一種鑒定水稻粒長基因gs3不同基因型的四引物分子標記方法
【專利摘要】本發明涉及一種鑒定水稻粒長基因GS3不同基因型的四引物分子標記方法，屬農業生物工程【技術領域】。根據長、大粒品系TD70和短、小粒品種Kasalath在粒長基因GS3核苷酸堿基序列上的差異，設計合成四條標記引物，加入同一PCR反應體系對不同水稻DNA進行擴增，區分GS3不同基因型純合體和雜合體。本發明不僅能快速、準確的鑒定水稻種質資源或育種群體中粒長基因GS3的不同基因型，而且在育種能提高對長粒基因型GS3-TGS3-T的選擇效率，加速長粒優質、高產水稻新品種選育進程。
【專利說明】—種鑒定水稻粒長基因GS3不同基因型的四引物分子標記方法
一、【技術領域】
[0001]本發明涉及一種鑒定水稻粒長基因GS3不同基因型的四引物分子標記方法，屬于生物技術工程領域，專用于含GS3-TGS3-T基因型長粒優質、高產水稻資源的篩選、鑒定和標記輔助育種。
二、【背景技術】
[0002]我國是稻米生產和消費大國，全國有60%以上的人口以大米為主食。近年來，隨著人民生活水平的提高和國內外稻米市場競爭的加劇，優質稻米開始展現出廣闊的市場前景，并受到越來越多消費者的青睞。因此，在保證水稻單產提高的基礎上，改良稻米品質已成為水稻育種的重要課題(易俊良等，分子植物育種，2011，9(19): 1134-1151)。
[0003]粒長是水稻粒型的重要因素，它不僅與產量構成因子中的千粒重密切相關，同時也影響稻米的外觀和碾磨品質。粒型偏長，稻米堊白粒率低、外觀品質優、商品性好，一些市場熱銷的優質大米如泰國和東北香米都具有粒型偏長的特征。因此，粒長性狀的選擇在品質育種中具有重要作用。然而，從遺傳來講，粒長是一個受多基因控制的典型數量性狀，易受到環境條件的影響，采用傳統育種的方法很難對稻谷的粒長性狀進行有效改良(宮李輝等，植物學報，2011，46 (6): 597-605)。
[0004]近年來，隨著水稻功能基因組學研究的深入，水稻粒長性狀的遺傳解析取得了一系列突破性的進展。許多研究者利用不同的遺傳群體和分子標記在水稻12條染色體上定位到70多個和谷粒長度相關的QTL，其中以第2、3、7、10染色體上檢測的QTL數最多，且效應較大(高志強等，遺傳，2011，33(4):314-321)。從已定位QTL的數量和位置來看，水稻粒長性狀的遺傳機制非常復雜，不同來源的親本和群體類型以及環境條件都會影響QTL定位的準確性，因而目前克隆的粒長基因并不多。GS3是位于水稻第3染色體著絲粒附近的主效粒長QTL，它不僅影響籽粒的長度，同時與粒重也具有相當緊密的關系。完整的GS3基因全長6648bp，有5個外顯子，編碼232個氨基酸的蛋白，它具有類PEBP的結構域、跨膜區、富半胱氨酸的TNFP/NGFR家族結構域及VWFC組件。核酸序列分析發現，與短、小粒水稻相t匕，長、大粒品種GS3在第2外顯子上存在一個單核苷酸的變異，導致原來編碼半胱氨酸的TGC密碼子突變為終止密碼子TGA，使蛋白翻譯提前終止，造成類PEBP結構域等4個保守區域的序列丟失，進而喪失基因功能，使籽粒長度和重量增大，這說明GS3基因編碼的蛋白具有負向調控的作用(Fan C C，et al., Theoretical and Applied.Genetics, 2006, 112 (6):1164-1171;Mao H L, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2010，107 (45):19579-19584)。
