生物學手段來選育嘌呤類代謝產物高產菌種。
[0003]腺苷琥珀酸合成酶是微生物嘌呤生物合成途徑中重要的酶，在枯草芽孢桿菌中，該酶催化GTP (鳥苷三磷酸)依賴的MP (次黃嘌呤核苷酸)和天冬氨酸轉化生成中間產物腺苷酸代琥珀酸(adenylosuccinate)，后者在腺苷酸代琥珀酸裂解酶的作用下，脫去延胡索酸，生成AMP (腺嘌呤核苷酸)。目前是許多核苷類代謝產物高產菌株的重要基因工程操作靶點，比如用于高產核黃素、肌苷、鳥苷、鳥嘌呤等工程菌株的遺傳改造。核黃素(分子式C17H20O6N4, IUPAC中文名:7，8- 二甲基-10- (I’ -D-核糖基)-異咯嗪)是人體必需的13種維生素之一，為黃素酶類的輔酶組成部分，在生物體內主要以黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的形式存在。它作為黃素蛋白的輔酶參與機體組織呼吸鏈電子傳遞及氧化還原反應，在呼吸和生物氧化中起著重要的作用。核黃素生物合成來自于嘌呤途徑的代謝產物GTP，通過核黃素操縱子表達的一系列酶催化，最終合成核黃素。
[0004]目前，對于采用枯草芽孢桿菌為宿主構建核黃素合成工程菌，尚未有枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA (C725T)用于核黃素高產菌種的選育的報道。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種能夠提高枯草芽孢桿菌核黃素合成能力的枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA。
[0006]本發明的第二個目的是提供一種枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA編碼的氨基酸序列。
[0007]本發明的第三個目的是提供一種包含有枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA的工程菌。
[0008]本發明的第四個目的是提供包含有枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA的工程菌的應用。
[0009]本發明的技術方案概述如下:
[0010]枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA (C725T)，其特征是所述突變基因purA (C725T)序列如 SEQ ID N0.1 所示。
[0011]枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA (C725T)編碼的氨基酸序列，所述氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0012]包含有枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA (C725T)的工程菌。
[0013]包含有枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA (C725T)的工程菌產核黃素的應用。
[0014]本發明所構建的包含有枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA (C725T)的工程菌生物安全，遺傳背景清晰、包含的突變基因purA (C725T)可以大幅提高枯草芽孢桿菌合成核黃素的能力，在搖瓶發酵條件下，提高核黃素積累水平40%以上。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1為工程菌株B.subtilis RCl和B.subtilis RC4核黃素合成水平發酵驗證。【具體實施方式】
[0016]下面結合實施例對本發明做進一步說明，下述實施例是為了使本領域的技術人員能夠更好地理解本發明，但對本發明不作任何限制。
[0017]本發明所用到的原始菌株B.subtilisl68 來源為 BGSC(Bacillus Genetic StockCenter, http://www.bgsc.0rg/)。本發明所用到的原始質粒pUC18購買于生工生物工程(上海)股份有限公司(http://www.sangon.com/)。
[0018]本發明所用到的核黃素標準品從Sigma公司(http://www.sigmaaldrich.com/sigma-aldrich)購買,所用限制性內切酶、去磷酸化酶、DNA連接酶等分子生物學試劑從Thermo 公司購買(http://www.thermoscientificbi0.com/fermentas)。所用其他生化試劑從生工生物工程(上海)股份有限公司購買(http://www.sangon.com/)。
[0019]實施例1:無抗生素標記篩選枯草芽孢桿菌系統出發菌株B.subtilis BUK和基礎操作質粒pss的構建
[0020]本發明中所用到的枯草芽孢桿菌出發菌株B.subtilis BUK來源于B.subtilisl68,基礎操作質粒pSS來源于pUC18，二者詳細構建過程可參考公開發表文獻
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[0021]本發明對該基礎操作質粒pSS的構建方法以及抗性基因的選擇不做限定。
[0022]實施例2:工程菌株B.subtilis RCl構建過程
[0023](1)向菌株B.subtilis BUK基因組上無痕引入基因突變ribC* (G596A)操作流程如下:
[0024]利用ribC*-F-U、ribC*-F-L和 ribC*-B-U、ribC*-B-L兩對引物，以 B.subtilisl68基因組為模版 ，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶擴增分別得到大小為894bp和928bp的上下游同源臂ribC*-F和ribC*-B。ribC*-F的PCR片段經切膠回收后，使用Thermo Fastdigest AatII和XhoI雙酶切，連接、轉化質粒pSS后得到質粒pSS-ribO-F。ribO-B的PCR片段經切膠回收后，使用Thermo Fast digest Sail和Seal雙酶切，連接、轉化質粒pSS-ribC*-F后得到這質粒pSS_ribC*-FB。將測序結果正確的質粒通過Spizizen轉化導入枯草芽孢桿B.subtilis BUK中，用含氯霉素LB固體培養基中篩選重組成功的陽性克隆，并用菌落PCR驗證。挑出的轉化子接種于5ml LB液體培養基中，200rpm震蕩培養6h (OD約為2)，并在五氟尿嘧啶基本培養基(添加終濃度為5 μ mol/L FMN)上挑出菌落，使用引物ribC*-F-U、ribC*-B-L進行PCR和測序驗證，得到ribC* (G596A)正確引入的陽性菌株B.subtilis RCl0
[0025]實施例3:工程菌株B.subtilis RC4構建(引入腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA(C725T))
[0026]利用purA*_F_U、purA*_F_L 和 purA*_B_U、purA*_B_L 兩對引物，以 B.subtilisl68基因組為模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶擴增分別得到大小為933bp和922bp的上下游同源臂purA*_F和purA*_B。purA*_F的PCR片段經切膠回收后，使用Thermo Fast digestNdeI和NcoI雙酶切，連接、轉化質粒pSS后得到質粒pSS-purA*_F。purA*_B的PCR片段經切膠回收后，使用Thermo Fast digest Sail和KpnI雙酶切,連接、轉化質粒pSS_purA*_F后得到這質粒pSS-purA*-FB。將測序結果正確的質粒通過Spizizen轉化導入枯草芽孢桿B.subtilis RCl中，用含氯霉素LB固體培養基中篩選重組成功的陽性克隆。將正確的陽性克隆接種于5ml LB液體培養基中，200rpm震蕩培養6h，并在五氟尿嘧啶基本培養基上(添加終濃度為45 μ mol/L腺嘌呤)挑出菌落，使用引物purA*-F-U、purA*_B_L進行PCR和測序驗證，得到腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA (C725T)正確引入的菌株，命名為B.subtilis RC4，其中枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA (C725T)序列如SEQ ID N0.1所示，腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA (C725T)所編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0027]LB液體培養基配方為:10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，調節pH至
7.5。0.1Mpa壓力下滅菌20min。LB固體培養基配方為:在LB液體培養基中加入瓊脂粉(終濃度15g/L),0.1Mpa壓力下滅菌20min。五氟尿嘧唳基本培養基配方見表1:
[0028]表1五氟尿嘧啶基本培養基配方
[0029]
【權利要求】
1.枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA，其特征是所述突變基因PurA序列如 SEQ ID N0.1 所示。
2.權利要求1所述的枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因PurA編碼的氨基酸序列，其特征是所述氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.包含 有枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA的工程菌。
4.權利要求3所述的包含有枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA的工程菌產核黃素的應用。
【文檔編號】C12N1/21GK103952419SQ201410150346
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月15日 優先權日:2014年4月15日
【發明者】王智文, 王光路, 石婷, 陳濤, 趙學明 申請人:天津大學