[0005]基因進化研究表明，GS3位點在水稻中具有非常廣泛的分布，235個亞洲栽培稻中34%的品種，特別是熱帶粳稻都具有長粒GS3的純合基因型，這有利于水稻長粒種質資源的篩選、鑒定和品種改良。從基因效應來看，GS3對水稻粒長的作用非常明顯，它在不同的環境條件中都能穩定表達。據估計，在不同遺傳群體中GS3基因的加性效應范圍變幅為0.23~
1.47mm，可解釋粒長表型變異的25.0%~95.6%。由此可見，作為水稻中少數效應較大、且分布廣泛的粒長基因，GS3在稻米品質和產量改良中具有非常重要的作用(Noriko T K, etal.，Genetics, 2009，182(4):1323-1334)。
[0006]為提高GS3不同基因型的選擇效率，許多研究者進行了大量的嘗試。楊梯豐等利用 5 個連鎖的微衛星(Simple Sequence R印eats, SSR)標記 RM6146、RM3646、RM16、PSM127和RM347對GS3基因型進行輔助選擇，改良華粳秈74的外觀品質。然而，由于這些標記僅與目標基因存在連鎖關系，而非功能性標記，因此其帶型差異不能直接反映GS3基因型的變化，難以保證每個單株基因型鑒定的準確性(楊梯豐等，分子植物育種，2010，8(1):59-66)；Wang et al.根據GS3基因在第2外顯子G-A的突變設計了能準確區分三種基因型的酶切擴增多態序列(Cleaved Amplied Polymorphic Sequence CAPS)標記,但涉及限制性內切酶PstI的使用，存在操作煩瑣，費用昂貴、效率低下等弊端(Wang C, etal., Theoretical andApplied Genetics, 2011，122(5):905-913)。因此，建立一種新的基于PCR技術的基因分型法來快速、準確的鑒定粒長基因GS3的不同基因型已成為水稻品質、產量育種亟待解決的技術難題。
三、
【發明內容】
[0007]技術問題:本發明針對利用連鎖微衛星標記和CAPS標記區分粒長基因GS3不同基因型過程中存在的準確性差、試驗流程煩瑣、費用昂貴等缺陷，根據長、大粒品種GS3位點在第2外顯子上存在的C到A的單核苷酸堿基突變，設計四條基因特異性引物并采用一步PCR的方法來快速、準確的鑒定GS3的不同基因型，以達到長粒水稻種質資源篩選、鑒定和標記輔助育種的目的，同時提高對粒長增效基因型的選擇效率，加速長粒型優質、高產水稻的品種選育進程。
[0008]技術方案:
[0009]本發明“一種鑒定水稻粒長基因GS3不同基因型的四引物分子標記方法”，其特征在于:GS3基因的特異性引物
[0010]正向外引物GS3-0-F 序列:5’ -CCTCAGACATCACCTGAAAAGTTGACAGGC-3’
[0011]反向外引物GS3-0-R 序列:5’ -CGGTCAAAGTTCATGATCAAAAACTGGGG-3’
[0012]正向內引物GS3-1-F 序列:5’ -TCCACGCTGCCTCCAGATGCCGA-3’
[0013]反向內引物GS3-1-R 序列:5’ -AGAAACAGCAGGCTGGCTTACTCTTTG-3’，
[0014]利用上述引物快速區分 水稻粒長基因GS3不同基因型的四引物分子標記方法為:
[0015](I)水稻植株基因組DNA 的提取(SDS法)，參照Dellaporta S L, et al., Plant MolBiol Rep, 1983，1 (1):19221 ；
[0016](2)將所述的四條分子標記引物GS3-0-F、GS3-0-R、GS3-1-F和GS3-1-R加入同一 PCR反應體系，并對水稻種質資源或育種群體植株的DNA進行擴增；20 μ LPCR反應體系包括:20ng/ μ L 的 DNA2.0 μ L，4nmol/L 的引物 2.0 μ L，其中引物 GS3-0-F、GS3-0-R、GS3-1-F 和 GS3-1-R 各 0.5 μ L，含 25mmol/LMgCl2 的 10XPCRBuffer2.0 μ L, 2.5mmol/L 的dNTP0.4 μ L, 2U/ μ L 的 Taq0.5 μ L 和 ddH2013.1 μ L ；
[0017]PCR反應程序包括:94°C預變性5min ;然后94°C變性30s、63.4°C復性30s、72°C延伸lmin，循環33次；然后72°C延伸IOmin后，將擴增產物加上樣緩沖液終止反應。
[0018](3)反應產物在質量比濃度為2.0%的瓊脂糖凝膠上100V電泳50min，經DuRed核酸染色并于凝膠成像系統下觀察，記載。如果同時含有270bp和145bp兩條特征條帶，則為含粒長基因型GS3-TGS3-T的純合體；如果同時含有270bp和175bp兩條特征條帶，則為含粒長基因型GS3-KGS3-K的純合體，如果同時存在270bp、175bp和145bp的三條特征條帶，則為含粒長基因型GS3-TGS3-K的雜合體。
[0019]有益效果
[0020]本發明提供的“一種鑒定水稻粒長基因GS3不同基因型的四引物分子標記方法”，具有以下優點:
[0021](I)本發明提供的分子標記并非與粒長基因GS3連鎖的分子標記，而是根據基因間的堿基變異設計的功能性標記，它能直接反映植株的基因型和表型，不存在由于標記和基因間的遺傳交換而造成基因型鑒定的錯誤；
[0022](2)本發明提供的分子標記方法能實現對長、大粒水稻種質資源GS3基因型的快速鑒定。由于水稻粒長性狀是由多基因控制的數量性狀，僅根據粒長表型很難確定水稻中是否具有GS3的目標基因型，而本發明提供的分子標記方法能直接對水稻資源進行鑒定，明確其基因型；
[0023](3)本發明提供的分子標記方法能有效用于長、大粒水稻品種的分子標記輔助選擇。由于傳統育種中對粒長性狀的選擇主要依靠肉眼觀察和長度測量，這樣的方法不僅受植株生長發育階段的影響，而且耗時、耗力，而利用GS3基因的四引物PCR標記可以在苗期對GS3長粒純合基因型的單株進行鑒定、選擇，淘汰大量非目標單株，這在很大程度上提高了長粒型水稻品種的選擇效率，縮短育種周期和減少育種成本；
[0024](4)與現 有鑒定粒長基因GS3不同基因型的微衛星標記和CAPS標記相比，本發明采用四引物一步PCR擴增的方法對GS3基因型進行鑒定，不僅能有效區別其純合和雜合基因型，而且還可以避免檢測過程中準確性差、試驗流程煩瑣、費用昂貴等弊端，更為高效、快捷，適合于對大量水稻資源和育種材料進行鑒定和選擇。
四、【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1長、大粒品系TD70與短、小粒品種Kasalath籽粒長度的比較
[0026](A:含GS3-TGS3」純合基因型長、大粒水稻品系-TD70 ；B:含GS3-KGS3_K純合基因型短、小粒水稻品種-Kasalath)
[0027]圖2用于檢測粒長基因GS3不同基因型的四引物PCR分子標記設計策略
[0028](注:序列比較圖中方框代表GS3基因在長、大粒品系TD70和短、小粒品種Kasalath中存在的堿基差異；箭頭表示引物位置和長度，GS3_0_F表示正向外引物，GS3-0-R表示反向外引物，GS3-1-F表示正向內引物，GS3-1-R表示反向內引物)
[0029]圖3四引物PCR分子標記對不同水稻品種GS3基因型的檢測
[0030](M:DNA 分子量標準，100-2，OOObp ；1:TD70 ；2 =Kasalath ；3 ~17:武粳 13、日本晴、蘇御糯、桂朝糯、南粳44、武運粳23、9311、明恢63、珍汕97、桂朝2號、龍特甫、蜀恢527、蜀恢158、華占和南京11)
[0031]圖4四引物PCR分子標記對TD70/Kasalath重組自交系群體(RILs)不同株系GS3基因型的檢測
[0032](M:DNA 分子量標準，100-2，OOObp ；1:TD70 ；2 =Kasalath ；3 =TDTOAasalathF1 ；4~7:部分重組自交系植株)
[0033]圖5本發明分子標記方法用于水稻品種Kasalath粒長性狀的改良過程
[0034]圖6Kasalath和Kasalath_GS3_T改良系籽粒長度的比較
[0035](A:含GS3-KGS3_K純合基因型短、小粒水稻Kasalath ；B:含GS3_TGS3_T純合基因型長、大粒水稻Kasalath-GS3-T)
五、【具體實施方式】[0036]通過對江蘇省農業種質資源中期庫低溫保藏的3000余份水稻種質資源進行粒型性狀的鑒定、分析，從中篩選到1份來源于天鵝谷///9520/7(72-496/御糯)雜交后代的長、大粒粳稻穩定品系TD70。利用TD70與短、小粒印度秈稻品種Kasalath雜交，經單粒傳法構建了包含240個株系重組自交系群體，通過分子連鎖圖譜的繪制和2010-2011連續兩年的QTL定位分析，在水稻染色體上定位到多個與粒型相關的QTL，其中在第3染色體上定位到I個粒長QTL-qGL3_l。通過對TD70和Kasalath基因組DNA的測序分析，確定了 qGL3_l就是已報道的GS3基因，一個位于水稻第3染色體著絲粒附近控制粒長性狀的主效QTL。與短、小粒水稻品種Kasalath相比，長、大粒品系TD70在該基因第2外顯子165位核苷酸處存在一個單堿基C-A的變異，由原來編碼半胱氨酸的TGC突變成終止密碼子TGA，使得蛋白翻譯提前終止，造成4個保守區域的丟失，從而表現出粒型變長、變大的表型。根據這一單核苷酸差異設計了四引物PCR分子標記，利用該方法不僅可以有效鑒定水稻種質資源或育種群體中粒長基因GS3的不同基因型，同時也可以提高對粒長增效基因型GS3-TGS3-T的選擇效率，縮短育種周期、減少育種成本，加速長粒型優質、高產水稻的品種選育。
[0037]為充分公開本發明“一種鑒定水稻粒長基因GS3不同基因型的四引物分子標記方法”，以下結合方法驗證和實施實例加以說明。其具體實施步驟如下:
[0038](一)試驗材料
[0039]來源于天鵝谷///9520// (72-496/御糯)雜交后代，長、大粒粳稻品系TD70(粒長13.70 ±0.1Omm,千粒重80.75 ±2.35g)；短、小粒印度秈稻品種Kasalath，粒長8.09±0.06mm,千粒重 20.25±0.12g)以及來源于 TD70/Kasalath240 個株系(F8 世代)構成的重組自交系群體。
[0040]6個常規粳稻品種:武粳13 (江蘇常州武進稻麥育種場)、日本晴(日本愛知縣農試場)、蘇御糯(江蘇太湖地區農家品種)、桂朝糯(揚州大學農學院)、南粳44 (江蘇省農業科學院糧食作物研究所)和武運粳23 (江蘇常州武進水稻研究所)；
[0041]9個常規秈稻材料:揚稻6號(江蘇里下河地區農業科學研究所)、明恢63 (福建三明農業科學研究所)、珍汕97 (浙江溫州農業科學研究所)、桂朝2號(廣西農業科學院)、龍特甫(福建漳州農業科學研究所)、蜀恢527 (四川農業大學水稻研究所)、蜀恢158 (四川農業大學水稻研究所)、華占(中國水稻所)和南京11 (江蘇省農業科學院糧食作物研究所)。
[0042]以上材料均為公知公用材料，江蘇省農業種質資源中期庫可免費提供。具體參考文獻為:張亞東等，中國水稻科學，2013，27(2):122-128;錢金敖等，江蘇農業科學，2005，4:305;蔣云洪等，山東農業科學，1981,2:28-29;吳競倫等，江蘇農業科學，1992,3:6-8;王飛華，揚州大學碩士論文，2009，23;王才林等，中國稻米，2007，13⑵:33-34;王志明等，中國種業，2011，5:75;戴正元等，江蘇農業科學，1997,4:13-14;吳方喜等，福建農業學報，2011，26 (6): 1101-1112;陳建明等，種子，2002，3:50-51;林世成，閔紹楷，中國水稻品種及其系譜.上海:上海科學技術出版社.1991:312;高明亮等，雜交水稻，2001，16⑵:5_6;王玉平等，雜交水稻，2004，19(4):12-14;吳先軍等，中國種業，2007，10:70;禹盛苗等，雜交水稻，2009，24(6):42-44;林世成，閔紹楷，中國水稻品種及其系譜.上海:上海科學技術出版社.1991:318。
[0043](二)粒長基因GS3分子標記的開發
[0044](I)長、大粒水稻種質資源的篩選
[0045]通過對江蘇省農業種質資源中期庫低溫保藏的3000余份水稻種質資源進行粒型性狀的鑒定、分析，從中篩選到1份來源于天鵝谷///9520// (72-496/御糯)雜交后代，長、大粒粳稻穩定品系TD70。通過連續多年粒型表型測定，TD70粒長13.70±0.10mm，千粒重80.75±2.35g，短、小粒印度秈稻品種 Kasalath 粒長 8.09±0.06mm，千粒重 20.25±0.12g,
兩者差異非常顯著(圖1)。
[0046](2) TD70/Kasalath重組自交系粒長基因的QTL定位研究
[0047]利用長、大粒水稻品系TD70與短、小粒秈稻品種Kasalath雜交，經單粒傳法構建了包含240個株系的重組自交系群體，利用141個在親本間存在多態性差異的微衛星標記繪制了該群體的分子連鎖圖譜，以粒長測定值為試驗數據，利用QTL IciMapping3.1軟件，以LOD值2.5作為閾值，采用完備區間作圖法在全基因組范圍內進行掃描，檢測粒長性狀QTL位點，在水稻第3染色體上定位到I個主效粒長QTL-qGL3_l。分析TD70和KasalathQGL3-1的基因序列，發現它們之間存在多處堿基差異。其中第2外顯子上存在一個單核苷酸C-A的替換，使蛋白翻譯提前終止，進而使TD70粒型變長、變大，因此確定qGL3_l就是已報道的粒長基因GS3。
`[0048](3)標記的引物設計
[0049]根據TD70和Kasalath在GS3位點第2外顯子165位核苷酸處存在C到A的單堿基變異，從NCBI網站下載已公布的GS3基因組BAC克隆序列(序列號為:DQ355997)，設計了四引物PCR分子標記(圖2)，其引物序列為:
[0050]正向外引物GS3-0-F 序列:5’ -CCTCAGACATCACCTGAAAAGTTGACAGGC-3’
[0051]反向外引物GS3-0-R 序列:5’ -CGGTCAAAGTTCATGATCAAAAACTGGGG-3’
[0052]正向內引物GS3-1-F 序列:5’ -TCCACGCTGCCTCCAGATGCCGA-3’
[0053]反向內引物GS3-1-R 序列:5’ -AGAAACAGCAGGCTGGCTTACTCTTTG-3’
[0054](二)分子標記分析
[0055]( I)水稻品種基因組DNA的提取
[0056]水稻品種基因組DNA 的提取(SDS 法)，參照 Dellaporta S L, et al., Plant MolBiol R印，1983，1 (1): 19221。具體步驟為:取水稻苗期葉片，在_20°C預冷的研缽中用液氮研磨并裝入 1.5mL 離心管；加入 600uL 提取液(20%SDS，IMTris-HCl, 0.5MEDTA, 5MNaCl,65°C預熱)，搖勻，65°C溫浴30min，中間振蕩3~4次；加入1/4體積5MKAC，搖勻后置冰上30min ;加入氯仿-異戊醇(24:1)300~400uL，在搖床上充分振蕩，120rpm，30min ；8000~1000Orpm離心15分鐘，液面分層，下層顏色較深，上層微帶黃綠色，取上清(400uL左右)至另一離心管；加入等體積氯仿-異戍醇(24:1),搖床上充分振蕩,80~90rpm,30min ；8000rpm離心15分鐘，轉移上清(400uL左右)至新的離心管；加入2倍體積_20°C預冷的無水乙醇，輕輕搖勻直到有絮狀物產生，12000rpm離心6min ;棄無水乙醇，加入4°C 70%乙醇，放置lOmin，棄上清，超凈工作臺上風干Ih ;加入100~200uLTE，-20°C保存。
[0057]( 2 )分子標記的擴增和電泳檢測
[0058]GS3基因四引物PCR分子標記的引物序列為:
[0059]正向外引物GS3-0-F 序列:5’ -CCTCAGACATCACCTGAAAAGTTGACAGGC-3’
[0060]反向外引物GS3-0-R 序列:5’ -CGGTCAAAGTTCATGATCAAAAACTGGGG-3’
[0061]正向內引物GS3-1-F 序列:5’ -TCCACGCTGCCTCCAGATGCCGA-3’
[0062]反向內引物GS3-1-R 序列:5’ -AGAAACAGCAGGCTGGCTTACTCTTTG-3’，
[0063]將所述四條分子標記引物GS3-0-F、GS3-0-R、GS3-1-F和GS3q_I_R加入同一 PCR反應體系，對不同水稻品種和TD70/Kasalath重組自交系群體各株系的DNA進行PCR擴增；
[0064]20 μ L PCR 反應體系包括:20ng/y L 的 DNA2.Ομ L，4nmol/L 的引物 2.Ομ L，其中引物 GS3-0-F、GS3-0-R、GS3-1-F 和 GS3-1-R 各 0.5 μ L，含 25mmol/L MgCl2 的 10 X PCRBuffer2.0 μ L，2.5mmol/L 的 dNTP0.4 μ L, 2U/ μ L 的 Taq0.5 μ L 和 ddH2013.1 μ L ；
[0065]PCR反應程序包括:94°C預變性5min ;然后94°C變性30s、63.4°C復性30s、72°C延伸lmin，循環33次；然后72°C延伸IOmin后，將擴增產物加上樣緩沖液終止反應；反應產物在質量比濃度為2.0%的瓊脂糖凝膠上100V電泳50min，經DuRed核酸染色并于凝膠成像系統下觀察，記載。
[0066](四)本發明四引物PCR分子標記對`不同水稻品種GS3基因型的檢測
[0067]以長、大粒品系TD70和短、小粒品種Kasalath為對照，對6個粳稻品種武粳13、日本晴、蘇御糯、桂朝糯、南粳44、武運粳23以及9個秈稻品種9311、明恢63、珍汕97、桂朝2號、龍特甫、蜀恢527、蜀恢158、華占、南京11的DNA進行GS3基因型的檢測。四引物PCR擴增產物經2.0%的瓊脂糖凝膠電泳可顯示兩種類型的條帶。其中被外引物GS3-0-F和GS3-0-R擴增的270bp的條帶在每個DNA樣品中均出現，它不僅起陽性對照的作用(檢測DNA能否得到有效擴增)，同時也可以有效降低非特異PCR產物的擴增以及引物二聚體的形成。除270bp的共有條帶外，粳稻品種蘇御糯和秈稻品種9311、明恢63、蜀恢527、蜀恢158、華占還能擴增出一條約145bp的特征條帶,該條帶是由正向外引物GS3-0-F和反向內引物GS3-1-R擴增產生的，它擴增的是GS3位點第2外顯子165位核苷酸處堿基序列為A的等位位點(即長、大粒品系TD70基因型，GS3-TGS3」)，而其它粳稻品種武粳13、日本晴、桂朝糯、南粳44、武運粳23和秈稻品種珍汕97、桂朝2號、龍特甫、南京11則能擴增出除270bp以外的一條175bp的特征條帶，該條帶是正向內引物GS3-1-F和反向外引物GS3-0-R擴增產生的，它擴增的是GS3位點第2外顯子165位核苷酸處堿基序列為C的等位位點(即短、小粒品種 Kasalath 基因型，GS3_KGS3_K)(圖 3)。
[0068]為驗證四引物PCR分子標記對粒長基因GS3單堿基變異位點檢測的準確性，成熟后對上述水稻材料進行粒長性狀的測量。結果表明，與TD70帶型相同的品種多為秈稻品種，粒長變異范圍在9.67-11.90mm之間，屬長粒型品種，而與Kasalath帶型相同的品種多為粳稻品種且粒長變異范圍在7.24-8.76之間，屬短粒型品種(表1)。
[0069]表1不同秈、粳稻品種GS3基因型和粒長表型值
[0070]
【權利要求】
1.一種鑒定水稻粒長基因CM不同基因型的四引物分子標記方法，其特征在于: 用^53基因特異性引物: 正向外引物 GSJ-O-F 序列 5’ -CCTCAGACATCACCTGAAAAGTTGACAGGC-3’ 反向外引物 GSJ-O-R 序列 5’ -CGGTCAAAGTTCATGATCAAAAACTGGGG-3’ 正向內引物仍1-F 序列 5’-TCCACGCTGCCTCCAGATGCCGA-3’ 反向內引物仍1-R 序列 5’-AGAAACAGCAGGCTGGCTTACTCTTTG-3’ 擴增水稻基因組DNA，如果同時含有270 bp和145 bp兩條特征條帶，則為含粒長基因型GS3-TGS3-T的純合體；如果同時含有270 bp和175 bp兩條特征條帶，則為含粒長基因型GS3-KGS3-K的純合體，如果同時存在270 bp、175 bp和145 bp三條特征條帶，則為含粒長基因型GS3-TGS3-K的雜合體。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于: (1)水稻植株基因組DNA的提取； (2)將權利要求1所述的四條分子標記引物GSJ-O-FWM-OKSJ-1-F和MJ-1-R加入同一 PCR反應體系，并對水稻種質資源或育種群體植株的DNA進行擴增；，20 μ L PCR反應體系包括:20 ng/yL的 DNA 2.0 yL,4 nmol/ L的引物2.0 μ L:其中引物仍’J-0-F、仍’J-0-R、仍’J-1-F 和仍’J-1-R 各 0.5 yL，含 25 mmol/L MgCl2 的 10XPCRBuffer 2.0 μ L,2.5 mmol/L 的 dNTP 0.4 μ L,2 U/μ L 的 7^0.5 μ I^PddH2O 13.1 μ L ；PCR反應程序包括:94 °C 預變性5 min ;然后94°C變性30s、63.4°C復性30s、72°C延伸lmin，循環33次；然后72°C 延伸10 min后，將擴增產物加入上樣緩沖液終止反應； (3)反應產物在質量比濃度為2.0%的瓊脂糖凝膠上100V電泳50 min,經DuRed核酸染色并于凝膠成像系統下觀察，記載。
【文檔編號】C12N15/11GK103882146SQ201410151637
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月15日 優先權日:2014年4月15日
【發明者】陳濤, 姚姝, 丁丹, 鄭佳, 王才林, 張亞東, 朱鎮, 趙慶勇, 周麗慧, 趙凌, 于新, 趙春芳 申請人:江蘇省農業科學院